Un análisis basado en sistemas de Plasmodium vivax Transcripción del ciclo de vida de

humanos a los mosquitos

La mayoría de los 250 millones de casos de malaria fuera de África son causadas por el
parásito Plasmodium vivax. Aunque los medicamentos pueden ser usados para tratar la
malaria por P. vivax, resistencia a los medicamentos se está propagando y no hay
vacuna disponible. Debido a que esta especie no puede ser fácilmente cultivado en el
laboratorio se añaden desafíos a la comprensión de la función de los genes de muchas
hipótesis en el genoma. Se aislaron los mensajes de transcripción de los parásitos que
crecen en la sangre humana y de los mosquitos, con la etiqueta de los mensajes y
mide cómo sus niveles para diferentes condiciones de crecimiento del parásito. Los
datos de 5.419 genes del parásito muestra grandes cambios a medida que el parásito
entre los humanos y los mosquitos y revela altamente expresado los genes cuyas
proteínas podrían representar nuevas dianas terapéuticas para las vacunas
experimentales. Descubrimos conjuntos de genes que probablemente juegan un papel
en las primeras etapas de la infección de hepatocitos. Encontramos diferencias
interesantes en los patrones de expresión de los diferentes parásitos de la sangre
etapa que puede estar relacionado con el estado de acogida y respuesta.

Resumen Top
Antecedentes
Hasta el 40% de la población mundial corre el riesgo de malaria por Plasmodium vivax,
una enfermedad que impone un problema de salud pública y la carga económica sobre
los países endémicos. Debido a que P. vivax produce formas latentes del hígado, la
erradicación de la malaria por P. vivax es más difícil de lo que es para P. falciparum. El
análisis genético de P. vivax es extremadamente difícil debido a las limitaciones del
cultivo in vitro. Para superar las barreras tradicionales a la biología molecular en P.
vivax, se examinaron los cambios transcripcional del parásito en muestras de
pacientes infectados y de mosquitos con el fin de caracterizar la función de los genes,
definir secuencias reguladoras y revelar nuevos genes candidatos potenciales vacunas.

Principales conclusiones
Hemos observado cambios dramáticos en los niveles de transcripción de varios genes
en las etapas del ciclo de vida diferentes, lo que indica que el desarrollo es
parcialmente regulada a través de la modulación de los niveles de mRNA. Nuestros
datos muestran que los genes implicados en procesos biológicos comunes o de la
maquinaria molecular son co-expresó. Se identificaron los motivos de secuencia de
ADN contra la corriente de genes co-expresó que se conservan en las especies de
Plasmodium que probablemente los sitios de unión de las proteínas que regulan la
transcripción fase específica. A pesar de su capacidad para formar hipnozoitos
encontramos que los esporozoitos de P. vivax mostrar el resultado de la expresión
estadio-específica de los mismos genes necesarios para la invasión de hepatocitos y el
desarrollo del hígado en etapa de otras especies de Plasmodium. Se demuestra que
muchas de las proteínas predijo exportados y los miembros de las familias
multigénicas muestran muy coordinada la transcripción también.

Conclusiones
Llegamos a la conclusión de que los datos genéticos de alta calidad de expresión
puede ser fácilmente obtenida directamente de las muestras de pacientes y que
muchos de los mismos genes no caracterizados que se aumentaba en las diferentes
etapas del ciclo de vida de P. vivax también aumentada en etapas similares en otras
especies de Plasmodium. También se ofrecen numerosos ejemplos de cómo la biología
de sistemas es un poderoso método para determinar la función probable de genes en
microorganismos patógenos que son descuidados por la indocilidad de
experimentación.

Autor Top Resumen

La mayoría de los 250 millones de casos de malaria fuera de África son causadas por el
parásito Plasmodium vivax. Aunque los medicamentos pueden ser usados para tratar la
malaria por P. vivax, resistencia a los medicamentos se está propagando y no hay
vacuna disponible. Debido a que esta especie no puede ser fácilmente cultivado en el
laboratorio se añaden desafíos a la comprensión de la función de los genes de muchas
hipótesis en el genoma. Se aislaron los mensajes de transcripción de los parásitos que
crecen en la sangre humana y de los mosquitos, con la etiqueta de los mensajes y
mide cómo sus niveles para diferentes condiciones de crecimiento del parásito. Los
datos de 5.419 genes del parásito muestra grandes cambios a medida que el parásito
entre los humanos y los mosquitos y revela altamente expresado los genes cuyas
proteínas podrían representar nuevas dianas terapéuticas para las vacunas
experimentales. Descubrimos conjuntos de genes que probablemente juegan un papel
en las primeras etapas de la infección de hepatocitos. Encontramos diferencias
interesantes en los patrones de expresión de los diferentes parásitos de la sangre
etapa que puede estar relacionado con el estado de acogida y respuesta.

