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Chapitre IV 

: Appareils et méthodes en hématologie

Chapitre IV
Appareils et méthodes en hématologie

I- Notions utiles d’hématologie :


L’hématologie est une science qui étudie la structure histologique, la composition
chimique et les propriétés physiques du sang. En médecine, l’hématologie est une spécialité
qui s’occupe des maladies du sang et des organes de l’hématopoïèse (moelle osseuse,
ganglions lymphatiques, rate). Le sang est composé de cellules qui sont : les globules rouges
ou hématies (érythrocytes), les globules blancs ou leucocytes et les plaquettes. Ainsi que d’un
liquide qui est le plasma (sérum). Le sérum est obtenu à la suite de la coagulation du sang
alors que le plasma est obtenu par centrifugation du sang. La mission des laboratoires
d’hématologie est :

- l’étude de l’hémostase (opérations de coagulation et de fibrinolyse du sang)


- la détermination du groupe sanguin
- le dosage de l’hémoglobine (pigment du GR) et la différenciation et le comptage des
cellules sanguines.

Les résultats de ces analyses représentent un moyen efficace pour le diagnostic de


plusieurs maladies (infection, anémie, hémophilie, leucémie,….)

I- 1- Cellules sanguines :

I- 1- 1- Les globules rouges :

Le globule rouge ou hématie est une cellule de taille uniforme de diamètre égale à 7-8
µn, dépourvue de noyau, de forme biconcave.
Les globules rouges contiennent l’hémoglobine qui assure le transport de l’oxygène des
poumons vers les cellules de l’organisme et le rejet du gaz carbonique de ces dernières vers les
poumons .
Chez l’homme, le nombre de globules rouges en moyenne est compris entre 4,5 et 6,5
10 /l ; chez la femme ce nombre est compris entre 3,8 et 5,8 1012/l.
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I- 1- 2- Les globules blancs :


Les globules blancs ou leucocytes sont des cellules sanguines dont le rôle est primordial dans
l’organisme car ils détruisent les microbes ou les corps nuisibles, par phagocytose. Chez un
adulte normal, le nombre moyen de globules blancs est compris entre 6 et 12 109/l. Il existe
trois types de globules blancs différenciés par leurs tailles et leurs formes.

a) Polynucléaires ou granulocytes : eux –mêmes classés en trois catégories :


 Polynucléaires neutrophiles (P.N) : ce sont des cellules arrondies mesurant 12
à 14µm, leur noyau est polylobé comprenant 3 à 5 segments réunis par des
ponds très minces de substance nucléaire, leur cytoplasme est légèrement
acidophile et contient de nombreuses granulations neutrophiles. A l’état
normal, le nombre de P.N est compris entre 1,8 et 7 109/l.

 Polynucléaires éosinophiles (P.E)  : ces cellules ont un diamètre ~14µm, elles


possèdent le plus souvent un noyau bilobé et de nombreuses granulations
cytoplasmiques sphériques (de 0,5 à 1,5µm de diamètre). Le nombre de P.E à
l’état physiologique est inférieur à 0,8 109/l.

 Polynucléaire basophiles (P.B) : Le noyau de ces cellules est bilobé, souvent


caché par de nombreuses granulations basophiles rondes ou ovales. Leur
nombre moyen varie entre 0,01 et 0,2 109/l

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b) Lymphocytes : Il y a plusieurs types de lymphocytes, selon leurs morphologies on


distingue :
 Le petit lymphocyte : cellule de 6 à 12µm de diamètre possédant un noyau
arrondi ou ovalaire, le cytoplasme est peu étendu et apparaît sous forme d’une
bande péri nucléaire claire ou basophile.
 Le grand lymphocyte : son diamètre est compris entre 9 et 15µm et possède un
noyau légèrement excentré.
 Le grand lymphocyte granuleux : ce globule est de diamètre compris entre 9 et
15µm, il a un cytoplasme abondant contenant des granulations. Chez l'adulte,
à l’état normal, le nombre de lymphocytes sanguins est de 1 à 4 109/l.

c) Monocytes : ce sont les plus grandes cellules circulantes (20 à 40µm de diamètre) ; elles
appartiennent au système phagocytaire mononuclée. Le noyau est arrondi ou ovalaire. Le
cytoplasme est étendu, contient parfois de fines granulations. A l’état normal, le nombre de
monocytes est entre 0.2 et 1 109/l.

