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MÉTHODE D’ÉTUDE EN HISTOLOGIE

¤ Médecine européenne basé sur des faits, recherche éléments diagnostics et le suivi (contexte,??,examen)
¤ Histologie = études des tissus normaux (anatomie microscopique) = compréhension des dérèglements menant aux maladies
(physiopatho = tissu anormaux).
Utilisation de
¤ Prélèvement cellulaire par frottis, brossage ou ponction/aspiration directe ou guidé microscope et
¤ Prélèvement tissulaire par biopsie (directe, radioguidé, apres endoscopie), chirurgie (exérèse, biopsie), via autopsie l’oeil
→ MO : utilise des photons avec pouvoir séparateur de 0,2µm (distance MIN pour etre distinguer). Différents types :
lumière directe ou inversée, contraste de phase, polarisé, confocal, épifluorescence, fond noir → Cell, bactéries, noyaux
→ ME : utilise flux d’électron, pouvoir séparateur de 0,2nm: transmission et balayage → organite, virus, jct
¤ Organe : entité anatomique macroscopique, comportant toujours plusieurs variétés de tissu
¤ Viscère : organe logé dans l’une des cavités de l’organisme (thorax, abdomen). Il y a viscère plein (= pas de cavité centrale ou
lumière→foie, rate) et viscère creux (= présence d’1- plusieurs lumières → estomac, intestin, poumon, cœur)
¤ Système : Ensemble de cell, tissus, organes définissant des connexions hormonales, fonctionnelles, anatomiques…

I. gestion de prélèvement tissulaire

Décider rapidement de l’action à faire car urgence → extrait de l’individu en stress et donc cell en anoxie = dégradation tissu→
état frais = étape pré-analytique où la décision doit etre prise par le préleveur (médecin, chirurgien) pour conditionner le
prélèvement et avoir le meilleur résultat (Etape d’observa° macroscopique de la pièce non fixé)→ anticiper sur les besoins et les
moyens ou technique d’urgence + sélection des fragments d’intérêts (1x1mm pour ME, et 5x5mm pour congélation)→ choix entre
standard (fixation définitive irréversible pour stopper la dégradation → prépare au MO → opt° pas possible après) ou option :
apposition (obtention préparations cell pour exam d’empreinte cyto) ou congélat° (préservation temporaire)

APPOSITION (étude cell):
¤ Sélection de la région d’intérêt sur le fragment tissulaire, Apposition délicate pour empreinte sur une lame de verre et Analyse
cytologique (uniquement cell de surface se colle sur la lame)
¤ Permet : Congélation avant fixation - Techniques histo-enzymatiques avant fixation - Fixation et coloration rapide pour examen
extemporané - Fixation et HIC - Fixation spéciale FISH
!!! ne permet pas d’étudier l’architecture du tissu !!! → inconvénient : cell qui se fixe pas, ya que cell surface

CONGELATION (étude histologique):
Ce n’est pas une fixation mais une préservation temporaire. Elle doit etre RAPIDE (-de15min pour ARN et qq h pour ADN) soit
dans de l’azote liquide, soit dans un bain isopentane refroidi à -80°C pour une bonne morpho. Un RNA later peut etre utiliser pour
le transport jusqu’à cryoconservation (permet pas coupe apres → conserve A.N 24h à T° ambiante ou 7jr à 4°).
Gestion de prélèvement tissulaire congelé : sélection de la zone d’intérêt pour empreinte cytologique, congélation suivie de coupe
pour examen extemporané qd état frais→SINON conservé à -80°C, réchauffer à -20°C, enrobage à la colle OCT, coupe au
cryostat, séchage, fixation rapide optionnel à l’éthanol, montage, interprétation rapide en qq min + compatible avec examen
extemporané avec résultat préopératoire et geste chirurgical.
Elle aide au diagnostic opératoire immédiat et pour des techniques non réalisable à partir de tissu fixé (histoenzymo, IHC,
extraction, ect), permet recherche d’accumulation lipidiq, permet d’archiver des échantillons à visée sanitaire (Lymphomes,
Myélomes, Leucémies,Tumeurs cérébrales et pédiatriques, Sarcomes → pronostic) et de recherche (consentement du patient). La
congélation détériore la morpho (morpho passable), coute cher →on fait de la congéla° qd on peut pas faire autrement !!

