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Méthodes de séparation et de purification des protéines

Introduction

I/ Les étapes de séparation et de purification

1-Extraction

A. Source des protéines

B. Techniques d’extraction

B.1.Etape préliminaire

B.2.Etape additive

2-Séparation et purification

A-Techniques chromatographiques

B-Techniques électrophorétiques

II/ Critères de pureté d’une protéine

III/ Elaboration d’un protocole de purification

IV/ Conclusion

Bibliographie

 
Introduction :

- La Purification d’une protéine consiste en l’élimination de toute substance exogène à la


protéine, tout en préservant l’intégrité structurale et fonctionnelle de celle-ci.
- En pratique, on doit adopter une stratégie fiable pour mener au mieux cette purification.

I- Les étapes de séparation et de purification :

1-Extraction :
C’est une étape importante, qui consiste en l’extraction de la protéine de son emplacement
d’origine et de la séparer des contaminants susceptibles de gêner la purification.

A .source des protéines :


Le choix de la source de protéine dépend de :
- la possibilité de se procurer facilement de quantités suffisantes du tissu .
- la concentration de la protéine dans ce tissu
- La concentration attendue
- Applications auxquelles est destinée cette protéine
On utilise des :
 Cellules pro ou eucaryotes susceptibles d’être cultivées :bactéries, levures, cellules végétales
ou animales.
 Organes ou tissus animaux, et végétaux.

B. Techniques d’extraction :
L’extraction se déroule généralement en deux étapes :

B.1.Etape préliminaire :
Consiste à soumettre le matériel biologique brut (tissus, cellules), à différents procédés
physiques ou chimiques afin d’éclater les cellules et libérer les protéines. 

B.1.1.Moyens physiques:

1. Choc osmotique et homogénéisation des tissus :


Les cellules sont soumises à un changement brutal de la pression osmotique, ce qui va
causer la rupture des parois de façon simple et douce.
Solvants utilisés : butanol 2% ,Tampon de faible pression osmotique

L’utilisation d’homogenéiseurs est indispensable pour libérer les protéines liées aux fractions
subcellulaires, ex:
 Dounce: le passage des cellules dans l’espace extrêmement petit entre le piston
et la paroi interne du tube entraine leur bris.
 Potter: ressemble au dounce.
 Système à billes en verre: le tourbillonnement des billes a un effet abrasif et
réduit les cellules en bouillie.
2. Choc par pression :
- Les cellules sont mises en contact avec de l’azote gazeux sous pression.
- Sous l’effet de la pression, l’azote se solubilise dans les liquides.
- Après abaissement de la pression, l’azote reprend son état gazeux, et fait éclater les cellules.
- Il lyse les cellules et préserve les organites.

3. Sonication :
C’est l’utilisation d’ultrasons pour rompre les membranes des cellules.
- Les ultrasons provoquent la croissance de bulles par un phénomène appelé
Cavitation, ces bulles se contractent et subissent une implosion induisant la destruction des
cellules.

4. Centrifugation différentielle :
- Une fois le lysat obtenu, il doit être filtré ou centrifugé.
- Si la protéine recherchée est un constituant subcellulaire: la centrifugation différentielle est
obligatoire : basée sur le principe qu’un organite soumis à une force centrifuge, sédimente à
une vitesse qui lui est propre, permettant ainsi son isolement .

R! il est impératif de tamponner le milieu à pH 7-8, et d’y ajouter des inhibiteurs de protéases
afin d’éviter la dégradation de la protéine suite à la libération d’enzymes protéolytiques.

Figure 4 : principe de la centrifugation différentielle

B.1.2.Moyens chimiques:

 Nombreux mais génèrent souvent des modifications de conformation.


 Détergents et solvants organiques: acétone, toluène, désoxycholate de Na , Triton X 100 .
 
B.2.Etape additive :

Consiste a débarrasser le mélange de protéines des petites molécules gênant la purification et


d’obtenir un nouveau milieu plus concentré.

B.2.1. Relargage :
- La plupart des protéines sont insolubles aux concentrations élevées en sels , cet effet est
appelé Relargage = Salting out
- Il est lié à la compétition pour les molécules d’eau entre les ions du sel et les protéines
- On utilise surtout le sulfate d’ammonium en solution saturée :4mol/l.
- Les zones de précipitation ne sont pas les mêmes pour toutes les protéines; ex:
o Fibrinogène : 0,8M / Sérum albumine : 2,4M
- La dialyse peut être utilisée pour éliminer le sel lorsque cela est nécessaire.