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I- 1- 3- Les plaquettes ou thrombocytes :

Les plaquettes sont des petites cellules anucléées, arrondies ou ovalaires, de 2 à 5µm
de diamètre. Elles se présentent comme de petites masses de cytoplasme claires, légèrement
basophiles. Les plaquettes jouent un rôle important dans le mécanisme de la coagulation du
sang. Chez un adulte, leur nombre moyen est compris entre 150 et 450 109/l.

I-2- Phénomène de l’hémostase :

L’hémostase est l’ensemble des phénomènes physiques mis en jeu lors d’une plaie
vasculaire, dans le but d’arrêter le saignement. Ces phénomènes se décomposent en trois
étapes successives : l’hémostase primaire, la coagulation plasmatique, qui conduisent à la
formation du caillot, et la fibrinolyse qui dissout le caillot, une fois la réparation du vaisseau
achevée.

I- 2- 1- L’hémostase primaire et la coagulation :

L’hémostase primaire est la phase initiale de la formation du caillot, mettant en jeu


trois partenaires : le vaisseau, les plaquettes et les protéines plasmatiques. Lorsqu’un
vaisseau sanguin est lésé, il se contracte de façon réflexe (vasoconstriction) puis les
plaquettes adhèrent à la paroi interne du vaisseau. Ensuite ces plaquettes sont activées et
secrètent des enzymes et des médiateurs qui interviennent dans les réactions biochimiques
multiples. L’étape finale de ces réactions est celle de la transformation du fibrinogène
(protéine) plasmatique en substance protéique filamenteuse qui est la fibrine. Cette réaction
se produit sous l’effet d’une enzyme : la thrombine et en présence d’ions calcium. Elle
conduit à la coagulation. En effet, les molécules de fibrine forment un réseau qui piège les
plaquettes : c’est le caillot. La rétraction des fibres du réseau rend le caillot imperméable et
bloque la zone lésée du vaisseau (arrêt de l’hémorragie).
Le sang extrait du vaisseau sanguin se coagule spontanément en quelques minutes, la
formation du caillot aboutit à la séparation d’un liquide surnageant contenant les substances
solubles dans le sang, à l’exception de celles ayant participé à la formation du caillot. Ce
liquide est dit « sérum ». Pour éviter la coagulation du sang on ajoute à ce dernier des
anticoagulants (substances captant Ca2+) telle que l’héparine. La centrifugation du sang non
coagulé donne un précipité (globules, plaquettes,…..) et un liquide surnageant dit «  plasma ».

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I- 2- 2- La fibrinolyse :

Lorsque le vaisseau sanguin est réparé, la présence du caillot n’est plus utile. Ce dernier
est alors dissout, c’est la fibrinolyse. La fibrinolyse résulte de la formation d’une enzyme
protéolytique : la plasmine ; son rôle physiologique est de détruire les dépôts de fibrine qui ont
pu se former lors de la coagulation. Son précurseur est présent dans le sang, c’est le
plasminogène.
L’exploration de la coagulation et de la fibrinolyse représente un moyen efficace dans
le diagnostic des maladies relatives au phénomène de l’hémostase telle que l’hémophilie
(retard ou absence de la coagulation).

I-3- Détermination de l’hématocrite et des constantes érythrocytaires :

Connaissant le nombre d’hématies par mm3 (GR) (chez un homme :


4.5 10 /mm3<GR<6,5 106/mm3), on peut définir :
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- l’hématocrite « Ht » qui représente le volume occupé par les hématies dans une
quantité déterminée du sang total exprimée en pourcentage. La détermination de
l’hématocrite peut s’effectuer par centrifugation ou par des appareils automatiques.
L’hématocrite représente environ 45% de la masse sanguine.
- Le taux d’hémoglobine circulante « Hb » qui représente la teneur en gramme
d’hémoglobine dans un volume donné du sang. Dans un dl de sang (100ml) la quantité
d’hémoglobine est ~14g.
- Le volume globulaire moyen «VGM » : c’est le volume moyen d’une hématie :