STANDART :
Permet de stopper la dégradation du tissu, d’immobiliser les constituants tissulaires et cellulaires et bloquer les réactions
enzymatiques/tue cell + permet technique histo et coloration ultérieur. Le mécanisme d’action est complexe et dépend du fixateur :
précipitation, polymérisation, coagulation des protéines et mise en place de liaisons covalentes. Les fixateurs simples sont pas
utilisé comme éthanol, acétone. Mais les fixateurs complexes mélangés le sont, le formol neutre tamponné est le + utilisé.
Ensuite, il y a le liquide Bouin (acide+formol :morpho excellente, adn/arn dégradé, IHC limité, indication ajd limité), AFAA
(morpho excellente, adn/arn fragmenté, IHC ok).
La fixation se fait par immersion dans fixateur par perfusion/vascu, ou insufflation/poumon. Elle se fait dès que possible et sa
durée varie en fct du type, volume du prélèvement et du fixateur (7 vol fixateur/ 1 vol tissu).
La macroscopie : description anatomique de la pièce – Iconographie -sélection et identif fragment interet - Taille du prélèvement
dépend de l’équipement standard : 30 x 20 x 3mm maximum (info mise sur cassette, existe grande cassette)- Mesure , description
de la tumeur et sélect° zone non nécrosé
La décalcification : tjrs après fixation, obligatoire sur tissu calcifié (os, dent, BOM) pour permettre après la coupe→ plonge le
fragment fixé dans un tampon chélateur de calcium de type EDTA et peut etre accéléré par chaleur ou électrolyse (nuisible pour
l’IHC et HIS, On n’est pas obligé de décalcifier pour congeler).
L’inclusion donne une consistance ferme favorisant la coupe en le plongeant dans la paraffine liquide à plus de 56°C en 3
grandes étapes en qq h : l’automatisé (déshydratation dans un bain d’alcool pour éliminé fixateur, clarification pour éliminer
éthanol et imprégnation dans paraffine pour imprégner le tissu de celle-ci), l’enrobage manuel (fragment d’intérêt mis en contact
avec cupule métallique + paraffine + cassette plastique + refroidi = solidifier), puis le démoulage manuel (séparation mécanique
du cupule métallique réutilisable et du bloc de tissu en paraffine avec cassette/support).
La coupe est faite après inclusion, assez dure pour etre découpé. La coupe se fait au microtome (système d’incrémentation) de 3 à
5 µm d’épaisseur, on l’étale dans l’eau à 37°C, puis sur lame de verre, séchage sur 1 platine chauffante = adhésion paraffine-lame.
La coloration : Tissus n’ont pas de coloration naturelle (sauf tissus pigmentés : mélanine, hémosidérine, pigment exogène) →
coloration nécessaire pour les observer. D’abord, on fait du déparaffinage (bain de toluène et de xylène -concentré pour enlever
la paraffine), une réhydratation (bains d’alcool – concentrés), ajout colorant (HES, éosine, safran), déshydratation (bain alcool
+ concentré) et observation au MO.
Observation : l’hématine est un colorant basique a affinité pour les structures acides (acides nucléiques, ribosomes → noyau en
violet) il est basophile. l’éosine est un colorant acide a affinité pour les structures basiques (protéines, derme → Cytoplasme en
rose), il est acidophile. Et le safran se fixe sur collagène du tissu conjonctif (orange).

II. Gestion de prélèvement cellulaire

→ apposition, frottis, brossage, liquide cytospin (centrifugation de liquide peu cellulaire)


→ Fixation rapide = éthanol, méthanol, acétone, laque ; fixateur souvent inclus dans la coloration
→ Coloration rapide sans bains de toluène et xylène pcq pas de paraffine
→ Interprétation rapide (qq min), compatible avec l’examen extemporané
→ Autres techniques : FISH sur noyau interphasique, Immunocytochimie, Avant fixation : histoenzymatique, coloration spéciale

