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2017/2018

Module d’Immunologie: Technique immunologique

RÉACTIONS D’AGGLUTINATION

Dr. Mohamed Lyes ZELTNI


Laboratoire d’Immunologie
CHU DE BLIDA
Plan
I. INTRODUCTION
II. DÉFINITION - PRINCIPE
III. LES PARAMÈTRES DE RÉACTION
IV. LES DIFFÉRENTS TYPES D’AGGLUTINATION
1. Agglutination directe ou active et Applications
2. Agglutination indirecte et Applications
3. Agglutination passive et Applications
4. Inhibition d'agglutination et Applications
V. Avantages et inconvénients
I. Introduction
 Par contact entre le paratope de l’anticorps et l’ épitope de l’antigène, il
se forme le complexe antigène-anticorps.

 Quand l’Ag est particulaire, taille comprise entre 0.1 et 10 micron


(globules rouges, globules blancs, plaquettes, spermatozoïdes, micro-
organismes ou billes de latex  les complexes forment des agglutinats.
II. Définition - Principe

 L’ agglutination : c’est la capacité d’un anticorps a former des agglutinats


visibles avec les antigènes particulaires (ex. : agglutinats d’ hématies) ;

 C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag


portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces
particules permettant leur réunions en amas.
III. Les paramètres de réaction
1. Les Ac ;
– dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables de produire une agglutination
des particules en suspension dans un milieu salin de [NaCl] = 0,15 M.
– dits non-agglutinants sont incapables de provoquer une agglutination dans ces
conditions.
– la multivalence est indispensable

2. Les Ag ; il existe une relation entre l’agglutinabilité et :


– le nombre de sites antigéniques
– leur localisation

Figure 1:Ags multivalents permettent la réticulation du


réseau
III. Les paramètres de réaction
3. Concentrations de l’ Ag et de l’Ac

Phénomène de prozone

 A forte concentrations d’Acs, le nombre de sites de liaison de l’Ac peut excéder celui des
épitopes antigéniques

 Les Acs ne se lient à l’Ag que d’une façon univalente ,Il n’y a donc pas de formation de
l’agglutination

 S’observe avec certains sérums, anti-brucelliques par exemple .

 Disparaît en présence de concentrations salines élevées ou après adjonction de certaines


protéines telles que l’albumine

 Particularité utilisée pour la titration des Acs dans certaines infections

 Le même phénomène se produit en excès d’Ag.


III. Les paramètres de réaction
4. facteurs physico chimiques
 Deux forces antagonistes jouent un rôle dans l’interaction des particules
entre elles :
1. la tension interfaciale, qui tend a agréger les particules entre elles.

2. la force de répulsion (prédominante), a effet oppose, elle provient des


charges électriques identiques des particules.

 La force de répulsion est fonction du potentiel ζ (-16 mV pour [NaCl] =


0,15 M). Lorsque les Ac recouvrent les GR, l’état électrique est modifie, en
cela les IgM s’ avèrent plus efficaces.
III. Les paramètres de réaction
5. Facteurs influençant l’agglutination: (2)

• Une température élevée entraîne une agitation moléculaire importante et


augmente la probabilité de rencontres intermoléculaires. L'agglutination
est rapide à 37 °C mais la quantité d'anticorps agglutinés est plus
importante à basse température (après 24 h), d'où la notion d'anticorps
chauds et d'anticorps froids.

• Le pH, optimum entre 6 et 8

• La force ionique (effet quasi nul), elle contrarie l’union Ag-Ac mais favorise
la formation du reseau (par la diminution du potentiel ζ).
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
1. Agglutination directe

• Résulte de l’union spécifique entre un Ac agglutinant et un

Ag particulaire appartenant naturellement à la particule.

• Elle peut se faire en tubes, en microplaques ou sur lame

• peuvent etre qualitatives ou quantitatives (la dernière

dilution du sérum ou l’on observe encore une agglutination).


IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
1. Agglutination directe

Sérum+bactéries

Réaction positive Réaction négative

Réaction positive
Réaction Négative
Réaction agglutination en tubes Réaction d’agglutination sur plaque
Figure 2

Réaction en tubes: Réaction sur plaques


Mélange du sérum étudié et des antigènes Dépôt d’ une goutte de sérum et de suspension
figurés(hématies, bactéries)sont mélangés antigénique. La lecture se fait à l’œil nu ou au
Formation d’un culot de sédimentation. microscope.
Après incubation, on agite légèrement le tube. La Formation d’amas plus ou moins volumineux
lecture se fait soit à l'œil nu, soit au miroir concave Réaction positive
grossissant. En cas de réaction négative, la préparation reste
La réaction d’agglutination se présente comme une homogène
fragmentation.
Des tubes témoins ( positifs et négatifs ) sont
nécessaires à l’interprétation correcte des résultats.
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
1. Agglutination directe
Applications:
 Détermination des groupes sanguins érythrocytaires
les Acs anti ABO IgM naturelles sont chargées négativement et vont attirer les cellules positivement
chargées.