Ht 0 , 45
VGM (µ 3 )= ≃
nombre d'hématies /µ 5 10 -3 /µ3
3

Chez l’adulte : 80µ3<VGM<100µ3


- La concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine « CCMH » : elle définit le
degré de saturation de l’hématie en hémoglobine

Hb( g/dl )
CCMH =
Ht
la valeur normale de CCMH est : 32 ± 3 %

- La teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine « TCMH » dans une hématie :

Hb( g /dl)
TCMH =
nombre d'hématies/dl

Chez un adulte, les valeurs normales de TCMH sont comprises entre 27 et 32 pg (1pg =
10-12g).
La connaissance de la numération sanguine (nombre des différentes cellules
sanguines) et des constantes érythrocytaires apporte des renseignements fondamentaux pour
le diagnostic de certaines maladies (anémie, leucémie).

I-4- Les systèmes du groupe sanguin :

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Les groupes sanguins sont constitués par des molécules membranaires présentes sur
les cellules du sang circulant. Ces molécules sont transmises génétiquement et sont désignées
par le nom : antigènes des groupes sanguins. Ces antigènes sont mis en évidence au
laboratoire, par une réaction antigène-anticorps (cette réaction aboutit presque toujours à une
agglutination des hématies).
Les groupes sanguins déterminés par des gènes sont regroupés en systèmes, dont nous
distinguons principalement le système ABO et le système Rhésus.

I- 4- 1- Système ABO :

Ce système a été découvert en 1900 par Landsteiner (Biologiste autrichien, Prix Nobel
1930) à la suite de l’observation suivante : le sérum de certains sujets agglutinait les
hématies d’autres sujets. Ainsi, deux antigènes ont été identifiés et ont été appelés A et B, les
hématies non agglutinées par les deux anticorps correspondants sont appelées O.
Ainsi, les phénotypes ABO, sont définis par des antigènes A et B situés sur la
membrane érythrocytaire, et les anticorps anti-A et anti-B présents dans le plasma sanguin.
Les antigènes A et B définissent quatre groupes du système ABO :
- groupes A, si l’antigène A est présent sur les globules rouges (anticorps anti-B dans
le plasma)
- groupes B, si l’antigène B est présent sur les globules rouges (anticorps anti-A dans
le plasma)
- groupe AB, si les antigènes A et B sont tous les deux présents sur les hématies (pas
d’anticorps anti-A et anti-B)
- groupe O, si aucun des antigènes A ou B n’est présent. Les sujets du groupe O
possèdent par contre une grande quantité d’antigène H, ils possèdent aussi des anticorps
anti-A et anti-B.

Remarques : - le groupe sanguin A se subdivise en deux sous-groupes : A1 et A2,


- lors d’une transfusion sanguine, il est primordial de définir le groupe
sanguin du donneur et du receveur.

I- 4- 2- Le système Rhésus :

Le système Rhésus est aussi d’un intérêt capital en transfusion sanguine et en


obstétrique. Ce système est défini par la présence sur les hématies d’une mosaïque de
plusieurs antigènes. Les cinq principaux antigènes sont notés par D,C,c,E et e, les autres
n’ont pas d’intérêt en transfusion sanguine. Les sujets ayant sur les hématies l’antigène D sont
mentionnés par le groupe : Rhésus positif « Rh+ » (qui se rajoute au groupe du système ABO).
Les sujets ne possédant pas cet antigène sont mentionnés par le groupe Rhésus négatif « Rh- ».
Les accidents transfusionnels sont principalement dus à l’existence d’un anticorps
anti-D. Les agglutinines immunes anti-E, anti-C et Anti-c sont souvent en cause dans les
accidents d’incompatibilité fœto-maternelle.

