Université Amar Télidji de Laghouat

Faculté de Médecine
Module de Cytologie et Physiologie cellulaire

2020-2021

Dr. Dr.
LAOUADI BECHEUR
MOURAD MOURAD
Dr. LAOUADI MOURAD Dr. BECHEUR MOURAD

laouadi.mourad@yahoo.fr mourad_becheur@yahoo.fr
 Chapitre II
Méthodes d’études de la cellule
Comment les cytologistes et histologistes réussissent-ils à
étudier les cellules et les tissus, généralement invisibles à
l’œil nu ?
 Petite
taille des
cellules
Étude des
cellules
nécessitent des
instruments
grossissants
Résolution
limitée
des yeux
0,2mm
Les microscopes
1674
 Définition
 Mikros : petit
 Skopein : examiner

 La microscopie : ensemble de techniques d’imagerie des

objets de petites dimensions
 L’appareil utilisé pour rendre possible cette observation est
appelé un microscope
 L’objet à observer est appelé : préparation
 La microscopie désigne étymologiquement l’observation
d’objets invisibles à l’œil nu
 Microscopes

Optiques ou
Électroniques
photoniques

À fond clair À fluorescence À transmission À balayage

À contraste de
phase
Trois paramètres importants en microscopie

Grossissement Résolution Contraste

Trois paramètres importants en microscopie
Notion de contraste
Notion de contraste
Notion de contraste
 Notion de pouvoir séparateur = limite de résolution

C’est une mesure de la

netteté de l’image C’est la capacité de l’œil
à distinguer nettement
2 points très
0,2mm
rapprochés, il est égal
à 0,2 mm à distance de
25cm

Organismes de taille plus petite sont invisibles à l’œil nu, d’où la nécessité
d’utiliser des instruments destinés à observer de petits objets dont un système
de lentilles (optiques, électroniques … ) fournit une image agrandie
 Pouvoir séparateur = limite de résolution

Type de microscope Pouvoir de résolution

Œil 0,1 à 0,2mm (100-200µm)

Microscope optique 0,2µm (200nm)

Microscope électronique 2 nm (2.10-3 µm)

 Échelles d’observation

Cellule végétale

Virus/ribosome

Macromolécule
Cellule animale

Molécule
Bactérie

Atome
1 cm 1 mm 100µm 10 µm 1 µm 100 nm 10 nm 1nm 0,1 nm

Œil nu
Microscope photonique
Microscope électronique
 Sommaire

II-1 Les microscopes optiques ou photoniques

A- Le microscope optique à fond clair

B- Le microscope optique à fluorescence

II-2 Les microscopes électroniques

A- Le microscope électronique à transmission (MET)

B- Le microscope électronique à balayage (MEB)

 Sommaire

II-3 Techniques de détection et de localisation des composés

cellulaires

II-4 Les procédés d’isolement des composants cellulaires

II-1 Les microscopes optiques
A- Le microscope optique à fond clair
 Objectifs du cours

1) Définir la notion de pouvoir séparateur

2) Donner le principe de fonctionnement du microscope
photonique à fond clair (microscope optique)
3) Indiquer les domaines de son application
4) Citer les étapes préparatoires d’un échantillon en vue
d’une observation au microscope à fond clair (la technique
histologique)
 Définition

La microscopie optique en champ clair

ou à fond clair permet d’étudier des
cellules fixées et colorées (tuées et
traitées en vue d’un examen) et de
les observer sur une image foncée
avec un fond brillant. C’est la plus
simple et la plus ancienne des
techniques de microscopie
 Objectif 1: Pouvoir séparateur

Résolution = la capacité du microscope à donner une image

claire et précise ; la capacité de séparer des détails

Limite de séparation en microscopie optique =

0,2µm

Haute résolution Faible résolution

 Objectif 2: Principe de fonctionnement

Lumière (photons) Échantillon Image à l’œil

 Objectif 2: Principe de fonctionnement

Le microscope optique à fond clair fonctionne par transmission de la

lumière blanche (photons) sur un échantillon d’épaisseur très fin
(transparent) en utilisant des lentilles en verre
Objectif 2: Principe de fonctionnement
 Objectif 2: Principe de fonctionnement

Éléments constitutifs
du microscope
photonique
 Objectif 2: Principe de fonctionnement

Comment connaitre le grossissement utilisé?

Grossissement d’un microscope

=
Grossissement des objectifs X Grossissement des oculaires

Objectifs: x4/x10/x40/x100 Oculaires: x10

X40/X100/X400/X1000
Objectif 3: Domaines de son application
Description structurale des tissus et des cellules
 Taille des cellules
 Forme des cellules
 Forme et position des noyaux
 Objectif 3: Domaines de son application

Cette description structurale nous aide dans le diagnostic

histo et cytopathologique, et aussi dans la recherche

Epithélium Tissu musculaire Epithélium de

intestinal cardiaque l’épididyme
 Objectif 3: Domaines de son application

La microscopie photonique est utilisée aussi pour

l’observation de différentes formes bactériennes après
coloration de Gram (diagnostic bactériologique)
 Objectif 4: les étapes préparatoires d’un
échantillon en vue d’une observation au microscope
à fond clair (la technique histologique)
 Objectif 4: les étapes préparatoires d’un
échantillon en vue d’une observation au microscope
à fond clair (la technique histologique)
L’observation par transmission exige que les rayons
lumineux traversent l’objet