Introducción Top
Los nuevos esfuerzos para combatir la malaria se han centrado en el objetivo de la
erradicación total. Aunque la mayoría de la atención está en el más mortífero
paludismo por P. falciparum Plasmodium, Plasmodium vivax es el más extendido
geográficamente parásito de la malaria humana causando un estimado de 80-250
million casos de malaria vivax cada año [1]. la malaria por P. vivax ha sido
tradicionalmente se encuentran fuera de las zonas tropicales y es endémica en
América del Norte y Europa hasta la introducción del DDT. A pesar de la gran carga de
enfermedad causada por P. vivax, se pasa por alto y se deja en la sombra de la enorme
carga de salud pública causados por P. falciparum en África subsahariana. La
percepción errónea generalizada de P. vivax como relativamente poco frecuente,
benigno, y de fácil tratamiento, explica que es casi completa desatendidas en toda la
gama de la investigación biológica y clínica. De hecho, la malaria por P. vivax y
amenaza seriamente a más gente que ha sido históricamente apreciado. Los informes
recientes [2] - [4] proporcionan abundantes pruebas que desafían el paradigma de que
la infección por P. vivax causa benigna de la enfermedad: la malaria por P. vivax puede
ocasionar síntomas graves similares a P. falciparum. presión selectiva para la
resistencia a la malaria ha tenido una gran influencia sobre el genoma humano y la
mayoría de los africanos son inmunes a la malaria por P. vivax, debido a mutaciones en
el receptor Duffy que los parásitos utilizan para invadir los glóbulos rojos.

Una diferencia fundamental entre P. vivax y P. falciparum es la formación de los

parásitos del hígado inactivo etapa llamada hipnozoitos que son resistentes a los
medicamentos schizonticidal que matan a los parásitos eritrocíticos etapa. A pesar de
la terapia con medicamentos schizonticidal, el paciente puede experimentar múltiples
recaídas meses o años después de la infección primaria. Los intentos de erradicar la
malaria depende de tener medicamentos eficaces y no tóxicos, que se dirigen a P.
vivax hipnozoitos hepática. Hypnozoite biología es poco conocida, pero probablemente
se relaciona con la persistencia del parásito en lugares donde las poblaciones de
mosquitos varían estacionalmente. Poco se sabe sobre lo que desencadena una
recaída, pero algunas cepas de forma diferente número de hipnozoitos y tienen
diferentes frecuencias de recaída, lo que puede estar correlacionada con la latitud [5].
Existe controversia sobre si hipnozoitos representan una etapa del ciclo de vida
diferente o simplemente representan un detenido primera fase exo-eritrocítica. Casi
nada se sabe acerca de la actividad metabólica en el hypnozoite, frustrando todos los
esfuerzos en el diseño justificación de drogas. El mecanismo de la droga sólo se conoce
para erradicar hipnozoitos, la droga de 8 aminoquinolina, primaquina, todavía no se
conocen con exactitud.

Mientras que los modelos de roedores han promovido nuestra comprensión del
desarrollo de Plasmodium hepática, no forman hipnozoitos. El único modelo disponible
para el estudio de la biología hypnozoite es la especie P. estrechamente relacionados
cynomolgi que debe ser estudiado en el macaco rhesus. Los estudios de la biología de
P. vivax siguen dependiendo de la obtención de parásitos eritrocitos etapa o
esporozoitos de los humanos infectados o primates no humanos o sus mosquitos
vectores, respectivamente. Las pruebas de drogas sensibilidad sigue siendo difícil. En
una época anterior compuestos fueron probados para la actividad contra hipnozoitos
de prisioneros que habían recibido la malaria [6]. Los exámenes toxicológicos in vitro
está limitada por las actuales dificultades en las técnicas de cultivo. Sólo unos pocos
manipulaciones genéticas de P. vivax ha sido un éxito [7]. Estos impedimentos han
desalentado a muchos investigadores de trabajar en P. vivax, y limitado el potencial
para el análisis genético molecular de esta etapa del hígado difícil de alcanzar.