II- Exploration de l’hémostase : Principes et Techniques

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II-1- Principe des méthodes d’exploration :

Nous distinguons deux types de méthodes d’exploration de l’hémostase des méthodes


générales dont l’objectif est d’orienter le diagnostic ou de guider un traitement, et des
méthodes analytiques dont le rôle est d’aboutir à un diagnostic plus précis.
Ces méthodes permettent d’analyser s’il y a une anomalie de la coagulation ou de la
fibrinolyse. Ce sont généralement des méthodes qui mesurent le temps écoulé entre la mise en
route de la réaction et la mise en évidence de son résultat, par coagulation (caillot) ou par
liquéfaction de l’échantillon. Différents types de tests permettent d’étudier le processus de
coagulation.

 Temps de saignements « Ts » : c’est le seul test effectué in vivo. Il explore


l’adhésion et l’agrégation plaquettaire. Plusieurs méthodes existent pour la mesure de
« Ts », la méthode la plus sensible et la plus reproductible est celle d’Ivy qui mesure le
temps de coagulation en trois points de piqûres faites à l’avant-bras à l’aide d’un
vaccinostyle. La quantification de ce test peut être effectuée en mesurant le volume du
sang écoulé. A l’état normal Ts<8mm, et le volume du sang écoulé <100µl.

 Temps de coagulation : il consiste à mesurer la durée entre le prélèvement du sang et


sa prise en masse dans un tube à hémolyse. Dans l’état normal, ce temps et entre 8 et
10 min.

 Temps de recalcification plasmatique : dit aussi temps de Howell, cette méthode


consiste à réintroduire, dans un sang décalcifié, un sel de calcium, et à mesurer le
temps d’apparition du caillot.

 Temps de céphaline activé (T.C.A) : il correspond à la mesure du temps de


recalcification d’un plasma dépourvu de ses plaquettes, en présence d’un substitut
plaquettaire (céphaline) et d’un activateur (silice). C’est un test semi analytique de
coagulabilité le plus sensible. La valeur normale de T.C.A est entre 30 et 40s selon le
réactif choisi.

 Temps de Quick « TQ » : ou taux prothrombine (substance présente dans le sang


participant à la coagulation) , c’est le temps de coagulation du plasma en présence
d’ion calcium et de fer et de facteur tissulaire ou thromboplastine le TQ explore
également la fibrino-formation, cette dernière étape de la coagulation est explorée plus
directement par le temps de thrombine . Le TQ normal est compris entre 11 et 13s, il
s’exprime le plus souvent en % d’activité ou taux de prothrombine (TP). La
conversion du TQ en TP s’effectue à l’aide d’une droite d’étalonnage.

 Temps de thrombine (TT) : Ce test mesure le temps de coagulation d’un plasma en


présence de thrombine et explore globalement la fibrino-formation. La durée de TT est
~20s. D’autres méthodes sont aussi utilisées pour l’analyse et l’exploration de la
coagulation, telles que la numération des plaquettes ou le dosage des protéines
participant à la coagulation (fibrinogène par exemple). Dans le cas de l’étude de la
fibrinolyse, il existe aussi plusieurs test générant adaptés pour la mise en évidence des
anomalies de ce processus.

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 Test de Von Kaulla : on temps de lyse des euglobulines, c’est le test le plus
couramment utilisé, il explore l’effet global des activateurs de la fibrinolyse (plasmine
par exemple) toute éliminant les inhibiteurs par précipitation en milieu acide). Le
temps de dissolution du caillot est normalement supérieur à 3h.

 La méthode des plaques de fibrine d’Astrup : Elle permet la détermination semi-


quantitative des activateurs de la plasmine, son principe consiste à évaluer la surface
de lyse (sur un gel de fibrine) induite par une solution d’euglobuline ou de plasma.
D’autres méthodes permettent aussi l’exploration de la fibrinolyse tel que le dosage du
plasminogène qui est l’élément précurseur de l’enzyme « plasmine » responsable de la
dissolution du caillot de fibrine.

II- 2- Appareils réalisant les techniques d’exploration de l’hémostase :

Il existe plusieurs appareils permettant d’effectuer l’analyse de l’hémostase. Parmi ces


appareils, nous distinguons plus particulièrement celles qui mesurent le temps de
formation du caillot. Elles transposent les techniques manuelles courantes de mesure de la
coagulation. Le temps mesuré par l’instrument est celui qui s’écoule entre l’introduction
du réactif et l’apparition du caillot.

