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Matériaux et méthodes :

Zoogloea ramigera 115 a été obtenue de la Ohio State University Culture Collection,
Columbus, Ohio et cultivée soit dans un milieu CY [5 g/l de casitone (Difco, Detroit, Ill), 1,0
g/1 d'extrait de levure (Difco), modifié à partir de Unz et Farrah 1972] soit dans un milieu
défini (DM, Parsons et Dugan 1971) contenant 0,5 g/1 d'arginine-HC1 (Sigma Chemical Co,
Louis, Mo, USA), 1,0 g/l d'alanine (Sigma), 0,2 g/1 MgSOa.7H20, 2,0 g/1 K~HPO4, 1,0 g/1
KHzPO4, 20 g/1 de glucose [Cerelose-Dextrose 2001 (CPC International, Englewood Cliffs, N
J, USA)] et 0,002% d'extrait de levure (au lieu de la vitamine B12 utilisée par Parsons et
Dugan 1971). L'organisme a été cultivé sur un agitateur rotatif à 28 ° C. Les milieux ont été
inoculés avec 0,1 ml de cultures mères (environ 10 9 cellules/ml) stockées dans l'azote
liquide.

Spectrophotométrie d'absorption atomique (AAS). Les métaux ont été quantifiés à l'aide
d'un spectrophotomètre d'absorption atomique Perkin-Elmer modèle 403 (Norwalk, Conn,
USA) équipé d'une flamme d'acétylène et des lampes à élément unique appropriées.
( tu peux mettre une photo c mieux )