Mélange de protéines
dans un tampon:
A: précipite à [ ] sel = 15%
Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à
B: précipite à [ ]20%
sel = 25 %
Culot: protéine A
C: précipite à [ ]Centrifuge
sel = 35% pour récupérer les
Surnageant: protéines B + C
protéines précipitées
Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à
Culot: protéine B 30%
Centrifuge
Surnageant: protéinepour
C récupérer les
protéines précipitées

Figure 7 : Extraction d’une protéine par le « Salting out »

B.2.2.Dialyse :

- Les protéines peuvent être séparées des petites molécules par dialyse à travers une
membrane semi-perméable, tel qu’une membrane de cellulose pourvue de pores.
- Les molécules ayant des dimensions plus grandes que le diamètre des pores sont
retenues à l’intérieur du sac de dialyse,
- tandis que les plus petites molécules et les ions traversent les pores de la membrane
et apparaissent dans le dialysat à l’extérieur du sac.
Figure 8 : principe de la dialyse.

B.2.3.Lyophilisation :

- Une méthode e de dessiccation par sublimation de solutions, de suspensions, de tissus


animaux ou végétaux, préalablement congélés.
- une méthode surtout de concentration et de conservation.
- largement utilisée en industrie pharmaceutique et en biochimie.

B.2.4.Ultracentrifugation :

- Une méthode physique permettant de séparer les différentes classes de protéines dans un
mélange.
- Utile pour la séparation (la préparative) et l’analyse des protéines (masse, densité,
forme)
- Une ultracentrifugeuse: une machine tournant à vitesse élevée( plusieurs dizaines de
milliers de tours/min) développant au fond des rotors de grandes forces gravitationnelles .
1. ultracentrifugation de zone : selon le coefficient de sédimentation.
2. ultracentrifugation iso pycnique : selon un gradient de densité.

Centrifugation de ZONE

Figure 9 : différents types d’ultracentrifugation


2-Séparation et purification :

A-Techniques chromatographiques :

A.1 La chromatographie d'adsorption :


 Principe :

- L'adsorption est la fixation plus ou moins énergique d'un gaz, d'un liquide ou d'un soluté sur
une surface solide.
- l'adsorption doit être réversible. poour être utilisable à des fins séparatives.
- Elle met en jeu des liaisons à faible énergie : liaisons hydrogène, interactions électrostatiques.

- L'élution ou désorption consiste à extraire le soluté adsorbé à l'aide d'un solva nt appelé éluant.

- Les différents solutés sont plus ou moins adsorbés sur la phase stationnaire, et plus ou moins
solubles dans la phase mobile;
Il en résulte une migration différentielle des solutés en fonction de la résultante entre les deux
forces (de rétention et d'entraînement) et donc une séparation de ces solutés.

- L’adsorbant le plus utilisé est l’Hydroxyapatite ou le gel de phosphate tricalcique.


- Solvants :
On utilise généralement des mélanges de solvants, de polarité voisine de celle des solutés à
séparer
- Plus un composé est polaire, plus il sera fortement adsorbé sur les sites actifs de la phase
stationnaire et moins vite il se déplacera.
 Applications :
- Séparation des molécules organiques de MM 100 à 1000 g/mol et de polarité moyenne :
- les molécules apolaires sont pas ou peu retenues, et sont éluées les premières.

- Les molécules trop polaires risquent d'être adsorbées de façon irréversible, et ne sont donc pas éluées.

A.2 Chromatographie échangeuse d'ions:


 Principe de la séparation :

C’est une séparation selon la charge des protéines au pH de la chromatographie.


La charge dépend du point isoélectrique:
Charge +: pour pH< pHi
Charge 0 : pour pH= pHi
Charge - : pour pH > pHi
- Protéines non retenues : de charge identique à la phase stationnaire (support).
- Protéines retenues : elution par gradient en sel (élution selon le point isoélectrique).

On distingue principalement deux types selon la charge des groupements portés par la phase
stationnaire :
 Les échangeurs de cations, échangeurs sous forme anionique:
Une résine cationique portent des groupements chargée négativement.
 les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique
Une résine anionique portent des groupements chargée positivement.
.