Les appareils proposés sur le marché sont classés selon la méthode utilisée pour la
détection de la coagulation. Les méthodes utilisées sont : la variation de l’impédance, la
viscosimétrie ou encore l’absorption lumineuse.

II-2 – 1- Mesure d’impédance :

Le principe des appareils utilisant la méthode de mesure d’impédance est le suivant :


Dans l’échantillon du sang à analyser sont prolongées deux électrodes, une électrode fixe
et l’autre mobile. Cette dernière a la forme d’un crochet, ce qui lui permet de retenir les
premiers éléments du réseau de fibrine formé (début de la coagulation). Cette formation
modifie brusquement l’impédance du circuit et fait stopper le chronomètre, permettant
ainsi d’évaluer le temps de formation du caillot. Les appareils utilisés pour ces mesures
sont dits des fibromètres ou des coagulomètres. Ils comprennent un bloc de préchauffage
(37°), une piquette électrique et un ensemble automatique de mesure d’impédance et de
comptage et d’affichage du temps écoulé. Les appareils peuvent aussi disposer de
plusieurs postes de mesure.

II- 2- 1- La viscosimétrie :

Un grand nombre d’appareils utilisent l’accroissement de la viscosité de l’échantillon


du sang ou de plasma sanguin, qui accompagne la formation du caillot . Le principe de la
plupart des appareils utilisant cette méthode est le suivant : dans le tube de mesure qui
contient l’échantillon à analyser, et soumis à un mouvement d’agitation, est placée une
bille d’acier ou un barreau magnétique. Ces derniers sont en mouvement à l’intérieur du
tube. Ils s’immobilisent par la suite dans le caillot. Ce qui permet ainsi de mesurer la
durée de coagulation, (la bille est immobilisée sous l’effet de l’augmentation de viscosité
du milieu lors de l’apparition du caillot). L’immobilisation de la bille ou du barreau est
rendue visible grâce à éclairage latéral.

II- 2- 3- Absorption lumineuse

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C’est une méthode basée sur la photométrie des milieux troubles. En effet, lorsqu’on
éclaire un échantillon de sang (ou de plasma) avec un faisceau incident d’intensité I 0, avant la
coagulation de l’échantillon, l’intensité de la lumière transmise par ce dernier dans la même
direction du faisceau incident est I1, alors qu’au début de la coagulation, l’intensité transmise
I2 avec I2<I1, car une grande partie du faisceau incident est diffusée par les premiers éléments
du réseau de fibrine qui apparaissent eu moment de la coagulation un photomètre (ou
spectrophotomètre) appropriés permet donc de déceler le déclenchement de la coagulation. La
figure (V-1) présente un analyseur semi-automatique permettant de mesurer le temps de
coagulation (RA-50 chemistry system ; Bayer).

III- Détermination de la formule sanguine


Comme nous l’avons mentionné au paragraphe I de ce chapitre, le sang est constitué
de plusieurs types de cellules : les globules rouges « GR », les globules blancs « GB »
(repartis aussi en plusieurs types de cellules différenciées par leurs lentilles et leurs propriétés)
et les plaquettes « Pt ». La connaissance des proportions de ces cellules apporte des
informations capitales pour le diagnostic et le traitement de plusieurs maladies (homéopathies
et autres).
Il existe dans le commerce des automates performants, capables de donner la formule
sanguine totale, à savoir : le nombre de GR le nombre des différents types de GB, le nombre
de plaquettes, ainsi que la détermination des constances érythrocytaires. Ces automates
exploitent des principes électroniques et optiques ingénieux pour la reconnaissance de forme
des cellules.

