GÉNIE FERMENTAIRE

S4_IAB3 / S4_GE2

Modules S4IAB3 et S4GE2 Génie génétique (GE + IAB) Mr Bennasroune
Cours : 12h TD : 6h TP : 8h

Biodégradations (GE) : Mr Flambeau
Cours : 4h TD : 2h

Génie fermentaire (GE + IAB) : moi
Cours : GE : 12h IAB : 14h TD : GE : 6h IAB : 8h TP : GE : 8h IAB : 20h

Evaluation génie fermentaire 1 note = 4 IE début de cours (4x5pts) 1 note IE fin de module (≈ fin mars, coef 2) 1 note (GE) / 3 notes (IAB) de TP

Méthodes, particularités synthèse de diverses disciplines visée pratique documents prise de notes bibliographie : Biotechnologies, R. Scriban

Génie fermentaire Introduction

Définition BIO-TECHNOLOGIE Utilisation d'éléments du vivant à des fins d'applications industrielles, agricoles ou médicales OCDE (1980) : mise en œuvre de matériel biologique pour une production de biens et de services.

Biotechnologies
Génie fermentaire

Micro-organismes Plantes Animaux

Génie génétique

OGM

Génie enzymatique

ENZYMES

Un peu d’histoire…

Pffouuu, la barbe… Je hais l’histoire…

Quelques milliers d’années plus tôt…

Fin XIXe : relation microorganismes / fermentation

1861

Première moitié XXe : premières productions industrielles
Première guerre mondiale : glycérine

Première moitié XXe : premières productions industrielles

1928

Deuxième guerre mondiale : pénicilline

Depuis 1973 : génie génétique

Applications actuelles

Applications environnementales : dépollution
Dépollution de sols

Dépollution des rejets gazeux (COV)

Production de bio gaz par méthanisation de déchets

Dépollution des eaux

Applications : productions
Médicaments : protéines recombinantes Bioéthanol

Médicaments : antibiotiques

Applications : production
Additifs alimentaires Enzymes : chymosine

Bioplastiques : PLA…

Avantages du vivant spécificité des réactions

Avantages diversité des réactions

Avantages conditions réactionnelles douces auto entretien des cellules

Inconvénients complexité de mise en œuvre rentabilité variabilité

Outils du génie fermentaire
microbiologie dosages biochimiques et chimiques automatisme génie industriel modélisation mathématique …

synthèse de divers champs de connaissances

Etapes
Génie génétique

obtenir le micro-organisme
• sélection • ‘création’ par modification ADN

développer le procédé à petite échelle
• faisabilité • rentabilité

mettre en œuvre à l ’échelle industrielle
Génie fermentaire

Laboratoire Industriel

Pilote

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs

Cinétiques… Acquérir :
X S P
S
temps X S P

X P

temps

calculer
comparer
sélectionner optimiser

X S P dX/dt = f (t, T, pH, S…) -dS/dt = f (t, X, S…) dP/dt = f (t, X, S…) temps

modéliser
prévoir et contrôler
dN/dt = rN(1-N/Nmax)(1-Nmin/N)c

Laboratoire Industriel

Pilote

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble

T, pH, pot redox…

X

S P

Notion de maintenance

‘’On ne se baigne jamais deux fois dans le même fleuve’’ Héraclite

Utilisation du substrat

P S

X

Répartition m/P/X dépend : …

Utilisation du substrat
S P

X

Rendements : Yx/s = g de X formé / g de S consommé Yp/s = g de P formé / g de S consommé m = g de S consommé / g de X

Rendements Rendement global ou final:
P - Po So – S X - Xo So - S S X P

Rendement instantané :
dP/dt dS/dt Soit dP/dS, dX/dS

S

X P

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
3.1 courbe de croissance

LnX LnXf LnX2

LnX1 LnXo

Milieu non renouvelé (batch)
Ln du nombre de cellules Au moins 1 paramètre limitant... Croissance non limitée

Adaptation au milieu

Temps

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance

Rappels
g
X
individu population

16 ; 16X

g

8 ; 8X

g g g g

(t 2 − t1 ). ln 2 g= (ln X 2 − ln X 1 )