 Applications: Séparation des molécules ionisables, quelle que soit leur taille :
- Acides aminés, peptides, protéines.
- Nucléotides, acides nucléiques.
- Glucides ionisés et lipides ionisés.

Une protéine chargée


négativement s’élue
directement
Figure 10 : Chromatographie échangeuse d'ions

A.3. La chromatographie de paires d'ions :

- Une paire d'ions est une entité formée par l'association de deux ions de charge opposée.

- La paire d'ions a donc une charge nette nulle et peut dans ce cas présenter des propriétés ±
hydrophobes permettant de l'analyser sur une colonne de chromatographie en phase inverse.
- Pour arriver à cette utilisation, on emploie des phases mobiles qui contiennent un détergent
anionique ou cationique.

- Ces détergents sont des molécules ionisées qui comportent des chaînes carbonées
hydrophobes (ex : tétrabutylammonium, laurylsulfonate,…) et forment avec les composés à
séparer des paires d'ions hydrophobes.

On peut dans ce mode chromatographique jouer sur un très grand nombre de paramètres :
 Nature et concentration du détergent
 PH et force ionique du tampon
 Température

Plus performants que les systèmes d'échange d'ions et ont des capacités plus grandes
(ils permettent d'injecter de plus grandes quantités d'échantillon sur une colonne de même
dimension).

: A.4- Chromatographie d'exclusion-diffusion ou filtration sur gel


Appelée aussi tamisage moléculaire réalisée sur un gel de dextrane (sephadex) sous forme de
billes poreuses.
Il en existe différents types en fonction de la taille des billes et de leur porosité.

 Principe:
C’est une séparation selon la masse moléculaire des protéines:

A - La phase stationnaire:
- La phase stationnaire est constituée de billes de gel pourvus de pores de diamètres variables,
permettant la diffusion des solutés de masses moléculaires déterminées.
- Les plus petites molécules sont plus retenues car elles peuvent pénétrer à l'intérieur des pores
car leur diamètre est inférieur à celui des pores du gel.
- Les grosses molécules ne sont pas retenues car elles ne peuvent pas pénétrer a l’intérieur des pores en
raison de leur grande taille; elles sont donc exclues du gel (d'où le nom de chromatographie d'exclusion).
- Une protéine de taille moyenne pénètre dans une partie des pores.

B -La phase mobile :


- Simple liquide qui passe à travers la phase =son rôle est d’assurer le déplacement linéaire des
solutés.

 Applications:

- Très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou de petites molécules dans les
solutions protéiques: dessalage, échange de tampons.
- Fractionnement de mélange de macromolécules
- La détermination (approximative) de la MM des protéines.
Figure 11 : Chromatographie d'exclusion-diffusion

A.5. Chromatographie d'affinité:


Principe:
- une phase stationnaire constituée d'un support macromoléculaire chimiquement inerte
(silice, polymère) sur lequel on a greffé une molécule organique particulière (effecteur)
qui présente une affinité biologique sélective pour certains constituants d'un mélange .
- Seule la protéine fixant le ligand sera retenue
- Trois types d'affinités sont utilisées:
 affinité enzyme-substrat
 affinité ligand-récepteur
 affinité antigène-anticorps.

o Très gros facteur de résolution.


o Nécessité de connaître la protéine.
o La chromatographie d'affinité s'utilise avec des colonnes à basses pression ou à haute
performance.

Exemples:
p-aminobenzamidine: pour la purification de la trypsine.

les protéines susceptibles de se fixer au


glucose sont déplacées par addition de
glucose
Figure12 : Chromatographie d'affinité.
A.6 -Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC):

- L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (phase mobile) dans une colonne très
efficace et résistante, remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie.
- Le débit d'écoulement de la phase mobile doit être élevé ce qui implique la nécessité des
pompes à haute pression pour pousser les solvants
- Ce débit élevé de la phase mobile diminue le temps nécessaire pour la séparation des composants
le long de la phase stationnaire.
- La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des
composants .
- Les pics obtenus sont plus étroits donc la résolution est améliorée , le seuil de détection est
également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond )
- La combinaison de ces caractéristiques - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation
« haute performance » : C.L.H.P. - ou HPLC en anglais.
- Elle est considérée actuellement comme la méthode de choix.

