Electrophorèse des acides nucléiques

Principe

Elle consiste à séparer les acides nucléiques chargés négativement, sous l’effet d’un champ
électrique. Cette séparation se fait à travers un support ou une matrice qui est le gel d’agarose.
Les fragments les plus petits migrent plus rapidement que les fragments de grande taille.

Applications

1. Estimation du poids moléculaire de fragments d’ADN après digestion par des enzymes
de restriction.
2. Analyse d’ADN ou d’ARN après amplification par PCR
3. Séparation des fragments d’ADN avant le southern blot et d’ARN avant le northern
blot.

Gels utilisés en électrophorèse des acides nucléiques

C’est la concentration du gel qui détermine la taille de ses pores ; plus on veut un gel
discriminant, plus on augmente la concentration du gel et plus la vitesse de migration sera
réduite.
Le gel d’agarose est utilisé à une concentration de 0.5 à 2%. Il permet de détecter des
fragments de taille comprise entre 0.5 et 50 kb (500 à 50 000pb)  :

Ie : Gel d’agarose à 1% de 12cm de longueur 30 000 à 200pb

Généralement, le gel d’agarose est utilisé à une concentration de 1%.

Le gel de polyacrylamide est utilisé pour séparer des fragments de taille au dessous de 1kb
(1000pb).

Avantage d’utilisation du gel d’agarose

1. Utilisation aisée et peu couteuse

2. Plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide
3. Possibilité de récupérer l’ADN à fin de l’analyser par la suite

Agarose

C’est un polymère d’agar purifié. Un agarose de grande pureté a une solidification lente.

Tampon

Il existe un nombre très varié de tampon, le plus souvent utilisé, le TAE(tris. Acétate. EDTA),
le TBE (tris borate EDTA) et le SB(sodium borate).

TAE : il a un faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation des fragments
d’ADN de grande taille.
SB : inefficace dans la séparation des fragments de taille supérieure à 5kb mais grâce à sa
faible conductivité on peut utiliser un fort voltage (35v/cm) ce qui réduit significativement le
temps de migration.

Des fragments d’ADN avec seulement de quelques pb de différence sont séparés en utilisant
un gel d’agarose à 3% avec un tampon SB de très faible conductivité

Révélation

La méthode de révélation la plus courante est la révélation au BET. Ce dernier est un agent
intercalant (analogue de base) couramment utilisé comme marqueur d’AND. Lorsqu’il est
exposé aux UV, il devient fluorescent en émettant une fluorescence orange 20 fois lorsqu’il
est lié à l’ADN. On prend une photo par l’appareil numérique, on la développe par scanner.

Dans ce cas le BET doit être incorporé après préparation du gel et avant de couler la boite de
coulage.

Comme il est intercalant, il est fortement mutagène voire cancérigène par simple contacte
(donc il faut manipuler en portant des gants). De même que les UV sont mutagènes et peuvent
causer de graves brulures aux yeux (donc il faut utiliser des lunettes). Pour éviter ce risque, on
utilise un autre colorant (bleu de Nile) qui présente un double avantage : sécurité et on n’a pas
besoins d’utiliser les UV.

Dans ce cas, le colorant est utilisé après migration et rinçage à l’eau distillée.

Facteurs influençant la migration

Deux facteurs influencent la migration des acides nucléiques : la taille et la conformation

1. La taille est le seul paramètre qui détermine la vitesse de migration de l’ADN linaire.
2. Le deuxième paramètre est impliqué dans le cas de l’ADN circulaire qui présente trois
conformationS : superenroulée, relachée et souenroulée. La première conformation
migre plus rapidement que la troisième conformation. Cependant, si on utilise le
bromure d’ethidium la deuxième conformation se transforme à la première
conformation.
3. Le voltage : La vitesse de migration augmente par l’augmentation de voltage.
Cependant, si on augmente le voltage on doit utiliser un tampon à faible conductivité
sinon ça va fondre le gel.
4. La taille des pores du gel : les pores du gel se comportent comme un tamis qui freine
le déplacement des fragments d’ADN. L’augmentation de la concentration du gel
réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragments de plus petite taille,
les plus grosses molécules auront de la difficulté à avancer dans le gel et donc plus
elles seront retardées mais les molécules très petites, pourront avancer dans le gel sans
obstacle
Bleu de dépôt

Avant le chargement des échantillons d’ADN, on doit les mélanger avec le bleu de dépôt. Ce
dernier alourdit les molécules d’ADN pour qu’elles puissent bien tomber au fond du tube. Le
bleu de dépôt est composé de deux constituants : bleu de bromophenol et le cyanol xylène.

Le premier colorant marque le front de migration tandis que le cyanol xylène suit les dernières
séquences d’ADN qui ont migré.