III. Microscopie électronique à transmission

Grossi x500 à x200 000, pouvoir de 0,2nm, identifie organite, jonction, myéline, MEC, nécessite une technique de préparation
spécifique (fixation, inclusion, coupe), seule une très petite surface peut etre étudié. Il se décide au moment de la macroscopie sur
pièce non fixé :
1. Macroscopie : sélection de fragments de moins de 1mm
2. Fixation : bains de glutaraldéhyde pendant 1h, puis tétroxide d’osmium → immer° ds fixateur
3. Inclusion : sur résine d’époxy
4. Coupe semi-fine à l’ultra-microtome 1µm des blocs de résine pour coloration au bleu de toluidine et observation au MO et
sélection des zones d’intérêt pour M.E
5. Coupe ultrafine au rasoir diamant 50nm – 0.5 µm → PAS de coloration mais contraste par sels de plomb et d’uranium (option)
→ principe : source d’electron, accélérateur et capteur → image en noir et blanc
ME à transmission étudie coupe, à balayage étudie relief de surface et à balayage après cryofracture étudie relief et jonction cell

IV. simple coloration et coloration spéciale

• Coloration de Papanicolaou : Frottis de gynécologie (cytologie vaginal) avec reflet de l’imprégnation hormonale =
femme en cycle, ménopausée → Recherche de cellules anormales, MST → en bleu le noyau et cyto cell profonde et en
rose cyto cell superf

• May Grunwald giemsa (MGG) : Routine en hématologie, réalisé sur : frottis sanguin, aspiration/apposition de moelle,
ponction de liquide inflammatoire, coupe d’organe lymphoïde ou hématologique (biopsie ostéomédullaire BOM)→
Classification des cellules sanguines en fonction de leur morphologie et granulation → en orange, éosinophile, bleu
basophile, rose neutrophile et pourpre azurophile

• coloration vitale : cell vivante non fixé sans coloration → cell observé au microscope inversé à contraste de phase
(voit différent indice de réfraction= Détection des anomalies de motilité ciliaires ou mobilité des spz) ou au microscope
inversé à épifluorescence (= analyse de cultures cellulaires avec traceurs fluorescents)
Coloration au bleu de Crésyl = mise en évidence des réticulocytes du sang par marquage du RER

COLORATION SIMPLE AUTRE QUE HES : application sur coupe paraffine, congélation, lame cytologie
• hématéine seul : contre-coloration d’IHC et HIS, coloration bleue en fct des présence basophiles → architecture globale
• Trichrome de masson : montre collagène en bleu/vert
• rouge de Cyrius : colore collagène en rouge
• bleu de toluidine : repérage des composants cellulaires sur semifine (préparation M.E→ bleu) et métachromasie
donnant du rouge pour repérer mastocyte
• coloration réticuline pour mettre en évidence le réseau et vérifier son intégrité
• Bleu alcian : glycosaminoglycanes (cartilage), mucines en bleu
• détection Perls de métaux (fer par hémochromatose), ou cuivre, ca, pigment pour
maladie de wilson
neurohistologie Pourpre/magenta
• détection bactérie : coloration GRAM, de ziehl, de whartin-starry
• détection champignon : colo de Grocott
• coloration par diffusion d’huile : soudan rouge, soudan noir, red oil → que sur
tissu frais ou congelé → met en évidence l’inclusion lipidique (pas de clarification avant cryocoupe) → La fixation et
l'inclusion en paraffine empêche l'observation des inclusions lipidiques : VRAI. (la fixation seule non)
V. histoenzymologie et cytoenzymologie
Mise en évidence d’une activité enzymatique par l’intermédiaire d’un substrat devenant coloré après l’action de l’enzyme sur la
lame à partir d’une coupe ou d’une prépara° cell (uniquement tissu frai ou congelé)
VI. immunohistochimie et immunocytochimie