Figure 13 : schéma général d’une chaine HPLC

B-Techniques électrophorétiques :
B.1. SDS-PAGE : (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium)

- Séparation des protéines en fonction de leurs masses dans des conditions dénaturantes.
(dissolution préalable du mélange de protéines par SDS).
Le SDS (dodécylsulfate de sodium) est un détergent anionique, utilisé à forte concentration,
dénature les protéines globulaire en s’y fixant par interaction hydrophobes entre les carbones
de sa chaine (SDS) et les carbones des chaines latérales des résidus hydrophobes (protéines),
les charges négatives apportées par les sulfates se repoussent entre elle, conduisant la
destruction successive des structures quaternaires, tertiaire et secondaire.

- La charge globale de la protéine ne dépend plus de son pHi, mais de la longueur de sa chaine
polypeptidique (fixation d’un anion SDS sur deux résidus AA)
- Soumettre le complexe - SDS-protéine dénaturée - à une Electrophorèse,
- Visualiser les protéines par l’argent ou Bleu de Coomassie.
Donc, le seul facteur limitant est la longueur du polypeptide (la migration est inversement
proportionnel à la taille).
its (cm)
Distance migrée à partir d
Log Mr
Figure 14 : Résultats de la SDS PAGE

B.2.Isoélectrofocalisation :

- Séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique .


- les protéines focalisent dans une zone du gel ou le pH est égal à leur pHi.
Principe :

- Le principe de base de la focalisation isoélectrique (FIE) est de créer un gradient de pH dans


lequel le mélange de substances est soumis à une électrophorèse

- Le gradient de pH est d’abord formé dans le gel (polyacrylamide ou agarose) par électrophorèse


des molécules amphotères synthétiques (Ex : Ampholines) : on utilise un mélange de telles
molécules, possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme large, ex. 3-9, ou ± étroite, ex. 4-
5 ou 5-6,5).
- Les substances a séparés migrent dans le gel jusqu'à atteindre une zone où leur charge devient
nulle c a dire le pH est égal à son pHi. (pH=pHi)
- La Vitesse de migration d’une protéine dans un champs électrique est fonction de
l’intensité du champs électrique E , de la charge globale de la protéine Z et du coefficient
de friction f :
V = EZ/f
- Si pH= pHi : Z= 0 et donc v = 0
- C’est l’électrophorèse avec le plus grand pouvoir résolutif : peut séparer des
protéines dont DpHi = 0,01 (une unité de charge globale de différence).

pH du gel = pI des proteines


Figure 15 : Principe de l’Isoélectrofocalisation
Le gradient de pH est établi avant chargement de l’échantillon,
- la zone la plus acide se trouve vers l’anode (migration des anions acides).
- la zone la plus alcaline se trouve vers la cathode (migration des cations basiques).
L’IEF est très utilisée actuellement dans l’analyse protéomique (Critère de pureté).

B.3.Immunoélectrophorèse :

- une combinaison d’ électrophorèse dans un gel d'agarose, avec la réaction spécifique


Antigène-Anticorps.
- Dans un premier temps, les protéines sont séparées par électrophorèse grâce à leur
différence de mobilité dans un champ électrique.
- Dans un deuxième temps,on dispose dans une gouttière centrale , creusée
parallèlement au sens de migration, un immun sérum anti protéines humaines , on laisse
diffuser pendant 24h
- La diffusion donne des arcs de précipitation
- Chaque arc correspond à une fraction protéique particulière.

II/ Critères de pureté d’une protéine :

1-Critère de solubilité :

- La courbe de solubilité d’une protéine se compose de deux droites, au niveau de leur


angulation le point correspond à la saturation,
- si la protéine est pure, il y’a une seule angulation
- si la protéine est impure, les angulations seront multiples.
- Les protéines dont les points de saturation ne différent pas de plus de 5%, ne peuvent pas être
distinguées sur la courbe de solubilité.

Figure 17 : Diagramme de saturation

2-Critère d’ultracentrifugation :

Une protéine pure apparait dans le diagramme d’ultracentrifugation sous forme d’un pic
unique et symétrique.

Les impuretés apparaissent comme :

- Des pics distincts ;


- Un épaulement adjacent au pic principal ;
- Une simple dissymétrie du pic principal.
Les protéines dont le coefficient de sédimentation ne différent pas de plus de 2%, sédimentent
au même niveau.