Dado que el avance y retroceso métodos genéticos, que han sido poderosos en P.
falciparum, no están fácilmente disponibles para la investigación del genoma de P.
vivax, la genómica comparativa y virtuales métodos genéticos ofrecen las mejores
oportunidades para dilucidar por P. vivax función de los genes. perfiles de expresión
génica anterior de P. falciparum [8], [9] P. yoelii [10] a lo largo de muchas etapas del
desarrollo del ciclo de vida en el hospedador mamífero y insecto vector, y en etapas P.
vivax la sangre [11], [12], ha proporciona una visión fundamental en la biología del
Plasmodium y se ilustra cómo la función del gen se puede predecir sobre la base de
patrones de expresión génica durante el desarrollo. La potencia de este método es
asegurar que hay suficiente diversidad en los parásitos diferentes etapas para permitir
la delimitación de distintos patrones de expresión génica.

Aquí se utilizó un enfoque de la biología de sistemas para caracterizar el transcriptoma

P. vivax. Utilizando un microarray de encargo de alta densidad de suelo de baldosas, se
obtuvo un conjunto diverso de datos de expresión génica de las etapas humanos y los
mosquitos como los esporozoitos, gametos, cigotos y ookinetes, e in vivo estadios
sanguíneos asexuados obtenidas de pacientes infectados en la Amazonia peruana.
Estos datos se combinan con la palabra corta publicada en los datos de cultivo in vitro
[11]. Uso de una culpa-por el enfoque de asociación que creamos hipótesis acerca de la
función de muchos genes no caracterizados. Comparación con bases de datos de P.
falciparum y P. yoelii revela conservados y especies específicas-patrones. Este análisis
proporciona nuevos conocimientos sobre el estado metabólico de los parásitos de
crecimiento dentro de los seres humanos. Esto demuestra que muchos de los ortólogos
de las transcripciones de P. falciparum necesarios para el desarrollo exo-eritrocítica
están presentes en el P. vivax esporozoitos lo que sugiere que pequeñas
modificaciones en el desarrollo de exo-eritrocítica puede permitir la formación
hypnozoite.

Materiales y Métodos Top

Ética declaración
El protocolo utilizado para recoger muestras de sangre humana para este trabajo fue
aprobado por el Programa de Protección de Sujetos Humanos del Instituto de
Investigación Scripps y la Universidad de California, San Diego y por los Comités de
Ética de la Universidad Peruana Cayetano Heredia y la Asociación Benéfica PRISMA,
Iquitos, Perú. consentimiento informado por escrito de cada sujeto o el padre, en el
caso de los menores. El formulario de consentimiento en Inglés y Español que las
muestras pueden ser utilizados con fines científicos relacionados con este o cualquier
otro proyecto, ahora o en el futuro y que las muestras pueden ser compartidos con
otros investigadores.

Recolección de muestras de los pacientes y la preparación de las células del parásito

Los pacientes que acudieron a clínicas de salud locales en la región amazónica peruana
de Iquitos con signos y síntomas típicos de la malaria fueron evaluados mediante un
examen de microscopía de luz de sangre teñidas con Giemsa frotis tener parasitemia
por P. vivax. Después de consentimiento informado, 20 ml de sangre recogidas en
tubos heparinizados vaccutainer, colocado en una incubadora portátil mantiene entre
37 y 39 ° C, y transportados a las instalaciones de laboratorio en 30 minutos. La sangre
se centrifuga a 900 × g durante 5 minutos y se separó el plasma. Los glóbulos rojos se
resuspendió en 2 volúmenes de animación suspendida (SA) solución (10 mM Tris, 170
mM NaCl y glucosa 10 mM pH 7,4) y pasa a través de una columna de celulosa (CF-11
en polvo, Whatman Ltd) colocado en un 37 ° incubadora de C, para eliminar las células
blancas de la sangre. parásitos asexuales se enriquecieron por la purificación del
gradiente. Tras la filtración, las células fueron lavadas dos veces en la solución de SA a
900 g durante 5 minutos y luego se resuspendieron en un 1:3 v / v en solución relación
SA. Para la producción de gametos / cigotos y ookinetes in vitro, las células rojas que
contienen parásitos se resuspendieron en medio exflagellation (10 mM Tris, 170 mM
NaCl, 10 mM de glucosa, 25 mM NaCO3, el 10% AB + suero humano, 50 mM de ácido
xanturénico) para inducir la aparición de parásitos de gametocitos, exflagellation y la
fertilización. La suspensión de células se colocaron entonces en un gradiente
discontinuo de 38%, 42% y 50% de Percoll (Sigma, EE.UU.) en medio RPMI 1640
(Invitrogen EE.UU.) y se centrifuga a 600 g durante 15 minutos. gametocitos Mujer en
la interfaz de 38 a 42% fueron retirados de la pendiente. Glóbulos rojos que contienen
parásitos asexuales, que se recogieron sedimentos por debajo de la pendiente y
lavarse por separado en la solución de SA a 900 g durante 10 minutos. Cigotos y
ookinetes y gametos sin transformar en la interfaz de 11% -16% se recoge, se lava con
PBS y se resuspendieron en Trizol y se almacenan a -70 ° C. El análisis microscópico de
la morfología celular confirmó el enriquecimiento de las etapas sexuales. pequeñas
alícuotas de células purificadas se tiñeron y 60 campos fueron examinados para
determinar el porcentaje relativo de células asexual y gametocitos (Tabla 1). Las
células rojas de enriquecimiento asexual se sometieron a la lisis por una solución de
saponina 0,1% en PBS durante 15 minutos a 4 ° C. Los parásitos se sedimentaron a
1200 g durante 5 minutos y se lava tres veces en PBS antes de resuspensión en Trizol
y almacenamiento a -70 ° C para su envío al Instituto de Investigación Scripps.

