Lentivirus

La grande majorité (85%) des adénocarcinomes pancréatiques

(PDAC) sont découverts à un stade trop avancé pour permettre une
chirurgie curative.

En outre, PDAC est très résistant aux méthodes conventionnelles de

chimiothérapie et de radiothérapie qui n'offrent qu'un bénéfice
clinique marginal.

récemment démontré que la thérapie génique PDAC utilisant des

vecteurs non viraux est sûre, faisable, avec des signes précoces
d'efficacité chez certains patients.

Notre prochaine étape consiste à transférer à la clinique des vecteurs

lentiviraux à base de VIH-1 pour traiter des modèles expérimentaux
de PDAC. Cependant, un problème de sécurité primaire présenté par
les vecteurs lentiviraux qui peuvent retarder leur utilisation chez les
patients est le risque d'oncogenèse suivant l'intégration du vecteur
dans l'ADN cellulaire de l'hôte. Ainsi, nous avons développé une
nouvelle approche anticancéreuse basée sur des vecteurs
lentiviraux défectifs de l'intégrase (IDLVs) et démontré que les IDLV
peuvent être modifiés avec succès pour délivrer transitoirement des
gènes thérapeutiques pour inhiber la prolifération des cellules
cancéreuses pancréatiques

Objectif : Ce travail a pour but d'utiliser des IDLV thérapeutiques

pour la prise en charge du PDAC, dans le cadre d'un essai clinique
de thérapie génique en phase précoce à venir pour cette maladie
sans traitement curatif
Introduction :

La gemcitabine est la dénomination commune internationale de

l'isomère β de la 2'-désoxy-2',2'-difluorocytidine. Son chlorhydrate
est un médicament anti métabolite, analogue de la désoxycytidine,
une des quatre bases azotées de l'ADN

Classe thérapeutique : Immunosuppresseur

PDAC ?

PDAC a été activement ciblé par des approches de thérapie génique

et les produits de thérapie génique sont actuellement dans les essais
cliniques en retard, seul ou en combinaison avec des agents
chimiothérapeutiques. Nous avons réalisé le premier essai clinique
sur l'homme, basé sur l'utilisation de vecteurs non viraux pour
transférer les gènes anticancéreux qui sensibilisent les cellules PDAC
à la chimiothérapie gemcitabine 4. Cet essai clinique en phase
précoce a démontré que la délivrance de gènes intratumoraux est
sûre et faisable chez les patients PDAC qui ne peut pas subir une
intervention chirurgicale. En outre, une population de patients
atteints de tumeurs localement avancées a bénéficié de ce
traitement, deux patients ayant survécu deux ans après la thérapie
génique 4.

D'après notre expérience, le succès des protocoles de thérapie

génique repose fortement sur l'identification de vecteurs de
délivrance de gènes avec une efficacité de délivrance significative, car
nous avons trouvé que les cellules dérivées de PDAC sont très
résistantes au transfert de gène. En effet, nous avons expérimenté
des vecteurs synthétiques (PEI) et viraux (adénovirus, SV40), qui ont
démontré l'administration de gènes aux cellules PDAC et des preuves
d'efficacité thérapeutique, in vitro et in vivo
Cependant, la faible efficacité du transfert de gêne utilisant PEI 5,7,
l'immunogénicité inhérente de l'adénovirus 8 et les obstacles de
fabrication des vecteurs SV40 9 remettent en question l'utilisation de
ces vecteurs dans les essais cliniques. D'autre part, nous avons
récemment découvert que les vecteurs lentiviraux (LV)
démontraient la plus haute efficacité et fiabilité pour inhiber la
prolifération des cellules PDAC in vitro et in vivo, et le LV élu
comme vecteurs prometteurs de gènes pour la thérapie génique
PDAC

L'intégration du VIH-1 est déterminée par la capacité du complexe de

pré-intégration lentivirale (PIC) à pénétrer dans le noyau cellulaire.
Les principaux composants protéiques de ce complexe sont la
transcriptase inverse du VIH, la protéine matricielle, la protéine
accessoire vpr et l'intégrase virale (IN) qui interviennent à la fois dans
l'importation nucléaire et l'intégration du génome lentiviral dans
l'ADN hôte (Philpott, 2007 # 7}. En raison de sa multiplicité de
fonctions, HIV IN ne peut pas être complètement supprimé, mais
différentes classes de mutations ont été conçues pour empêcher
l'intégration20. Bien que l'intégration ait été considérée comme
essentielle pour la stabilité et l'expression virales, des études
récentes menées par plusieurs groupes ont montré une expression
génique efficace in vitro et in vivo en utilisant des vecteurs lentiviraux
défectifs pour l'intégration (IDLV) 21. Plus précisément, les mutations
de classe I des résidus D64, D116 et E152 dans HIV IN inhibent
spécifiquement l'intégration de l'ADN viral dans le génome de l'hôte,
sans réduire la synthèse de l'ADN, ni perturber les fonctions Gag-Pol
21. Dans ce travail, nous évaluons l'efficacité des IDLV pour le
transfert de gènes dans les cellules PDAC d'origine humaine. Nous
avons constaté que les IDLV peuvent être produites à des niveaux
élevés suivant des protocoles de routine, transduire des lignées
cellulaires PDAC avec une grande efficacité pour assurer l'expression
des gènes transitoires sans intégration résiduelle. Enfin, les NILV
thérapeutiques ont montré des preuves préliminaires d'efficacité en
inhibant la prolifération des cellules PDAC lorsqu'elles étaient
combinées à une chimiothérapie. Cette étude découle du
développement d’IDLV pour la thérapie génique de PDAC.

