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Immunologie et technologies immunologiques

COMPTE RENDU TP3:

Par  : Ali chemkhi


Seif cherif
G4 _ bio 2/2

2017/2018
 Etudes des fonctions effectrices des lymphocytes :

Les lymphocytes B sont relativement faciles à analyser via les anticorps. La nature membranaire du
récepteur des lymphocytes T, le TCR, rend leur étude plus complexe.

1.Détermination de la fréquence de lymphocytes Ag- spécifiques

Méthode des dilutions limites : Les lymphocytes isolés sont répartis dans une plaque 96 puits avec
des concentrations décroissantes en lymphocytes dans les puits. Une fois cette répartition effectuée,
on ajoute l'antigène et on mesure le nombre de puits dans lesquels il n'y a aucune réponse à
l'antigène : c'est à dire qui n’ont reçu aucune cellule spécifique de l'antigène. On trace un graphique :
pourcentage de cultures négatives en fonction du nombre de cellules.

ELISPOT :

L'ELISPOT est un dérivé de la technique ELISA. Une population de lymphocyte T est stimulée par un
antigène. Afin de compter le nombre de T qui réagissent à cet antigène, on va mesurer la sécrétion
de cytokine. Pour cela, on utilise des plaques de test ELISA qui possèdent des anticorps dirigés contre
la cytokine d'intérêt au fond du puits. On ajoute la population de lymphocytes stimulés. Les
lymphocytes qui produisent la cytokine d'intérêt sont fixés au fond du puits et les autres non. Au
bout d'un certain on enlève les cellules et on utilise un anticorps secondaire détectable dirigé contre
la cytokine. On verra un marquage tout autour de la position où était fixé le lymphocyte activé :
chaque spot correspond à un lymphocyte activé par l'antigène.

2. Analyse de la spécificité d'un TCR

Utilisation de tétramères de CMH : peptide : Identifier la spécificité antigénique d'un LT est rendu
complexe par le fait qu'il ne reconnaît par un antigène soluble mais un peptide complexé au CMH et
qu'en plus l'affinité entre les deux est assez faible. Des complexes CMH peptides peuvent être
produits avec à leur extrémité une molécule de biotine. Cette biotine reconnaît très fortement la
streptavidine, une protéine tétramérique qui peut être rendue fluorescente. On arrive ainsi à
fabriquer des tétramères de CMH-peptide et l'avidité d'un LT pour ce complexe est assez forte pour
être détectée.

3. Mesure de la capacité de réponse d'un lymphocyte

Mesure de la capacité de réponse d'un lymphocyte Capacité de prolifération : On peut mesurer la


prolifération d'une population cellulaire en incorporant à l'ADN pendant la phase de réplication de la
thymidine tritiée. Si le taux de thymidine tritié incorporé augmente c'est que les cellules se sont
multipliées. On peut mesurer la capacité d'une population lymphocytaire à se multiplier en utilisant
des mitogènes généraux ou mesurer l'expansion clonale en utilisant un antigène à tester.

Tester la cytotoxicité : Pour mesurer la cytotoxicité d'une population de LT, il faut être capable de
mesurer leur capacité à tuer des cellules cibles qui portent le complexe CMHI-peptide correct. Pour
cela, on met en contact les T8 à tester et les des cellules cibles qui ont pré-incorporer soit du
chromate de sodium radioactif (intracellulaire) soit de la thymidine tritiée (ADN). Si la cellule est
tuée, le chromate de sodium radioactif est libéré dans le milieu et son taux peut être mesuré. De
même si la cellule est tuée, l'ADN est fragmenté et on peut mesurer ce taux de fragmentation en
séparant les chromosomes complets des fragments d'ADN.
Tester l'activité T CD4+ : Pour tester l'activité des lymphocytes T auxiliaires, on ne peut mesurer que
les cytokines produites ou les signaux co-stimuateurs de surface. L'expression de ces protéines peut
être testée en utilisant différents types de marquage via des anticorps monoclonaux, la technique
d'ELISPOT ou encore de taux de ARNm pour la protéine d'intérêt dans la cellule via la technique de
QT-RT-PCR.

4. Phénotypage d'une population

Afin d'obtenir un panel complet des gènes exprimés dans une cellule, on peut utiliser des micropuces
d'ADN (DNA microarray). Les séquences des différents gènes sont adsorbées sur une puce. L'ARNm
d'une population lymphocytaire est extrait et amplifié par RT-PCR puis on réalise une hybridation
entre l’ADNc et les gènes de la puce. On peut ainsi déterminer grâce à des marquages fluorescents
les gènes exprimés.

 Reparution des lymphocytes (les proportion sont relative à la composition de chaque


compartiment)

LT LB NK
Sang périphérique 70-80% 10-15% 10-15%

Moelle osseuse 5-10% 80-90% 5-10%

Thymus 99% <1% <1%

Gonflions 70-80% 20-30% <1%

Rate 30-40% 50-60% 1-5%