4 ; 4X 2 ; 2X 1;X

temps

Détermination graphique de g
Biomasse X

X2=2X1 X1

t1 g t2

Temps

Ln X

Ln(2X1) = LnX1 + Ln2
Ln2

ln(X1)

t1 g t2

Temps

Vitesse de croissance expression d’une vitesse :
quantité / unité de temps : km/h, pizzas/jour dX / dt = biomasse formée / h c’est une vitesse instantanée

Vitesse spécifique de croissance

Vitesse spécifique de croissance exercice préparatoire ☺ :
Cinétique de la production de frites dans deux cabanes à frittes concurrentes Temps production cabane 1 120 kg production cabane 2 180 kg

11h00-14h00

Vitesse spécifique de croissance exercice préparatoire ☺ :
Cinétique de la consommation de frites dans deux cabanes à frittes concurrentes Temps conso cabane 1 120 kg conso cabane 2 180 kg vitesse de production 40 kg/h vitesse de production 60 kg/h

11h00-14h00

Dans quelle cabane les employés fabriquent-ils le plus de frittes chacun ? Lesquels je vais virer ???

Vitesse spécifique de croissance
Temp s Vitesse de conso cabane 1 Vitesse de conso cabane 2 Nombre Nombre Prod. Prod d’emplo d’emplo Par par yés yés emplo employ cabane cabane yé é 1 2 Caban Caban e1 e2 2 1 2 3 2 2 20 40 20 20 30 30

Cas a Cas b Cas c

3 3 3

40kg/h 40kg/h 40kg/h

60kg/h 60kg/h 60kg/h

Vitesse spécifique de croissance = µx

dX 1 µx = . dt X

Vitesse spécifique de croissance (µx)
croissance = réaction d’ordre 1

dX rx = = µ x .X dt

D'où :

dX 1 µx = . dt X

En h-1 ou mn-1
En fait : g de X / g de X / h

dX 1 . µx = dt X
?
Le X de 1/X = X moyen sur un dt petit

X

Représente bien la valeur moyenne

Ne représente pas la valeur moyenne

temps Bien vérifier que X varie linéairement sur le dt choisit

Évolution de µx

lnX

µ x max µx

µx dépend de : - la souche - le milieu - la T - le pH -……….

en intégrant de t1 à t2

(ln X 2 − ln X 1 ) µx = (t 2 − t1 )
Ln X Ln X2 Ln X1 Méthode la plus simple et la plus fiable pour calculer µx.

Pente = µ
t1 t2 Temps

Relation entre g et µx

(ln X 2 − ln X 1 ) µx = (t 2 − t1 )

(t 2 − t1 ). ln 2 g= (ln X 2 − ln X 1 )

ln 2 g= µx

Exploitation des mesures
Temps Biomasse X 0 20 1 20 2 30 3 50 4 90 5 80 6 90

ln X

2,996 2,996 3,401 3,912

4,5

4,382

4,5

Ln X

Temps

Mesure du temps de latence

LnX0

0
Temps de latence

Ln X

µx demandé :
Pente = µ
Temps Ln nombre de cellules

g demandé :
ln2

g

Temps

Conseils importants

Par le calcul
g= (t 2 − t1 ). ln 2 (ln N 2 − ln N1 )

µx =

(ln X 2 − ln X 1 ) (t 2 − t1 )

Graphiquement

Paramètres de croissance à déterminer durée phase de latence : lag vitesse spécifique de croissance : µx temps de génération : g Eventuellement : concentration initiale : Xo concentration finale : Xmax

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance 3.3 influence de la température

EFFET de la TEMPÉRATURE sur la CROISSANCE

Optimale Topt
Vitesse de croissance µx

Minimale Tmin

Maximale Tmax

Température

En fonction Topt cryophiles psychrophiles mésophiles thermophiles hyperthermophiles
µx

pH ou T°

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance 3.3 influence de la température 3.4 influence du pH