Matériel et méthodes

1-Cellules

Les cellules Capan-2 et Capan-1  cellules cancéreuses pancréatiques humaines

(Capan-1, Capan-2, sont cultivées dans un milieu RPMI additionné de

10% de sérum de veau foetal, de L-glutamine, d'un cocktail

antibiotique et antimycosique (Invitrogen) et de Plasmocin®
(InvivoGen). 293 FT Les cellules rénales embryonnaires humaines variante
importante. Il contient le grand antigène T de SV40 qui permet la réplication épisomique de
plasmides transfectés contenant l'origine de réplication SV40. Cela permet l'amplification
des plasmides transfectés et l'expression temporelle étendue des produits géniques
souhaités

, Mia PACA-2 et Panc-1 sont cultivées dans du DMEM contenant 4,5 g

/ L de glucose (Invitrogen), 10% de sérum de veau foetal, de la L-
glutamine, des antibiotiques, Fungizone® et Plasmocin® (InvivoGen).
Les lignées cellulaires sont cultivées dans un incubateur humidifié à
37 ° C dans 5% de CO2.

Éthique et protocole expérimental.

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées selon les

lignes directrices éthiques nationales pour la recherche
expérimentale et le protocole # 05/1037/12/13 a été approuvé par le
comité éthique régional Midi-Pyrénées pour l'expérimentation
animale.
Des Mia PACA-2 humaines dérivées de PDAC ont été implantées par
voie sous-cutanée chez des souris athymiques

). Des vecteurs IDLV D64V codant pour le copGFP ont été injectés
dans des installations de sécurité animale de niveau 2 dans des
tumeurs à croissance exponentielle 15 jours après l'induction Les
animaux témoins ont reçu du PBS. Au moment de l'injection, la taille
de la tumeur était de 125 mm3 ± 19 mm3. Dans des groupes
expérimentaux sélectionnés, les tumeurs ont reçu une seconde
injection quatre jours plus tard. Sept jours après l'injection de IDLV,
les animaux ont été tués et la tumeur a été dissociée comme décrit
précédemment. 13. Des cellules positives à la GFP ont été détectées
par FACS. Une partie des tumeurs ont été congelées dans de l'azote
liquide et conservées à -80 ° C avant l'extraction de l'ARN en utilisant
Trizol (Thermo) et RT pour l'expression de copGFP en utilisant
l'enzyme Revertaid (Thermo), la polymérase Phuions Taq (New
England Bioloabs) et Forward ( 5'-CTTCTACCACTTCGGGACCT-3 ') et
Reverse (5'-TCTTGAAGTGCATGTGGCTG-3') amorces pour CopGFP
conçu avec le logiciel Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.net/)

Plasmids, Vector cloning, production and titration:

Les plasmides lentiviraux dérivés de pCMVA8.91 avec WT HIV-1 IN,

HIV-1 IN muté D64V et HIV-1 IN muté D116N ou codant pour Gaussia
Luciferase étaient un don aimable du Dr E. Ravet

Le vecteur d'ADN TRIP-ΔU3-EF1a-EGFP, codant pour EGFP, a été

décrit ailleurs. 10. L'ADNc de CopGFP et DCK a été amplifié par PCR à
partir de pMIRZIP-a-miR-21 13 et de cellules pancréatiques normales,
respectivement, et clone dans pPS- EF1-LCS-T2A (Système
Biosciences) suivant les recommandations du fabricant. Le clonage
réussi a été vérifié par séquençage. Des vecteurs lentiviraux à
replication déficiente et auto-inactivants ont été produits, concentrés
et titrés comme décrit ailleurs 13. Brièvement, des particules
lentivirales ont été produites dans une installation BSL-3 (INSERM
U1037, Toulouse) en utilisant des kits Lenti-SmartINT et Lenti-
SmartNIL (Invivogen) pour la production de LV parentale et IDLV,
respectivement, en utilisant des cellules 293FT (Invitrogen), en
suivant les recommandations du fabricant. Les particules lentivirales
ont été concentrées en utilisant des dispositifs de filtration Vivaspin
(Vivaspin) ou par ultracentrifugation et stockées dans une solution
saline tamponnée au phosphate (PBS) à -80 ° C. Les titres viraux ont
été déterminés sur des cellules HT1080 et exprimés en unité de
transduction / ml (TU / ml) comme décrit ailleurs. 10. Les
concentrations de vecteur ont été quantifiées par p24 ELISA (Ingen).
Tous les lots ont été contrôlés par réplication sans virus après
transduction des cellules 293FT et analyse des extraits cellulaires et
surnageant de culture pour la présence de p24, jusqu'à 3 passages
(10 jours) en culture