III- 1- Méthodes électroniques : Technique Coulter

III- 1- 1- Principe

La technique Coulter est basée sur la conductivité électrique (variation de l’impédance


électrique). En effet, dans un Godet contenant l’échantillon du sang dilué à analyser, immerge
une électrode en platine reliée à la masse d’un générateur de tension continue. Un tube rempli
de la solution du diluant et contenant une seconde électrode reliée à l’alimentation du
générateur (= 300 V), immerge aussi dans l’échantillon du sang. Ce tube est muni d’un orifice
micrométrique (figure V-1), la taille de cet orifice est liée à la dimension des particules à
analyser (de 60 à 100µm environ). Le sang dilué est aspiré à travers l’orifice du tube à l’aide
d’une pompe à vide (P ~ 6mm Hz). Au passage de chaque cellule sanguine à travers l’orifice,
il y a une variation de la tension due à la résistance de la cellule au passage du courant,
comparée à celle du diluant. Cette variation de tension est marquée par la manifestation d’une
impulsion dont l’amplitude est proportionnelle à la taille de la cellule. En effet la formule de
v
R=k
la variation de la résistance de l’orifice est donnée par : V
ou, R : résistance ; k est
une constante des systèmes, v : volume de la cellule, V : volume du conduit de l’orifice.
Le nombre d’impulsions ainsi provoquées, ayant une amplitude donnée, est égal au
nombre de cellules sanguines correspondant à cette amplitude on obtient ainsi le nombre de
chaque type de cellules sanguines par unité de volume.

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Chapitre IV : Appareils et méthodes en hématologie

Temps

Figure (V-1) : Principe de numération des globules sanguins par la méthode de variation
d’impédance (Coulter)

III- 1- 2 Exemple de mode opératoire

A l’intérieur du godet contenant l’échantillon à analyser est placé le tube à orifice. Ce


dernier est connecté à une pompe à vide permettant d’aspirer l’échantillon du sang dilué à
travers l’orifice. Les électrodes contenues dans le godet et dans le tube sont connectées à un
amplificateur (et bien entendu à un générateur à tension continue) lui-même connecté à un
appareil mesurant la conductivité électrique. Un amplificateur d’impulsion reçoit les mesures,
les amplifie puis les renvoie vers le système de comptage et d’affichage.
Procédure de mesure : Il faut noter que toutes les étapes de mesure sont automatiques.
Tout d’abord, l’échantillon du sang à analyser est dilué (Exemple : dilution à 1/200) en
ajoutant une solution isotonique qui permet une circulation facile des cellules. A l’intérieur de
l’appareil, le transport du sang est assuré par des pompes péristaltiques, de sorte à ne pas
endommager la structure des cellules. L’échantillon ainsi dilué est réparti en deux échantillons
1 et 2. Chacun de ces deux échantillons va traverser deux circuits différents :
Echantillon 1 : Cet échantillon subit une seconde dilution (Exemple : dilution à 1/200
x 1/200=1/40000) et passe directement vers la cuve de comptage. Cet échantillon contient
toutes les cellules sanguines, les GB sont négligés devant les GR et les plaquettes à cause de
leur faible nombre. Les plaquettes peuvent être facilement différenciées des GR à cause de
leur petite taille, une fois le comptage effectué, les impulsions associées aux GR passent par

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Chapitre IV : Appareils et méthodes en hématologie

un intégrateur afin d’obtenir le volume globulaire moyen des GR, ce qui permettra de calculer
les autres paramètres érythrocytaires.
Echantillon 2 : Cet échantillon effectue le second circuit parallèle : Tout d’abord, dans
l’échantillon est introduit un facteur de lyse qui provoque l’éclatement de la paroi cellulaire
de GR et permet de libérer l’hémoglobine, et donc par la suite de mesurer sa concentration à
l’aide d’un colorimètre incorporé (la longueur d’onde utilisée pour la mesure est dans le
domaine du rouge). En suite, les différents types de GB sont aussi comptés à l’aide de la
méthode de variation d’impédance. Les machines récentes permettent de différencier
partiellement les trois types de GB est donnent les différentes constantes érythrocytaires.
Nous citons par exemples l’automate « MICROS 60 » de la société « ABX » (figure
V-2), cet appareil permet de déterminer jusqu’à 18 paramètres ; GR, GB, Pla, Hb, Ht, VGM,
TCMH,… tout en différenciant les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes. Le
MICROS 60 permet d’analyser jusqu'à 60 échantillons par heure.

Figure (V-2) : Automate d’hématologie MICROS 60 – ABX, JAPAN

III- 2- Méthode optique : principe et appareillage 

Cette nouvelle méthode de compte-globule utilise le principe de l’effet de Mie.