Tabla 1. P. vivax muestra de sangre asexual el perfil y la especificidad de la etapa.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.t001
P. vivax diseño del conjunto de microarrays de genoma-embaldosado
Se diseñó un Affymetrix P. vivax personalizada de microarrays alicatado de todo el
genoma con 4,2 millones de puntas de prueba de 25 pb que abarca las dos vertientes a
las seis de separación de pares de bases, con base en el conjunto del genoma de 2.809
contigs (PlasmoDB Ver. 5.4). Este microarrays incluye 1,7 y 2,3 millones de sondas
únicamente asigna a regiones codificantes y las regiones no codificantes,
respectivamente. En total, 5.419 genes de P. vivax son representados en la matriz,
4.676 de los cuales han orthologs P. falciparum. Esta serie estará disponible para la
compra de Affymetrix, número de parte PvivaxLi520507.

ARN preparación y la hibridación de microarrays

ARN fue purificado por extracción con cloroformo y la precipitación de isopropanol y se
purifica por RNeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN
fue cuantificado por espectrofotometría y el análisis cuantitativo por BioRad Experion
kit de ARN StdSens Análisis (BioRad). 1 ug de ARN total de parásitos de la sangre fase
asexual se utiliza para producir DNA en el juego de la síntesis de DNA de dos tiempos
(Affymetrix) y se amplifica a producir cRNA marcado en el kit de formación profesional
inicial de etiquetado (Affymetrix), y se purifica mediante el Genechip ejemplo de
limpieza del módulo ( Affymetrix), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para
la muestra esporozoito, 100 ng de ARN total se utilizó para producir DNA en el kit de la
síntesis de DNA de dos tiempos (Affymetrix) y se amplifica a producir cRNA marcado en
el IVT T7 kit MEGAScript (Affymetrix). Tras la reacción de formación profesional inicial
en primer lugar, la cRNA se dividió en dos reacciones, que contiene aproximadamente
500 ng de cada uno para la segunda ronda de la síntesis de DNA y se amplifica a
producir cRNA marcado en el kit de formación profesional inicial de etiquetado
(Affymetrix), y se purifica mediante el Genechip ejemplo de limpieza del módulo
( Affymetrix), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 20 ug de cRNA
amplificado se hibridan con el P. vivax suelo de baldosas de microarrays de 14 horas.
El GeneChips se lavaron en Affymetrix Lave la estación utilizando el protocolo estándar
FlexGE Affymetrix-WS450_00001 y escaneado en el escáner Affymetrix. El CEL
Affymetrix archivos de datos de microarrays se pueden descargar desde nuestro sitio
Web de compañía (http://carrier.gnf.org/publications/Pv). los datos de expresión génica
también son visibles en PlasmoDB en las páginas de P. vivax información genética.
Para obtener más información sobre la interpretación de la expresión génica de
nuestra costumbre arreglo completo mosaico del genoma por favor, visite el sitio web.

la expresión génica diferencial y el análisis de OPI

Todos los valores de la expresión génica se sometieron a una sonda de nivel de dos
vías ANOVA para determinar la variabilidad de expresión en todas las muestras [13].
Un total de 4.326 genes fueron identificados como diferencialmente expresados con
Panova <0,05 y FC> 2 (Tabla S1) y fueron sometidos a análisis más OPI agrupación.
Todos los datos pueden ser descargados desde el sitio web de compañía.