Les globules rouges du sang possèdent à leur surface l’épitope A et/ouB ou aucun de ces
deux épitopespes

Test de Beth-Vincent Epreuve de Simonin-Michon

identification des AG érythrocytaires identification des AC sériques

Figure 3
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
1. Agglutination directe

Applications(suite)

 Test de COOMBS direct: Réaction d’hémagglutination en 1 temps

 Mise en évidence d’Acs anti globules rouges lors d’une incompatibilité rhésus foeto
maternelle responsables d’une anémie hémolytique du nouveau-né

 Mise en présence des hématies du nouveau–né et d’un immunsérum anti immunoglobulines


humaines ou des Acs anti C3,dans le but de mettre en évidence la présence d’Acs maternels
dirigés contre l’Ag D fixés sur les hématies du nouveau-né

Figure 4
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
1. Agglutination directe
Applications(suite)
 Sérologie en bactériologie et parasitologie( Salmonella, Shigella, E. coli, Enterophath
ogènes…) figure 5
 Titration des anticorps(étude semi quantitative)
Série de tubes contenant des quantités fixes d’antigène et des dilutions successives du sérum. La
dilution contenue dans le dernier tube donnant encore une agglutination franche qui
détermine le titre du sérum. Dans l’exemple suivant ,le titre du sérum testé est de 1024
Figure 5: Test d’agglutination pour les anticorps Brucella abortus

On observe dans cet exemple deux zones de dilution : prozone (éprouvettes1 et 2) ,et1 zone
d’agglutination (éprouvettes 3 à 9)
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
2. Agglutination indirecte

 Elle se produit entre un Ac non agglutinant et un Ag faisant normalement partie


intégrante de la particule, en faisant appel a un artifice.
 De façon générale, on peut obtenir une agglutination avec des Ac non agglutinants en
diminuant le potentiel ζ.

1. Ajout au MR des macromolécules qui pontent les Ac unis a des cellules voisines. ex la BSA,
le Dextran, le Ficoll…

1. Hydrolyse des glycoprotéines présentes a la surface des cellules par protéases (la papaïne,
la fucine, la bromeline, la trypsine…). Leur action permet la diminution de σ (libération de
NANA), une meilleure accessibilité des Ag (mise en place de liaison hydrophobe) et une
redistribution des récepteurs aux Ag.

2. Utilisation Ac anti-Ac
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
2. Agglutination indirecte
Applications:

A. Phénotypage Rhésus

Milieu réactionnel comporte afin de réaliser l’agglutination:

GR du patient + IgG anti D + IgG anti Ig Humaine

• Réalisation à chaud (37°C) en présence de BSA


IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
2. Agglutination indirecte
Applications

B. Test de Coombs Indirect: effectué en deux temps


Mise en évidence d’Acs qui ne sont pas naturellement agglutinants dans le diagnostic
de maladies hémolytiques auto immunes médicamenteuses ,post infectieuses ou post
immunisation anti rhésus

Test de Coombs indirect


+ +

anti-IgG
Sérum de la
GR témoin O mère humaines
Rhésus positif IgG Anti RH
AGGLUTINATION +
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
3. Agglutination Passive

 Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble, mais rendu particulaire par

fixation sur un support :

1. Les billes de latex ; l’Ag est fixe par simple contact (pH 8,2)

2. Les hématies ; l’Ag est fixe par simple contact, par traitement a l’acide tannique, par

fixation chimique (glutaraldehyde, di-nitro-chloro-benzene…) ou par fixation

immunologique (cas des Ac diriges contre des epitopes du GR).

