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But :
Le but de cet atelier se base à acquérir les notions de base du technique phage
display qui a permis d’obtenir de nombreux anticorps monoclonaux et s’est avérée
particulièrement intéressante dans le cas d’anticorps humains pour lesquels les
hybridomes sont techniquement et éthiquement difficiles à obtenir.

Principe :
Le Phage display est une technique de laboratoire permettant d'étudier les
interactions entre protéines, peptides et ADN en utilisant des bactériophages pour
relier les protéines aux gènes qui les codent.

Le Phage display a d'abord été décrit par George P. Smith en 1985, quand il a fait
la démonstration de l'affichage de peptides à la surface d'un phage filamenteux grâce
à la fusion du peptide d'intérêt avec le gène III du phage. Un brevet appartenant à
George Pieczenik antérieur à 1985 décrit également la génération de bibliothèques
de phage display. Cette technologie a par la suite été perfectionnée par des équipes
du MRC Laboratory of Molecular Biology de Cambridge, comprenant Winter et
McCafferty, ainsi que par le Scripps Research Institute, rendant possible l'affichage
de protéines telles que des anticorps à usage thérapeutique. En faisant la connexion
entre le génotype et le phénotype, cette technique permet de screener et amplifier de
vastes bibliothèques de fragments de protéines dans un processus appelé
« sélection in vitro », qui est analogue à la sélection naturelle. Les bactériophages les
plus souvent utilisés pour le phage display sont le bactériophage M13 et le phage
filamenteux fd bien que les phages T4 , T7 et λ aient aussi été utilisés.

Mode opératoire :
La production des VHH anti HER3 se divise en 6 principales étapes :

1. Immunisation et PCR

• Immunisation de l’animal qui est un lapin albinos

• Collecte des lymphocytes B par gradient de Percoll

• Extraction d’ARNm et réalisation d’une RT-PCR

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• Amplification de l’ADNc par PCR

2. Phage display : Présélection des VHHs spécifiques à HER3

Avant cette étape, il faut bien évidement récupérer les phages où on va obtenir un
culot de phages VHH+PBS :

• Insertion de la séquence de VHH dans un vecteur avec origine virale appelé


phagmide

• Introduction des phagmides par électroporation dans des bactéries TG1 qui ne
reconnaissent pas les codon stop de type opale TGA

• Mise en culture des bactéries en ajoutant le phage helper afin de favoriser


l’expression des virions

• Ajout de PEG + NaCl qui ont un rôle important dans l’alourdissement de poids
des phages

• Récupération des phages

Cette étape est sous forme de tour et chaque tour est diviser en plusieurs étapes,
sachant qu’il 3 à 4 tours pour obtenir les VHH spécifiques de la HER3 :

• Adsorption des protéines dans les puits des plaques (Puit1 cntrl : 200µl PBST –
Puit2: 20 µlHER3 + 180µl PBST )

Figure 1: Adsorption des proteines

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• Incubation pendant 30 minutes

• Lavage par PBST 3 à 5 fois afin d’éliminer l’excès

• Blocage par le lait 2% pour la saturation

• Lavage par PBST 3 à 5 fois

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• Mettre les phages ( 2.10 phages\ml = 100µl) dans le puit1 cntrl
et 100µl PBST dans le puit2

• Incubation pendant 30 minutes

• Récupération des phages du puit1cntrl et mise dans le puit2

• Incubation 30 minutes

• Lavage par le PBST 3 fois

Figure 2: Le PBST
• Lavage par un acide appelé TAE dont le rôle est l’élution des phages

• Incubation 10 minutes

• Récupération des phages spécifiques

3. Test ELISA

Cette étape nous permet de mettre en évidence de VHH spécifiques par réaction
immuno-enzymatique

Figure 3: Test ELISA


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4. Séquençage

Cette étape nous permet de déterminer la séquence représentative des VHH

5. Production des VHH : transformation bactérienne et purification

Transformation bactérienne

• Mélange de l’ADN de l’anticorps et des bactéries compétentes sur la glace

• Choc thermique à 42°C : l’ADN pénètre dans les bactéries

• Mettre 3 à 4 minutes dans la glace pour renfermer les pores

• Ajout de milieu nutritif aux bactéries mises en culture 1H

• Isolement sur une boite de pétrie (LB Agar+Ampicilline)

Figure 4:Etape d'isolement des bactéries sur boite de pétrie

Mise en culture des bactéries

• Ajout de glucose + IPTG au milieu de croissance des bactéries


• Incubation pendant toute la nuit à 28°C

Lyse bactérienne

• Centrifugation pour récupérer le culot où se trouvent les VHH


• Lyse des bactéries avec un tampon de lyse
• Eclatement des bactéries par ultrasons
• Centrifugation

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• Purification

Purification des anticorps

• Récupération de surnagent où se trouvent les VHH

• Mise en contact du surnageant et billes de nickel (agitation 1 heure)

Figure 5: Etape de récupération des VHH

Vérification de la production de VHH

Au cours de cette étape on réalise un gel SDS Page afin de visualiser la pureté
des fragments de VHH, ce gel permet de séparer des protéines grâce à leur poids
moléculaire . Sachant que la taille de VHH est entre 13 kD et 18 kD .

Figure 6: Etape d'électrophorèse

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Exemple de résultats obtenus
1 2 3 4

200

100

70

35

25

15

10

1 : On a obtenu un VHH de taille 15kD

2 : On a obtenu une bande de 30 kD , c’est le cas d’un VHH dimérisé

3 :On a obtenu deux bande l’une est de taille de 15 kD qui présente le VHH et l’aute
de taille 70 kD qui présente une autre proteine appelée Albumine qui vient de se fixer
sur les billes de Nickel utilisé dans la purification des VHH puisqu’elle a une affinité
au tag HIS-HIS-HIS d’où on peut faire une aute étape de purification

4 : On a obtenu une seule bande à 200kD qui s’agit d’une grosse proteine présente
dans l’extrait de levure de mileu du travail utilisé dans la production de grande
quantité de VHH appelé TB , qui a une affinité aux billes de Nickel d’où elle empeche
les VHH de se fixer sur ces billes d’où il faut changer la composition de milieu

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