3-Critère chromatographique :

Une protéine pure apparait sur le chromatogramme sous forme d’un pic unique, symétrique
et de base étroite.

Figure 18 : différents aspects de chromatogramme


A : base élargie, B :pic asymétrique, C : présence d’un épaulement,
D :pic étroit symetrique

4-Critère électrophorétique :

- L’Isoélectrofocalisation permet la séparation des protéines dont la différence du PHi est


inferieure à 1%.
- C’est l’électrophorèse avec le plus grand pouvoir résolutif 

 5-Critère immunologique :
- Une protéine pure apparait sous forme d’un arc unique et nette .
- Technique utilisée : immunoélectrophorèse ’IEP ‘.
- Ce critère repose sur la spécificité des réactions antigène-anticorps.

Figure 19 : évaluation de la pureté par l’IEP

6-Critère biologique :

Lorsque la protéine possède une activité biologique( hormonale ou enzymatique), on peut :


- Doser l’activité biologique et vérifier la superposition des diagrammes d’élution ou de
sédimentation avec ceux de même activité biologique.
- Calculer l’activité biologique spécifique et la comparer avec des produits de référence purs.

7-Critère chimique :

L’analyse des acides aminés permet de détecter la présence d’impuretés :


taux d ' AA(g)
= N mole
MM de la prot é ine(g/mole)

Pour une protéine pure, N est un nombre entier.


Dans le cas contraire, il y a présence d’impuretés protéiques.

III-Elaboration d’une stratégie de purification :

- Les techniques de purification sont nombreuses, de performances inégales.de plus, les


exigences de pureté varient en fonction du domaine d’application de la protéine.
- Il est alors indispensable d’élaborer une stratégie de purification adéquate pour mener
aux mieux cette purification pour cela il faut :
- Définir le degré de pureté souhaité.
- Définir les propriétés physico-chimiques du matériel biologique et de la protéine
(exp : thermo sensibilité : purification rapide)
- Caractériser les propriétés des contaminants afin de mieux les éliminer.
- Choisir les techniques de purification finales selon les propriétés des protéines
- Appliquer les critères de pureté sur le produit final afin de certifier la purification

- La purification d’une protéine peut etre divisée en 3 phases :

I. Phase initiale : extraction

1. objectif : isoler la protéine de son emplacement d’origine et de la séparer des contaminants


susceptibles de gêner la purification
Matériel biologique brut protéines + contaminants

2 .Techniques utilisées :

a-Libération des protéines intracellulaires ( cytoplasmiques ou subcellulaires ) par différentes


méthodes .
Méthodes douces : choc osmotique, lyse enzymatique .
Méthodes modérées : homogénéisateur mécanique –Potter-
Méthodes vigoureuses : choc par pression, ultrasons, billes de verre.

b-Une fois la protéine libérée, éliminer partiellement des contaminants par des méthodes
additives :
 précipitation par les sels
 dialyse ou ultrafiltration
 techniques chromatographiques, les plus utilisées sont : chromatographie d’exclusion et
chromatographie échangeuse d’ions.

II. Phase intermédiaire :

1. objectifs :
- éliminer la majeure partie des contaminants.
- Stabiliser et concentrer la protéine.
Protéines + contaminants protéines purifiées + traces de contaminants

2. Techniques utilisées :
Les méthodes chromatographiques :

- Chromatographie échangeuse d’ions


- Chromatographie de paires d’ions
- Chromatographie d’affinité

Un degré de pureté satisfaisant à la fin de cette phase , justifie l’arrêt de la purification.

III.Phase finale :

1. Objectifs :
- Eliminer toute trace de contaminants afin d’obtenir un produit final ayant un degré de
pureté le plus élevé possible .
- Donner un conditionnement final à la protéine.

2. Techniques utilisées : les plus résolutives :


 Techniques chromatographiques :
- Chromatographie échangeuse d’ions.
- Chromatographie de paires d’ions.
- Chromatographie en phase inverse.
- HPLC couplée à la spectrométrie de masse.
 Techniques électrophoretiques :
- SDS-PAGE
- Electrofocalisation couplée à la SDS-PAGE

R !
L’HPLC-SM et les techniques électrophoretiques permettent de vérifier le degré de pureté
d’une protéine, ainsi que sa quantité.
La conservation d’une protéine se fait sous forme lyophilisée.

IV/ Conclusion :