Effet de Mie : Lorsqu’une radiation lumineuse éclaire un objet, l’angle de réfraction de la
radiation est directement proportionnel au volume de cet objet. Cette nouvelle technique
permet une différenciation plus précise des GB. Comme dans le cas de la technique coulter,
les GR et ces plaquettes sont comptés séparément des GB. En effet, après double dilution
d’une partie de l’échantillon à analyser, les cellules traversent une tubulure très étroite pour
assurer un alignement en série (figure V-3). En passant par une cuve à flux continu, les
cellules sont illuminées par une source laser.

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Grand angle Lentill


5/15° e
= Cellule
Densité s
photo-
chromatinienne
Petit angleélectri
2/3° Lent Laser
= ques ille
Taille
Flux
cellulair
e
Figure (V-3) : Comptage et différenciation des globules par la méthode de diffusion de la
lumière

De l’autre côté de la cuve deux photodétecteurs sont placés à deux angles différents
par rapport à l’axe optique. Un détecteur à un angle de 5-15° et l’autre 2-3°. Dans le cas du
comptage des GR er des plaquettes, les GR seront délectés par le détecteur à petit angle alors
que les plaquettes par le détecteur à grand angle. Les GB sont aussi comptés optiquement :
une partie de l’échantillon de sang à analyser et d’une fois diluée, puis il reçoit un agent de
lyse qui éclate la membrane des GR. Ensuite, les GB sont véhiculés à travers la tubulure. La
lumière lazer éclairant un GB subit deux diffusions : une diffusion selon le petit angle
renseignant sur la taille du globule, et une diffusion selon le grand angle renseignant sur la
densité nucléaire du globule. Les impulsions lumineuses, transformées par une cellule
photoélectrique en impulsion électriques, sont amplifiées et traitées par un algorithme
informatique qui, en se basant sur l’intensité de la lumière mesurée, est capable de
différencier quatre types de GB. Le cinquième type de GB (basophiles) est compté de la
même façon dans un canal séparé, ou par avant est introduit dans l’échantillon à analyser, un
réactif qui réduit le volume de tous les autres GB, ce qui facilite la séparation des basophiles.
L’hémoglobine est mesurée par le même type de colorimètre que le système Coulter.
Les constantes érythrocytaires sont aussi calculées de la manière déjà mentionnée au
paragraphe I-3. Il existe dans le commerce plusieurs automates d’hématologie utilisant la
méthode optique pour la numération et la détermination de la formule sanguine (Cytométrie
de flux). Comme exemple, nous citons l’automate « XT-2000 » de la société « Sysmex »
(figure V-4). Cet appareil permet d’effectuer la numération de GR, de doser l’hémoglobine,
de donner la formule leucocytaire ainsi que de se terminer les constantes érythrocytaires et
d’autres paramètres. Sa cadence est de 80 échantillons par heure.

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Chapitre IV : Appareils et méthodes en hématologie

Figure (V-4) : Automate d’hématologie XT-2000i- SYSMEX- JAPAN

Remarque : Il existe actuellement des automates d’hématologie puissants qui utilisent à la


fois la méthode de variation d’impédance et la méthode optique ; ainsi que d’autres méthodes
fluorimétriques. Ces appareils permettent d’aboutir à plusieurs paramètres et à la formule
leucocytaire totale avec une grande précision. Exemple  : l’automate « PENTA 120 » de la
société « ABX » (figure V-5).

Figure (V-5) : Automate d’hématologie Pentra 120 SPS - ABX - JAPAN

IV- Les analyseurs automatiques en immuno-hématologie 

IV- 1- Méthodes de détermination des groupes sanguins 

Avant toute transfusion sanguine, il est nécessaire d’identifier le groupe sanguin du