Immobilisation de Z. ramigera. Zoogloea ramigera a été cultivée pendant une nuit dans 500
ml de milieu CY ou DM à 28 ° C, récolté par centrifugation à 10400 g pendant 10 min et le
culot a été mis en suspension dans 20 ml de NaC1 à 0,85 %. Les cellules remises en
suspension ont été ajoutées à 250 ml d'alginate de sodium de haute viscosité à 2% (Sigma,
concentration finale : 1,85%) dans du NaC1 à 0,85% et mélangées. Les cellules ont été
immobilisées en forçant le mélange cellule-alginate à travers des aiguilles de calibre 25 dans
250 ml de solution de CaC12 à 1,47 % à l'aide d'une pompe à vitesse variable. Les perles
ainsi formées ont durci pendant 2 h, ont été stabilisées avec 250 ml de polyéthylèneimine à
1% (PEI), pH 5,0, (Polysciences, Warrington, Pa, USA), dans du H20 doublement distillé
(ddH20), pendant 5 min et lavées avec 3 1 ddH2O. Des billes d'alginate seul se sont formées
comme celles contenant des cellules, sauf que 20 ml de NaC1 à 0,85 % sans cellules ont été
ajoutés à l'alginate à 2 %. Après stabilisation, les cellules immobilisées ont été placées dans
un réacteur à colonne à bulles en milieu CY ou DM pendant 18-24 h, avant d'être exposées à
des solutions contenant des métaux. Les solutions n'étaient pas tamponnées et étaient faites
à partir de solutions mères concentrées des chlorures métalliques, sauf pour le ZnSO4.7H20
et le Pb(NO3)2. Toutes les expériences avec des cellules immobilisées ont été réalisées à
température ambiante. La Zoogloea ramigera utilisée pour l'immobilisation a été cultivée à
28° C, mais la croissance des cellules immobilisées s'est faite à température ambiante.
Réacteur à colonne de bulles. Un tube de verre (diamètre, 9 cm ; hauteur, 29 cm) contenant
un filtre en verre rodé au fond et scellé par un bouchon en caoutchouc au sommet a été
utilisé pour toutes les expériences. Une tige creuse, recouverte d'un filet de nylon, a été
insérée dans le bouchon pour atteindre le bas de la colonne. Ce tube a été utilisé pour
pomper le liquide à l'intérieur et à l'extérieur du réacteur. La colonne a été aérée à 250-350
cc/min, l'air comprimé étant forcé à travers le filtre en verre rodé au fond du réacteur. Tous
les volumes pour l'exposition aux métaux, le lavage et la récupération avec l'acide
nitrilotriacétique (NTA) ont été arbitrairement fixés à 500 ml. Bien que la capacité de
chaque colonne ait été d'environ 21, le volume de travail était généralement de 750 ml (500
ml de liquide et 250 ml de billes). Des volumes plus importants n'ont pas été utilisés en
raison de problèmes de moussage et de montée en pression. Réacteurs séquentiels. Trois
fois 500 ml de Z. ramigera ont été cultivés en milieu DM pendant 18-24 h, les boulettes
cellulaires récoltées ont été combinées, remises en suspension dans 60 ml de NaC1 à 0,85%
et 20 ml ont été ajoutés à trois fois 250 ml d'alginate à 2%. Les mélanges de cellules-
alginates ont ensuite été utilisés en immobilisation pour générer trois lots de billes. Après
les procédures d'immobilisation, chaque ensemble de billes de 250 ml a été placé dans un
réacteur à colonne à bulles dans 500 ml de milieu DM pendant 24 h. Le milieu a alors été
pompé et les billes ont été lavées avec 500 ml de ddH20. Le premier réacteur (R1) a été
exposé à une solution contenant du métal pendant 30 min et un échantillon de 3 ml a été
prélevé toutes les 10 pluies. Cette solution a ensuite été pompée hors du réacteur et
remplacée par 500 ml de ddH20. La solution métallique retirée de R1 a été ajoutée aux billes
lavées dans le second réacteur (R2) pendant 30 min, et échantillonnée toutes les 10 min.
Après 30 minutes, la solution a été pompée de R2, remplacée par du ddH20 et ajoutée au
troisième réacteur (R3). Les échantillons ont été prélevés pendant 30 min et la solution est
restée en contact avec les billes dans R3 jusqu'à ce que le processus d'exposition soit répété
le lendemain.
Exposition à 100 micro g. ml- 1 Cd. Les cellules immobilisées des colonnes 1 à 3 ont été
exposées à des solutions contenant du Cd après une croissance initiale d'une nuit, tous les
jours pendant 10 jours, comme décrit ci-dessus. Après 10 jours, les cellules immobilisées
dans la première colonne n'ont plus adsorbé autant de métal. Pour éviter une diminution de
l'efficacité globale de l'adsorption des métaux, les billes du premier réacteur ont été traitées
avec 0,48 % de NTA, pH 6,0, pour récupérer le Cd adsorbé. Après exposition au NTA, les
cellules immobilisées ont été placées dans un milieu DM à base de graines de Z. ramigera-
seed (l'inoculum a été cultivé à 28°C pendant 18 h). Après 18 h, la régénération était
terminée, le milieu était enlevé, les perles lavées et le régime d'exposition au Cd était
poursuivi pendant 10 jours supplémentaires.
Exposition à des métaux mélangés. La base de cette expérience a suivi le principe des
réacteurs séquentiels à Cd. Cependant, les billes de la première colonne ont été exposées à
quatre solutés métalliques contenant un total de 72, 138, 360, et 702 micro g. ml- 1 Cd, Pb,
Sr, Cu, Zn, et Mn (12, 23, 60, et 117 micro g.ml -1 de chaque métal individuel). Les billes des
colonnes 2 et 3 ont reçu des solutions qui avaient été précédemment dans R1 ou R2 pendant
30 min, respectivement. Le temps d'exposition était de 30 min par réacteur. Trois millilitres
d'échantillons ont été prélevés à 10 intervalles de pluie. Les solutions métalliques pompées
ont été remplacées par du ddH20.
Récupération des métaux avec NTA. Le Cd a été récupéré des cellules immobilisées dans le
premier réacteur après 10 jours d'exposition au métal en utilisant 500 ml de NTA à 0,48 %,
pH 6,0, pendant 3 h. La première colonne, contenant des billes exposées à quatre solutions
métalliques multiples, a été traitée de la même façon. Pour mieux comprendre l'action du
NTA, les cellules immobilisées ont été prétraitées avec 0,24 % de NTA, pH 6,0, ou exposées à
une solution contenant à la fois 50 micro g. ml-1 Cd et 0,24 % de NTA, pH 6,0.

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