Todas las descripciones de Plasmodium gen y alias de nombre fueron descargados de

PlasmoDB (versión 6.1). datos de la función de anotación para P. falciparum, P. yoelii,
P. vivax, P. berghei, P. y P. knowlesi chaubaudi se obtuvieron a partir PlasmoDB, luego
se fusionó con los datos de P. falciparum anotación función de Gene Ontology
(noviembre de 2009 la liberación). Habíamos recogido previamente gen de datos co-
citación a través de Google Scholar y NCBI [10], este conjunto de datos se adjunta con
los datos de co-citación que se encuentran en "notas de genes" de los archivos de
anotación PlasmoDB. También se consideraron los datos publicados previamente como
P. falciparum complejos de proteínas [14], P. falciparum del ciclo celular clusters k-
medias [9], y nuestras propias anotaciones basado en la literatura [10]. Para cada lista
de genes, que además reclutó miembros adicionales de genes que son homólogos o
orthologs entre las especies de Plasmodium de acuerdo con la base de datos más
recientes OrthoMCL (versión 3). La base de datos contiene la anotación final de 3732
las listas de genes que contiene al menos un gen P. vivax, incluyendo 2.538 grupos
GO, las literaturas 1066, 84 listas de encargo del GNF, complejos de 29 y 15 grupos de
ciclo celular. A partir de estas listas de 2002 contiene al menos dos genes expresados
diferencialmente por P. vivax, por lo tanto se utilizaron para crear grupos de genes co-
regulados que comparten genes anotación ontología con la identificación de patrones
basado en ontologías (OPI) algoritmo descrito anteriormente [15] - [17 ]. Para muestras
de peso correctamente, reproducir muestras fueron pesadas 50% cada uno y
efectuado cuentan como una sola muestra. Cuando nuestra base de datos fueron
combinados con datos Bodzech, el coeficiente global de muestras de cada conjunto de
datos se ajusta de modo que dos conjuntos de datos aportados por igual en el análisis
de agrupamiento.
La visualización de los patrones de expresión de OPI en la figura 1 que se utilicen los
datos de consulta OPI patrón como se describe anteriormente [17]. En pocas palabras,
el patrón de consulta es el patrón representante mejor expresión de un grupo
determinado, y se deriva generalmente de patrón común compartida por la mayoría de
los más conocidos miembros de IR de la agrupación. Cada perfil de consulta se
normaliza restando la media y dividido por la desviación estándar, una práctica
estándar que se utiliza para el calor del mapa trazado. Los patrones de consulta que
representa las 192 funciones de los genes se agrupan jerárquicamente relacionados a
fin de que los procesos biológicos están cerca unos de otros.

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Figura 1. Patrones de expresión génica de 192 grupos de función celular
estadísticamente significativa en todas las 41 muestras por P. vivax.

Cada fila mapa de calor representa el patrón de expresión común compartida por los
miembros de su grupo y estos perfiles se agrupan jerárquicamente las funciones
celulares para transcripcionalmente relacionados se encuentran en las cercanías. Para
los nueve grupos seleccionados con diferentes perfiles de expresión de la vida del
ciclo, la detallada gen por gen mapas de calor de expresión se muestra para ilustrar la
alta correlación dentro de cualquier grupo determinado. evidencias adicionales
recogidos para cada grupo de OPI se resume en un mapa de calor blanco-azul. El color
azul indica una pieza de evidencia favorable, es decir, tanto los miembros del clúster
forma estadísticamente significativa redes de proteínas, o el grupo de OPI se encontró
también se basa en los análisis previos y reanálisis de la publicación de 54 muestras de
P. falciparum y P. yoelii datos del ciclo de vida conjunto [10]. El promedio de
correlación de Pearson de los perfiles de expresión de orthologs P. falciparum de los
miembros del grupo son también un código de color, de modo que el azul representa
una correlación positiva alta y gris representa una correlación negativa baja.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.g001
Cruz de validación incluye la publicación de bases de datos de expresión génica
Para cada uno de los 192 estadísticamente significativa P. vivax grupos OPI, hemos
identificado el P. falciparum y P. orthologs yoelii de los miembros de su grupo. A
continuación, calcula el promedio de correlación de Pearson pares coeficiente de la
orthologs P. falciparum en un conjunto de datos del ciclo celular previamente
publicados de 2.235 genes. Los coeficientes de correlación son casi todas positivas,
con una mediana de 0,45. También se calculó utilizando un enfoque similar los
coeficientes de correlación media de los ortólogos en un combinado yoelii P. y P.
falciparum conjunto de datos del ciclo de vida. Todos los resultados están disponibles
en la tabla S2.