Ainsi l’objet doit être de très faible épaisseur (2 à 10µm)

Il faut donc réaliser des coupes fines appelées coupes

histologiques
Objectif 4: Techniques histologiques
 Objectif 4: Techniques histologiques
1- Le prélèvement

Humain ou Animal vivants Cadavre

•Biopsie •Autopsie (le plus rapidement

•Pièces opératoire possible après le décès)

 Épaisseur des coupes : 2-3 mm

 L’incidence de la coupe (longitudinale, transversale..)
Objectif 4: Techniques histologiques
1- Le prélèvement

Liquide de fixation
 Objectif 4: Techniques histologiques

2- La fixation (but)
 Tuer la cellule en modifiant le moins possible sa structure
interne

 Protéger les tissus prélevés de toute autolyse due à la libération

des enzymes contenus dans les lysosomes cellulaires

 Prévient la putréfaction bactérienne

 Objectif 4: Techniques histologiques
2- La fixation (types)
 Physique: Congélation, cryodessiccation

 Chimique
Fixateurs simples Mélanges fixateurs
Éthanol Formol Liquide de Liquide de bouin
carnoy

-Durcissement des tissus -Utilisation facile (avantage)

(inconvénient)
-Cher (inconvénient)
- Solvant des graisses -Pas cher (avantage)
-Irritant (inconvénient)
 Objectif 4: Techniques histologiques
2- La fixation (durée)
Durée de la fixation est fonction de:
La vitesse d’imprégnation du liquide fixateur
La consistance du prélèvement
L’épaisseur du fragment
Echantillon Durée de fixation
Cellules isolées ou frottis sanguin 5 mn
Petits fragments (qq mm) 1-2 heures
Bloc épais (1 cm) 1-2 jours
Fragments d’organe 1-2 semaine

 Généralement la durée de fixation est

de 24 à 48 heures
 Objectif 4: Techniques histologiques
3- L’inclusion

 L'inclusion en paraffine consiste à infiltrer et à enrober

les tissus à examiner avec de la paraffine car ces derniers
sont mous, il faut donc leur donner une consistance solide
 Cette importante étape est composée de 4 sous-étapes:
3-1 La déshydratation
3-2 L’éclaircissement
3-3 L’imprégnation par la paraffine
3-4 L’enrobage (=moulage)
 Objectif 4: Techniques histologiques
3- L’inclusion
3-1 La déshydratation: remplacer l’eau par l’alcool
30min 01 heure 01 heure

Ethanol 70° Ethanol 90° Alcool absolu 100°

3-2 L’éclaircissement: remplacer l’alcool par le toluène (ou le xylène)

01h 30 min 01h 30 min

Imprégnation Imprégnation
Toluène Toluène
 Objectif 4: Techniques histologiques
3- L’inclusion
3-3 L’imprégnation par la paraffine
L’inclusion a pour objectif d’imprégner totalement les cellules d’une
substance durcissante, qui est la paraffine (remplacer le toluène par
la paraffine), qui permettra une coupe fine et régulière.

Imprégnation du prélèvement dans la

paraffine fondue dans une étuve réglée à
une T° 60°C et cela :

1er bain: 1h30 min

2ème bain: 1h30 min
Objectif 4: Techniques histologiques
3- L’inclusion
3-4 L’enrobage (=moulage)

 Couler la paraffine fondue contenant le prélèvement

dans un moule qui se solidifie à la température
ambiante

 Obtention des blocs de paraffine qui

pourront être facilement coupés et
qui servent aussi de moyen de
stockage des échantillons
 Objectif 4: Techniques histologiques
4- La coupe (=la microtomie)
La coupe a pour but de réaliser des sections fines (de 2 à 10 µm
d’épaisseur) et transparentes de l’objet inclus à l’aide d’un
microtome

Microtome
Objectif 4: Techniques histologiques
4- La coupe
Objectif 4: Techniques histologiques
4- La coupe
Objectif 4: Techniques histologiques

4- La coupe
 Objectif 4: Techniques histologiques
4- La coupe

Obtention d’un ruban composé de plusieurs coupes identiques

prêtes pour l’étape du collage
 Objectif 4: Techniques histologiques
5- Le collage

Les coupes identiques obtenues sont placées sur des lames puis
colées par de l’albumine ou par de l’eau
 Objectif 4: Techniques histologiques
5- Le collage

Chauffer les coupes colées sur une platine chauffante à une T°

qui doit être inférieure à 56°C (1-2° de moins)
 Objectif 4: Techniques histologiques

5- Le collage

Obtention de « lames blanches » prêtes à être colorées

 Objectif 4: Techniques histologiques
6- la coloration
5min + 5min 1min 1min 1min

Déparaffinage Éthanol Éthanol Éthanol Eau

dans deux 100° 90° 70°
bains de
Réhydratation
Toluène

……..

Hématoxyline Eau Eosine

 Objectif 4: Techniques histologiques
6- la coloration

Hématoxyline : colore les noyaux en violet

Éosine : colore le cytoplasme en rose

Safran : colore les fibres conjonctives en jaune

Objectif 4: Techniques histologiques
7- Le montage

Étiquetage
 Objectif 4: Techniques histologiques

7- Le montage

Lames histologiques colorées et montées entre lames et

lamelles par la résine, puis étiquetage → observation au
microscope optique
Exemple: coupe histologique du tiers inférieur de l’œsophage
(Microscope optique au faible grossissement)