EFFET du pH sur la CROISSANCE

Gamme de pH 3 à 4 U pH µx

pH optimal

pHmin

pHmax

pH

En fonction du pHopt alcalinophiles neutrophiles acidophiles

µx

pH ou T°

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse
3.1 courbe de croissance 3.2 paramètres de la croissance 3.3 influence de la température 3.4 influence du pH 3.5 autres facteurs de variation

Autres facteurs composition nutritive du milieu teneur en eau / P osmotique (= aw) Po2 / potentiel redox densité de population dX = µX (1 − X )
dt X
f

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes 1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat
4.1 vitesse spécifique de consommation

réaction d’ordre 1

dS = µ s .X rs = dt

D'où :

dS 1 µs = . dt X

En h-1 ou mn-1
En fait : g de S / g de X / h

Détermination de µs
S X

dS X2 X1 X = (X1+X2)/2

dt

dS 1 µs = . dt X

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat
4.1 vitesse spécifique de consommation 4.2 équation de Pirt
C’est pirt que tout !!!

Vitesse de consommation de S
BIOMASSE

SUBSTRAT

MAINTENANCE

PRODUIT(S)
Vitesse de consomm ation du S pour faire X Vitesse de consomm ation du S pour la maintenan ce

Vitesse de consomm ation du S

=

+

+

Vitesse de consomm ation du S pour faire P

Equation de Pirt

dS 1 1 1 µS = . = .µ X + m + .µ P dt X Y ' X / S Y 'P / S
µ s = g de S consommés par h et par g de biomasse

Y’ = rendement particulier / théorique ≠ Y
C6H12O6 180g 2 CH3CH2OH + 2 CO2 2x46 = 92g Y’p/s = 92/180 = 0,511

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat
4.1 vitesse spécifique de consommation 4.2 équation de Pirt 4.3 influence de S sur x
Hips …
Ch’est trè bon, ouaip !

Le shhubstra t…

Loi de Monod
µxmax

µ x = µ x max

S Ks + S + ( S 2 / K I )

Inhibition par le substrat

µxmax/2

µ x = µ x max

S Ks + S

Ki

Intérêt de Ks espèce A : Ks = 1 mM ; µx = 0,5 h-1 espèce B : Ks = 0,1mM ; µx = 0,5 h-1
max max

si S = 0,5 mM : … si S = 10 mM : …

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit
5.1 vitesse spécifique de production

5 en 4 ans, faudrait que ça cesse !

dP 1 µp = . dt X
µ p = g de P formés par h et par g de biomasse

Détermination : comme pour µs

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit
5.1 vitesse spécifique de consommation 5.2 association avec la croissance

Association avec la croissance En réacteur fermé : 3 cas
X

Associé à la croissance = métabolite primaire
P
temps

ex : éthanol (levures)

dP = YP / X .µ X .X dt

X

P

Non associé à la croissance = métabolite secondaire
temps

ex : antibiotiques

dP = β .X dt
dP = α .µ X .X+β.X + β .X dt

X

Association mixte
P
temps

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit
5.1 vitesse spécifique de consommation 5.2 association avec la croissance 5.3 inhibition de la croissance par les produits

µ = µ max

S KI . KS + S KI + P I

exemples : éthanol (levures), acétate (E. coli)

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité

Calcul de la productivité en biomasse
Productivité volumique horaire = (Xf - Xo) / durée totale
X (g/L) g de X / L / h

Xf

Xo
Temps

0

V, N, R, S

culture

t

(h)

ensemencement

Durée totale du process = V : vidange ; N : nettoyage ; R : remplissage ; S : stérilisation ; culture

Calcul de la productivité en produit
Productivité volumique horaire = (Pf - Po) / durée totale
P (g/L) g de P / L / h

Pf

Po
Temps

0

V, N, R, S

culture

t

(h)

ensemencement

Durée totale du process = V : vidange ; N : nettoyage ; R : remplissage ; S : stérilisation ; culture

Productivité horaire totale productivité horaire totale = ….