Por cada pieza de la predicción de P. vivax función de los genes, comprobamos si es

por P. falciparum o P. orthologs yoelii se prevé también que en la categoría misma
función sobre la base de los últimos yoelii P. y P. falciparum conjunto de datos del ciclo
de vida. Ambos grupos OPI publicados anteriormente [10] y los nuevos grupos de OPI
sobre la base de la base de datos de genes última anotación se utilizaron en este
análisis de la validación cruzada. Nótese aquí una orthlog se considera asociada con un
grupo de GO, siempre y cuando apareció en el grupo o uno de sus grupos de
descendientes. Apoyo se encontró el 89 de los 192 grupos de OPI.

Validación cruzada con conjuntos de datos publicados por levaduras de dos híbridos y
la literatura
En primer lugar, prevé el P. falciparum publicado anteriormente dos híbridos de
levadura base de datos de interacción de proteínas en P. vivax mediante la
introducción de las interacciones de todos los correspondientes pares de P. vivax
ortholog OrthoMCL utilizando la versión 3. Se construyó una red de proteínas para cada
grupo de OPI y se registra el tamaño de la red. Para evaluar la significación estadística
de la red resultante, que sustituye los miembros del clúster a través de muestreos
aleatorios y repetir el proceso de construcción de la red 1000 veces. El p-valor de la
red se estimó con base en la probabilidad de una red de iguales o más complejos que
ocurren por casualidad. Todo el proceso se llevó a cabo por cualquiera de sólo
considerar las interacciones proteína-proteína directa o indirecta, incluyendo las
interacciones proteína-proteína y lo que dio lugar a una mejor p-valor fue seleccionado
para su presentación. Una interacción indirecta proteína-proteína se refiere a dos
proteínas interactúan a través de otra proteína. Un total de 63 redes se determinó que
los valores de p <0,05.

Se ha demostrado previamente que los genes co-citado en una literatura tienden a

estar más correlacionadas en su perfil de expresión génica en comparación a los
miembros del mismo grupo de GO, probablemente debido al proceso de revisión
cuidadosa que participan en la publicación [10]. Por lo tanto, podría ser útil la
introducción de las interacciones proteína-proteína virtual entre los genes co-citados.
Con estas interacciones virtuales añadidas al conjunto de datos dos híbridos de
levadura, se repitió la evaluación de la red por encima de los procesos por falta de la
literatura derivada grupos OPI e identificado 11 redes adicionales.

redes de proteínas se visualizaron con Cytoscape (versión 6.1), donde los nodos
pueden ser codificados por color según el nivel de confianza en las predicciones de su
función, y los bordes pueden ser codificados por color para reflejar las fuentes de
datos.

Motivo de análisis
enriquecimiento de Estadística de motivos en las regiones de aguas arriba se
determinó usando GeneSpring 7.3 del software, mediante la "búsqueda de secuencias
reguladoras" con parámetros de 0 a 1000 bases, motivo tamaños de 5 a 9 puntos
básicos y que permite hasta dos N en la región central. Sólo puntos de corte con una p
corregida-valor inferior a 0,05 se informó a excepción de grupos muy pequeños.

Preparación y análisis de yoelii P. y P. falciparum esporozoito ARN

esporozoitos de P. vivax se obtuvieron de Sanaria, Inc. de los mosquitos alimentados
con P. vivax chimpancés infectados infectados con la India cepa P. vivax VII [18].
Esporozoitos fueron disecados de las glándulas salivales del mosquito y se purifica.
Aproximadamente 150.000 células esporozoitos se utilizaron para la preparación de
ARN. Del mismo modo esporozoitos purificada de 3D7 de P. falciparum cepa aislada de
mosquitos infectados con parásitos en el cultivo in vitro se obtuvieron también de
Sanaria, Inc.

esporozoitos de P. falciparum de la glándula salival se obtuvieron de Sanaria, Inc. P.

falciparum esporozoito RNA fue aislado y amplificado utilizando kits de Affymetrix
como se describe para las muestras de P. vivax esporozoitos. 3D7 P. falciparum cepa
de ARN in vitro sincronizado parásitos trofozoito etapa se aisló y se amplifica como se
describe para las muestras de P. vivax. Amplificada cRNA se hibridó a la matriz Pftiling
descrito previamente [19].

