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Southern blotting

Définition : C’est une technique d’hybridation sur support solide de type ADN/ADN qui consiste à
chercher et à identifier un fragment d’ADN présent parmi des milliers d’autres par utilisation d’une
sonde d’ADN marquée, complémentaire au fragment d’ADN à identifier (ADN cible).

Hybridation : C’est un processus de réassociation (renaturation) entre deux brins complémentaires


d’acides nucléique (ADN/ADN, ADN/ARN) dans des conditions données. Cette réassociation est due à
la complémentarité entre ces deux brins d’acides nucléiques.

Conditions de la renaturation
Pour que la renaturation puisse se faire, deux conditions doivent être satisfaites :
 Force ionique suffisamment élevée [NaCl]= 0.15-0.50µM pour éliminer les répulsions
électrostatiques des groupements phosphate des deux brins d’ADN.
 Température de renaturation est de 20 à 25 inférieures à Tm (température de fusion ou
melting tempreture)

Température de fusion (Tm) : C’est la température à laquelle 50% des liaisons hydrogènes sont
coupées (la moitié de l’ADN est sous forme simple brin). On parle également de la température de
demi-dénaturation. Elle est proportionnelle à la longueur d’ADN, à la force ionique et au %GC et
inversement proportionnelle au pH.

Fig 1 : Courbe de fusion d’ADN. La Tm est indiquée

Sonde : C’est un fragment d’ADN ou d’ARN marqué de séquence connue, utilisé dans la détection
spécifique de séquences cibles.
B
A D

A’
C
E

Fig 2 : Schéma général d’une hybridation moléculaire

Différents types de sondes


Sondes à ADN : génomique ou complémentaire d’un ARNm (sonde ADNc)
Sonde à ARN (ribosonde)
Propriétés d’une sonde
 Monocaténaire, complémentaire et antiparallèle à la séquence cible
 Sa taille varie d’une vingtaine à plusieurs centaines de nucléotides
 La sonde peut couvrir la totalité ou une partie de la séquence cible
 La sonde doit être repérable soit par marquage radioactif (sonde chaude) ou chimique
(sonde froide) dont le repérage dans ce dernier cas se fait par fluorescence, luminescence ou
coloration.

Etapes de la technique southern blotting


Sonde : ADN Cible : ADN (ADN phagique, plasmidique, nucléaire ou ADNc)

1/Digestion de l’ADN génomique par une ou plusieurs ER


2/Les fragments obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d’agrose

3/ Les fragments d’ADN qui se trouvent sur le gel d’agarose sont dénaturés in situ par une solution
de soude
4/Les fragments d’ADN dénaturés sont transférés (blotting) par capillarité sur support solide (filtre de
nitrocellulose ou nylon).
5/ Incubation de cette membrane dans une solution de sondes marquée dans des conditions
permettant l’hybridation.
6/ Lavage de la membrane pour éliminer les hybridations non spécifiques.
7/ Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique d’autoradiographie si la
sonde est marquée radio-activement.

Les bandes marquées obtenues correspondent à des fragments d’ADN complémentaire de la sonde
Différents cas d’hybridation

Si les deux brins qui s’hybrident sont complémentaires à 100%, l’hybride sera stable dans les
conditions de forte stringence (température élevée, force ionique faible).
Si les deux brins ne sont pas complémentaire : il n’ya pas d’hybridation.
Si la complémentarité est partielle, l’hybride formé sera instable dans condition de force
stringence et stable dans des conditions peu stringentes (température faible, force ionique
élevée).