Inconvénients :

- fragiles, elles s’ hémolysent en 3 semaines (utilisation d’ hématies formolées, stables


plusieurs mois a 4°C)

- elles portent une mosaïque d’Ag


IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
3. Agglutination Passive

Applications
 Ag soluble
1. Réactions au latex Test de Singer et Plotz
 Les particules de latex de polystyrène ont de multiples avantages
 Antigéniquement inertes et peu fragiles.
 les particules peuvent avoir trois diamètres différents : 1,17 – 0,20 ou 0,81 m habituellement utilisée.
 Par simple contact à pH 8,2, on fixe un antigène donné sur les particules de latex on ajoute ensuite le
sérum à étudier s’il contient l’anticorps spécifique de l’antigène, il s’ensuit une agglutination des
particules de latex.
 Recherche du facteur rhumatoïde
 Réaction d’agglutination sur lame à l’aide de particules de latex sensibilisées par des IgG humaines
 Le FR = auto-anticorps d’isotype IgM, et plus rarement d’isotype IgG ou IgA.
 Il reconnaît les déterminants antigéniques portés par la partie Fc des IgG humaine et de certaines
espèces animales.
 Dosage de la CRP
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
3. Agglutination Passive
Applications

Ag soluble

L’Ag est fixé aux particules de latex par simple contact à pH 8,2

Sérum contenant le
facteur rhumatoïde

( IgM anti-IgG )
AGGLUTINATION +

Recherche du facteur rhumatoïde


Test au latex
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
3. Agglutination Passive
Applications

2. La réaction de Waaler-Rose

Réaction d’Hémagglutination utilisant des globules rouges de moutons ou des GR humains O


Rhésus négatif

 Recherche du facteur rhumatoïde (FR)

Sérum à tester + IgG lapin anti-GR de mouton + GR mouton

Si présence du facteur rhumatoïde agglutination des GR ou hémagglutination

Réalisée dans une microplaque à fond rond ou en V


IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
4. Inhibition de l’agglutination

1-Mécanismes

Compétition entre un Ag libre ,du sérum étudié , et le même Ag fixé sur une particule.

 Dès 1941, Hirst a pu ainsi démontrer l’action agglutinante du virus grippal sur les globules
rouges de l’embryon de poulet.

 Mais si, aux préparations virales, on ajoute un sérum contenant des anticorps actifs contre le
virus de la grippe, les globules rouges introduits ultérieurement ne sont plus agglutinés.

2-Applications

 Diagnostic immunologique de grossesse. La grossesse entraîne le passage d’hormones


gonadotropes dans les urines ( hCG ).

 Diagnostic sérologique d’un certain nombre d’infections virales

 Détection de drogues illégales


IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
4. Inhibition de l’agglutination
2-Applications

 Dgc de la grossesse  (↗hCG ) dans les urines


L’anti-sérum anti HCG est d’abord mis en présence des urines de femme présumée enceinte.
En cas de grossesse, les hormones gonadotropes contenues dans les urines se combinent aux
anticorps de l’anti-sérum, qui ne sont plus disponibles pour agglutiner.
 les hématies (réaction en tube lecture au bout de 2 heures )
 les particules de latex (réaction sur lame, lecture au bout de 2 minutes), sensibilisées avec
des hormones gonadotropes
Ces techniques permettent de faire le diagnostic de grossesse environ 22 jours après la
fécondation. La fiabilité de ces tests est en général supérieure à 95%.

Tableau 1: Iterprétation
duTest de grossesse
IV. LES DIFFÉRENTS RÉACTIONS D’AGGLUTINATION
4. Inhibition de l’agglutination

2-Applications

 Diagnostc d’une infection rubéolique

• L’Ac présent dans le sérum testé ,va se fixer sur le virus et abolir les propriétés
hémagglutinantes du virus

• L’inverse de la dernière dilution sérique montrant une inhibition de l’hémagglutination est le


titre du sérum.Un titre supérieur à 10 (dilution au 1/10)indique une immunisation anti
rubéolique.

 Détection de drogues illégales :cocaïne, héroïne….

• Echantillon d’urine ou de sang incubé avec des Acs spécifiques

• Addition de GR ou de particules recouvertes de la drogue recherchée

• L’inhibition de l’agglutination indique la présence de drogue dans le prélèvement étudié


Hémagglutination
Avantages et Inconvénients

La Réaction d’agglutination

Plus sensible que la précipitation

Spécifique et facile de réalisation

Elle ne permet pas de quantifier les Ags ou Acs étudiés

Méthode qualitative et semi quantitative puisque seule une titration de l’Ac ou de l’Ag
recherché est possible
En resumé

Réaction Active ou indirecte passive Inhibition de


d’agglutination directe l’agglutination
Ac agglutinant Non agglutinant/ Agglutinant/
agglutinant Non agglutinant non agglutinant

Ag particulaire particulaire soluble particulaire


/soluble
Artifice non oui oui oui