Para validar la comparación de la expresión de genes que son expresados

diferencialmente en esporozoitos de P. vivax y P. falciparum, se realizó la reacción de
la transcriptasa inversa cuantitativa cadena de la polimerasa (QRT-PCR), el 22 de los
genes con orthologs en ambas especies, y dos específicos de P. vivax genes.
Cebadores utilizados se enumeran a continuación. Todos los iniciadores fueron
optimizados utilizando el ADN genómico de la cepa P. falciparum 3D7 y Salvador Me
esfuerzo por P. vivax en tres diluciones de 10 ng / ul, 1 ng / ul y 0,1 ng / ul para
garantizar que el umbral de amplificación de los valores refleja con exactitud la
diferencia en la concentración de ADN molde. Primer establece para las dos especies
diferentes producidos similares umbral de los valores de Ct (¿qué significa Ct) (+ / - 1.5
Ct) para todos los oligonucleótidos para ambas especies. Una alícuota adicional de
150.000 esporozoitos tanto para P. falciparum y P. vivax de Sanaria, Inc, se utilizaron
para aislar el ARN total con Trizol como se describió anteriormente. Esta muestra de
ARN total se dividió en partes iguales en las tres reacciones para producir DNA de
cadena sencilla utilizando la transcriptasa inversa y un cebador T7-Oligo dT del kit de la
síntesis de DNA (Affymetrix) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc
de cadena simple se utilizó como molde para las reacciones de QRT-PCR utilizando los
oligonucleótidos presentado. Para explicar la variabilidad en el DNA de entrada entre
las diferentes reacciones del cDNA de la misma especie, se normalizaron los valores de
umbral Ct por la diferencia promedio entre las reacciones a través de todos los genes.
No podemos conocer la identidad de cualquier gen que se expresa en el plano
exactamente el mismo en ambas especies que se pueden utilizar para controlar la
variación. Sin embargo, al comparar por P. vivax y P. falciparum Ct valores umbral,
encontramos que la más alta de genes expresados (CSP) y la menor de genes
expresados (Pv117045 dedo de zinc) en ambas especies mostraron valores de umbral
muy similar Ct en 1,5 ciclos de CT, que se en el seno del error observado por la
optimización de ADN. Nuestros datos de expresión de genes de especies múltiples,
incluida la yoelii P., así como los datos proteómicos humanos y experimentos
convencionales muestran CSP es a menudo una de las proteínas más abundantes en
esporozoitos de Plasmodium. Parece seguro usar esto en la normalización. reacciones
de QRT-PCR se prepararon utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se ejecuta en la máquina de Applied
Biosystems TaqMan mediante SDS 2.2.1 del software. Umbral de los valores de Ct se
determinaron utilizando la configuración por defecto y la determinación del umbral
automático. Todos los resultados de amplificación fueron inspeccionados manualmente
para asegurarse de que los umbrales se determinaron en la fase logarítmica de
amplificación de la reacción para la determinación exacta de los valores Ct. Doble
diferencia entre P. falciparum y P. vivax QRT-PCR determina los valores de expresión es
igual a 2 elevado a la potencia de la diferencia en los valores de Ct entre las dos
especies. resultados QRT-PCR y cebadores utilizados se muestran en la tabla de
consulta S2.

La lista de genes específicos de P. vivax esporozoito utilizadas para sembrar el clúster