donneur et de l’accepteur. Ainsi, le rôle du laboratoire d’hématologie ou d’un centre de
transfusion sanguine consiste à grouper les donneurs dans les deux principaux systèmes ABO
et Rhésus, à chercher les antigènes « AG » sur la membrane des hématies et les anticorps
« AC » dans le sérum, ce qui permet de sélectionner les flacons du sang compatible. Le centre
est amené aussi à faire le dépistage de quelques maladies sur les échantillons de sang prélevés
tels que l’anémie, l’hépatite, le sida, … .
Les méthodes mises en évidence pour identifier les AG et les AC d’un échantillon de
sang inconnu sont les suivantes :
Tout d’abord, une séparation des hématies et du sérum de l’échantillon doit être
effectuée. Les hématies sont obtenues à partir de la centrifugation d’un échantillon de sang en
présence d’un anticoagulant, alors que le sérum est obtenu après coagulation du sang et
rétraction du caillot. Deux méthodes d’identification des AG et AC sont mises en point :
Méthode 1 : (l’épreuve globulaire de Berth Vincent) : les hématies à grouper sont
mélangées à différents types de sérum dont les AC sont connus. Par exemple, pour déterminer
le groupe ABO, les hématies sont mises en contact d’AC anti-A, anti-B et anti-AB. Si la mise
en contact avec l’anticorps anti-A provoque une agglutination des hématies, ces dernières
semblent faire parti du groupe A.
Méthode 2 (l’épreuve sérique de Simonim) : le sérum à analyser est mélangé aux
hématies connues. Dans le cas du système ABO, le sérum est mélangé aux hématies A et aux
hématies B. Si le mélange avec les hématies A conduit à une agglutination, le sérum semble
contenir l’AC anti-A.
Dans le cas d’un même échantillon de sang, les résultats des deux méthodes doivent
concorder.

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Chapitre IV : Appareils et méthodes en hématologie

IV- 2- Automates en immuno-hématologie 

En général, les automates en immuno-hématologie disposent d’un système de


distribution d’échantillons (hématie et sérum) une pompe, un circuit de réaction (mélange
entre hématies et sérum) un colorimètre un enregistreur et un système d’affichage et
d’impression. Les distributeurs disposent de deux chaînes, une chaîne dite de « recherche des
anticorps irréguliers », sur cette chaîne deux distributeurs solitaires sont utilisées, l’un
distribue les sérums et l’autre, les hématies. Une chaîne de groupage sur laquelle, le
prélèvement du plasma et des hématies est réalisé à l’aide de deux aiguilles plongeant à deux
niveaux différents dans le tube contenant l’échantillon à analyser préalablement centrifugé.
Il existe plusieurs méthodes utilisées pour l’analyse des interactions AC AG (sérum
 hématies : mise en évidence d’une agglutination). Nous distinguons principalement les
deux techniques suivantes :
- Dosage colorimétrique de l’hémoglobine : Après la mise en contact des hématies avec
un sérum donné, les agglutinas formés (s’il y a lieu d’une agglutination) sont éliminés
par décantation. L’hémoglobine des hématies restant en suspension (il faut noter
qu’avant la mise en contact avec le sérum, les hématies se trouvent en suspension dans
une solution saline) est dosée par colorimètre après hémolyse. La coloration obtenue
est d’autant plus faible que l’agglutination a été plus prononcée. L’absence de
coloration traduit une agglutination complète de toutes les hématies présentes dans la
préparation.
- Analyse par mesure de transmission d’un flux lumineux. A la suite d’une interaction
sérum  hématies, suivie d’une décantation, la lecture du résultat de la réaction peut
s’effectuer automatiquement par comparaison de deux mesures de transmission du
flux lumineux, à la périphérie et au centre du godet de réaction. En effet, lorsque
l’agglutination est produite (réaction positive), les agglutinas formés décantent au
centre du godet. Ainsi, le centre devient plus absorbant que la périphérie qui est plus
claire (contient moins de cellules). Par conséquent, le faisceau transmis à la périphérie
est plus intense que celui transmis au centre.

Les mesures de comparaison sont classées négatives (absence d’agglutination),


positives ou faiblement positives, par comparaison à des valeurs de seuils affectées à chaque
canal de mesure. Les seuls peuvent être fixés par l’opérateur.
En fin, les résultats obtenus sur les différents canaux d’analyse sont transmis à un
microprocesseur qui a en mémoire la logique des systèmes de groupes sanguins et qui relie le
résultat trouvé à l’échantillon groupé. Un logiciel adopté permet de piloter l’automate, de
traiter les résultats obtenus et de les afficher et les enregistrer.

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