Principe de l’IHC : repérer des ANTIGENES d’intérêt à l’aide d’ANTICORPS → But : faire produire des AC spécifiques à des
animaux et les utiliser contre des ag pour les identifier sur des préparations. IHC permet d’exploiter la reponse immuno pour
produire AC, réaliser la liaison Ag-AC ou détecter 1 liaison.
Antigène = molécule capable d’activer le système immunitaire et de conduire à la production d’anticorps. Il a plusieurs épitope,
plusieurs AC peut se lier au meme épitope avec affinité différente, et un meme épitope peut etre sur des Ag différent (IHC difficile
pour ca : avoir le bon AC)
Epitope = site de l’antigène où se fixe l’anticorps
Anticorps = glycoprotéine sécrétée par les plasmocytes (1 plasmo = 1 type d’ag) capable de se lier spécifiquement à l’antigène,
en forme de Y avec fragment constant + domaine de reconnaissance de l’épitope. c’est un hétérotétramère à deux chaînes lourdes
et légères. Il y a les AC monoclonaux et polyclonaux.
l’ag est détecté comme étranger → produc AC → liaison Ag-AC par épitope → neutralisation et phagocytose
sérum= cocktail d’AC polyc différent dirigé contre des épitopes différents
¤ produc° d’ACpolyclonaux : créa° naturelle d’AC par 4injections→ sacrifice → recueil sérum = plusieurs clones (peu couteux,
mais risque de réaction croisé, quant limité de sérum, reproductibilité non garanti)

Technique monoclonal permet de fournir une quantité illimité et homogène avec 1AC
par clone, mais couteux, long, incertain.
Accès de l’AC à ag dépend du type de tissu prélevé, de la localisation de l’ag et de la
nature de la fixation. Qd coupe en congélation, + simple car pas de pb lié au lieu de l’ag
et x fixation possible. En cell, situation interm, il y a perméabilisation memb par
détergeant qd ag intracell. Et qd tissu fixé, difficile, fixat° définitive + démasquage
antiag (qd épitope inaccessible : digestion partielle par une protéase + chaleur = modif
conformation)

1) IHC directe et immunofluo

Technique : déparaffinage, réhydratation, disposition à la surface de la lame de la solution avec l’AC marqué par un traceur
fluorescent (=incubation), Couplage AG-AC, élimination avec une solution tampon de l’excès d’AC (=lavage) et Observation au
MO à fluorescence (lecture sous UV). → cytométrie en flux ou cytologie. c’est simple, sensible, peu de bruit de fond parasite
mais travail en fond noir dc voit que les traceurs.
Immunogold : technique idem sauf que le marqueur est l’or colloisal incubé avec prot A (1 er incubation, lavage, incube or, lavage,
lecture), s’observe au ME à transmission et utilisé que dans la recherche

2) IHC indirecte à plusieurs couches

Technique : Incubation du 1er AC avec l’AG, lavage, Incubation du 2ème AC marqué (enzyme le + souvent donnant réaction
coloré de type peroxydase ou phosphatase), lavage, lecture au M.O à fluorescence. Si le signal est trop faible, on peut amplifier
en incubant un AC secondaire biotinylé incuber avec avidine, laver, saturer à la biotine peroxydase, laver → Révélation par DAB
Possibilité de plusieurs couches, de doubles IHC à fluo et à immunoenzymatique. Il y a une importance des témoins + et négatif
pour l’interprétation. Le 2e Ac est d’espèce différente p/r au 1er AC

VII.Hydridation in situ HIS (cible : adn ou arn)

Détection d’acides nucléiques sur coupe à l’aide d’une sonde (=séquence


complémentaire marqué par un traceur) → détection de séquence virale comme
HPV en sonde froide, exploration du génome, détection ARNm dans cell. La
dénaturation de la sonde et de la cible par la chaleur et sol tampon efface les
structures 2nd (=simple brin). Si séquence complémentaire = hybridation stable.
Basé sur la complémentarité des bases azotées des acides nucléiques (C/G A/T
A/U). le lavage permet d’éliminer l’excès de sonde non hybridé (sonde
éliminé par lavage qd sequence non complémentaire = pas hybridation). La
sonde peut etre des oligonucléotides de synthèse, des fragments d’ADN
cloné, ou ARN de synthèse. Le traceur peut etre un radioélement détecté par
autoradiographie (recherche uniquement, long, délicat, sensible), un marquage
froid (détection par IHC avec Acanti-biotine ou anti-digoxigénine avec traceur
fluo/ME ou enzymatique coloré/MO) ou un fluorochrome en détection direct
sous UV et caméra.

FISH : étude de translocation chromosomique (utilise sonde de fusion : si elle


se superpose, il y a translocation) et recherche de modif de locus (sonde
encadrante ou de séparation → détecte noyau anormal avec réarrangement
équilibre de locus, ou anomalie nb locus ou locus avec amplification).