caractérisation biochimique L’identification des bactéries se fait grâce à plusieurs étapes:
◦ La caractérisation morphologique (voir TP3):
Par l’observation à l’œil nu des caractères macroscopiques des colonies bactériennes Par l’observation microscopique à l’état frais ou fixé (frottis) après coloration des cellules bactériennes
◦ La caractérisation métabolique ou biochimique
◦ La caractérisation moléculaire (elle ne sera pas traitée pendant ce
TP) Elle se fait par une première étape qui est l’étude du métabolisme respiratoire : Elle permet d’orienter l’identification vers un groupe bactérien (ex: bactéries aérobies strictes, anaérobies strictes,…; bactéries gram+ ou gram-; une famille de bactéries).
Cette première étape est ensuite suivi de l’étude du métabolisme
des glucides, des protides, des lipides et des acides nucléiques. Détermination du type respiratoire: Il existe 5 types respiratoires en fonction du rapport des bactéries à l’O2: 1/ aérobies strictes; 2/ anaérobies strictes; 3/ aéro-anaérobies facultatives; 4/ microaérophiles; 5/ anaérobies aéro-tolérantes. Le milieu viande-foie (VF) glucosé, à 0,6% d’agar est une gélose profonde spécialement étudiée pour déterminer le type respiratoire des bactéries. L’ensemencement se fait par une piqûre centrale (voir TP2: techniques d’ensemencement). Après incubation à 37°C pendant 24 heures, les résultats suivants sont observés en fonction du type respiratoire: 1/ Bactéries aérobies strictes ou AS (ex: Nocardia, Pseudomonas, Bacillus): Ne peuvent se développer qu'en présence de l’O2 de l'air, qui est accepteur final d'électrons dans la chaine respiratoire. Elles produisent donc de l’énergie par voie respiratoire.
2/ Bactéries anaérobies strictes ou ANS (ex: Bacteroides, Clostridium):
Ne se développent qu’en l’absence totale d’O2, nocif pour elles. La raison est qu’elles sont incapables de produire des enzymes telles que la catalase et/ou la superoxyde dismutase (SOD) qui détoxifient respectivement le H2O2 et les anions superoxydes (O2∙-), entités toxiques produites inévitablement pendant la respiration. Elles produisent donc de l’énergie par voie fermentaire.
3/ Bactéries aéro-anaérobies facultatives ou AAF (ex: Entérobactéries):
L'O2 ne leur est pas indispensable mais la croissance est meilleure en sa présence. Elles produisent donc de l’énergie par voie respiratoire, ou fermentaire si nécessaire.
4/ Bactéries microaérophiles ou MA (ex: Campylobacter, Helicobacter):
Ces bactéries se développent en présence de concentrations réduites en O2 (2 à 10% contre 21% dans l’air).
5/ Bactéries anaérobies aéro-tolérantes ou AAT:
Capables de se développer en présence ou en l'absence d‘O2. Elles produisent donc de l’énergie par voies respiratoire et fermentaire. Recherche des enzymes respiratoires:
• Test oxydase: Les oxydases ou cytochrome-oxydases (enzymes du complexe IV, de la chaine respiratoire) catalysent la réduction de l’O2. La recherche de ces enzymes est un test qui permet d’orienter l'identification vers les bactéries à Gram-.
• Test catalase: La catalase est une enzyme qui catalyse :
Le peroxyde d'hydrogène produit pendant le métabolisme aérobie doit être
éliminé, car c'est un poison cellulaire (il est d'ailleurs utilisé comme antiseptique). Cette enzyme est produite par la plupart des bactéries à métabolisme respiratoire et à Gram+. L’identification du genre et de l’espèce d’une souche bactérienne se poursuit par la recherche d’enzymes impliquées dans le métabolisme des glucides, protides, lipides et des acides nucléiques ou la détermination de la capacité à utiliser certains substrats. Elle se fait par l’ensemencement puis l’incubation d’une galerie d'identification qui se présente sous la forme: - soit d’un ensemble de milieux de culture sélectifs en tubes ou en boîtes qui constitue chacun un test biochimique qui permettra la mise en évidence d’un caractère phénotypique spécifique (=macro-galerie ou macro-méthode) - soit d’un système miniaturisé (= micro-galerie ou micro-méthode)
ou Par exemple : La caractérisation morphologique et l’étude du métabolisme respiratoire donnent le phénotype suivant: bacilles Gram-, AAF et oxydase-. Une galerie d’identification pour les enterobacteriacae peut être choisie pour l’identification du genre et de l’espèce .
AS AAF L’incubation des milieux constituant la macro-galerie choisi conduit souvent à un changement de couleur du milieu. Par exemple: comme le catabolisme des sucres conduit à la formation d’acides organiques, les tests utilisés pour l’étude du métabolisme des glucides contiennent tous un indicateur de pH coloré qui vire au jaune quand le milieu s’acidifie (ex: rouge de phénol ou rouge neutre). Ainsi, un milieu mannitol, jaune au départ, deviendra rouge après incubation si la bactérie a identifier est mannitol+.
Pour d’autres tests, la réaction est visible grâce à la libération d’un
chromogène ou par ajout d’un réactif qui révèlera le phénotype. Les caractères phénotypiques collectés grâce à la macro-galerie sont utilisés pour identifier le genre voire l’espèce d’une bactérie donnée grâce à tableau dichotomique (approche dichotomique), dans lequel les caractères sont hiérarchisés pour permettre la lecture pas à pas qui conduisant à l’identification de la bactérie. Tableau dichotomique pour l’identification des entérobactéries Les caractères phénotypiques collectés grâce à la micro-galerie sont traités par un logiciel informatique (approche probabiliste) qui utilise une base de données dans laquelle est répertorié, pour chaque taxon et pour chaque caractère, la probabilité d’être positif.
Une notice est fournie avec chaque micro-galerie. Il suffit donc de suivre les recommandations du fournisseur pour la lecture du résultat.