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
7.1 discontinu = batch

Batch
Vf

milieu inoculum culture

Vf Xo, So, Po

Xo, So, Po

Vf Xo So Po Xf
Vf

Sf (0 en général)
Xf, Sf, Pf

Pf

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
7.1 discontinu = batch 7.2 discontinu alimenté = fed-batch

Fed-batch
Vf

remplissage partiel inoculum Vo Xo X culture
So Po 0 P

Vo Xo, So, Po

Vf

alimentation
Vo X Vf Xf
Vo Xf, S=0, Pf Vf

Vo X, S=0, P

S~0 P Pf

Alimentation en S débit constant
V Temps

palier

V Temps

variation continue du débit (en fonction de X par
ex.)

V Temps

Influence du débit d’alimentation sur X

Intérêts du fed-batch évite inhibition par S diminue latence
meilleure productivité

permet changements de composition

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
7.1 discontinu = batch 7.2 discontinu alimenté = fed-batch 7.3 continu

continu
Vf

milieu inoculum

Vf Xo, So, Po

Xo, So, Po

culture en batch
Vf Xo So Po X
Vf

S (0 en général)
X, S, P

P

alimentation + soutirage : V constant

Vf X, S, P

Mode batch

Mode continu

V constant = même débit entrée et sortie

Débit d’entrée F (l/h) So

Débit de sortie F (l/h) X, S (≈0), P ≈

Vf X, S, P

Temps de séjour = V / F Taux de dilution D = F / V

Jusqu’à... Production voulue Contamination Dérive de la souche microbienne Problème technique : colmatage...

Avantages productivité élevée pas d’inhibition S ou P

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture
7.1 discontinu = batch 7.2 discontinu alimenté = fed-batch 7.3 continu 7.4 comparaison

Batch

Fed batch

Continu

Pompe d’alimentation

Pompe d’alimentation

Pompe de soutirage ou surverse

Plic !

Ploc !

FED BATCH

CONTINU CSTR

BATCH

FED-BATCH - productivité > batch - pas de problème d'inhibition par le S - contrôle possible du métabolisme par variation du S en cours d'alimentation - reste assez simple et souple

CONTINU

P O U R

-simple - souple d'utilisation - peu de problème d'inhibition par le P

- productivité très élevée - fonctionne en continu
- peu d’inhibition S/P

CONTRE U T I L I S A T I O N S T Y P E S

- productivité faible - inhibition possible par les - inhibition possible par le S P - petites productions - process lents (fermentations alimentaires, biodégradation sur plusieurs - tout type de production jours…) industrielle - précultures pour bioréacteur industriel - S solides (dépollution des sols…)

- risques de contamination ou de dérive de la souche - complexe à mettre en œuvre

- traitement d'un S en continu (STEP…) - manipulation de gros volumes à traiter ou à produire)

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture 8. Méthodes de mesure de X, S et P

Vue d’ensemble / cas général

Mesures in situ (si capteurs)

et/ou

Prélèvement

Mesure de X

Centrifugation

Mesure de S et P sur le surnageant

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture 8. Méthodes de mesure de X, S et P
8.1 Mesure de la biomasse

Mesure du trouble absorbance à 500-650 nm
• zone de linéarité étroite • rapide • peu coûteux

sonde turbidimétrique (capteur)
• linéarité plus étendue • pas de prélèvement à faire • enregistrement en continu

Mesure directe de la biomasse microscopie (cellules eucaryotes) ufc matière sèche
• • • • prélever V mL collecter les micro-organismes (filtration, centri) laver le culot sécher → masse constante

Mesure d’une activité consommation d’O2 (capteur) production de CO2 (capteur)

CHAPITRE 1 : cinétiques microbiennes
1. Objectifs 2. Vue d’ensemble 3. Cinétique de la biomasse 4. Cinétique du substrat 5. Cinétique du produit 6. Productivité 7. ‘Modes’ de culture 8. Méthodes de mesure de X, S et P
8.1 Mesure de la biomasse 8.2 Mesure de S et P

Mesure de S et P capteur quand disponible méthode chimique / biochimique sur surnageant de culture

Fin

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