OPI incluye: S13, MAC / perforina (PVX_000810, PFD0430c); SIAP-1 (PVX_000815,
PFD0425w); PF52 proteína (PVX_001015, PVX_001020, PFD0215c); ECP1, proteasa
cisteína (PVX_003790, PFB0325c); asparragina-ricos Pfa35 antígeno-2 (PVX_081485,
PFA0280w), S24, la proteína hipotética (PVX_081555, PFA0205w); TRSP (PVX_081560,
PFA0200w); TRAMPA (PVX_082735, PF13_0201), S14, la proteína hipotética
( PVX_084410, PFL0370w), S25, la proteína quinesina relacionados (PVX_084580,
PFL0545w); MAEBL (PVX_092975, PF11_0486), S1, la proteína hipotética (PVX_094625,
PF10_0083), proteína quinesina relacionados (PVX_094710, PFL0545w), proteína
conservada hipotético (PVX_097795, PFE0230w), proteína hipotética (PVX_118360,
PF14_0404); circumsporozoito (CS) de la proteína (PVX_119355, PFC0210c), proteína
de membrana principios transcrito 13, ETRAMP13 (PVX_121950, PF13_0012), proteína
S23, hipotética conservada (PVX_123155, PF08_0088); S4, conserva hipotética proteína
(PVX_123510, PFL0800c), proteína conservada hipotético (PVX_123750, PFL1075w).
Descubrimiento de la expresión génica de las Naciones Unidas-anotado en P. vivax
Para deducir la expresión génica de los genes de las Naciones Unidas-anotado en P.
vivax, se realizó una búsqueda BLAST de todos por P. falciparum y P. knowlesi anotado
genes contra el genoma de P. vivax para identificar todos los genes putativos ortólogos
que no puede ser anotado en P. vivax. La similitud de BLAST coordenadas se utiliza
para definir la región de codificación en P. vivax. No hemos validado la secuencia de
codificación para la traducción del gen adecuado ni hemos definido los límites de exón-
intrón de estos genes. Estos definición de los límites del gen se utilizaron para recoger
las puntas de prueba para evaluar el nivel de expresión de genes de estas regiones en
la misma forma que todos los demás genes anotados por P. vivax. Estos genes fueron
nombrados originalmente usando los números de sus GeneID P. falciparum y P.
knowlesi orthologs. Hemos incluido estos valores de la expresión génica de estos genes
implicados en la tabla S1. También se realizó un análisis de todos los datos de P. vivax
hibridación del ARN de microarrays para identificar las regiones altamente transcrito de
50 pb que no se superpongan con las anotaciones de genes existentes. Hemos
encontrado algunas de estas regiones, pero parece que corresponden a los exones
adicionales, las regiones intrónicas, o 5 'o 3' regiones no traducidas de los genes
existentes. Uno de los genes adicionales identificados por este método es el gen
Pv_PF11_0140. Ofrecemos supuesta P. vivax Gene números de identificación de estos
genes en función de su posición en relación con los genes existentes de
acompañamiento. Ofrecemos una lista de estos genes putativos nuevas coordenadas
en la tabla de consulta S3.

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Los mejores resultados
La toma de muestras y análisis de microarrays
Las muestras de sangre fueron recogidas de las ocho pacientes infectados por P. vivax
con malaria no complicada en Iquitos, Perú. leucocitos humanos se eliminó por
filtración y gametocitos de P. vivax fueron separados de los parásitos fase asexual por
centrifugación en gradiente. Sólo había una pequeña proporción de los gametocitos (0-
15%) en la muestra final (Tabla 1), por lo que en adelante se refieren a estas muestras
como los perfiles asexual. Por microscopía de las células asexuales en las muestras de
sangre del paciente que parecía ser los anillos y las primeras etapas de trofozoito, sin
fines de trofozoito o etapas de esquizontes, probablemente como resultado de la
sincronización natural de los pacientes peruanos. Para una muestra, ponemos las
etapas gametocitos aislados en el cultivo in vitro e inducida fase de desarrollo sexual
para obtener un gameto mixta / muestra fase de cigoto y una muestra ookinete etapa
sobre todo pura del paciente aislado (Tabla 1). Además, se aislaron esporozoitos de las
glándulas salivales de los mosquitos disecados alimentados en chimpancés infectados
experimentalmente.

Hemos probado la expresión de genes con una dirección personalizada del genoma de
P. vivax toda suelo de baldosas de microarrays con 4,2 millones de sondas par de 25
líneas de base que abarca tanto a las seis de separación de pares de bases. Una
estimación semi-cuantitativa de la abundancia de transcripción para cada gen se
podría obtener con este diseño de microarrays de genes debido a que el 5419 por P.
vivax se probaron por cientos de oligonucleótidos independiente. Si bien esta matriz se
puede utilizar para encontrar RNAs no codificantes, incluyendo ARN antisentido, el
cRNA marcado para la hibridación fue preparado mediante un método de poliA la
transcriptasa inversa de cebado que no se dan descripciones precisas de RNAs no
codificantes y por lo tanto hemos limitado nuestro análisis a predecir las regiones de
codificación. Para el cálculo de un nivel de expresión génica aproximada, E, hemos
utilizado el algoritmo MOID, que clasifica los valores de intensidad de la sonda el 20
sondas en el extremo 3 'de la transcripción que tienen valores similares de GC. A
continuación, asigna el valor de la expresión, E, a la diferencia entre el fondo
(calculado a partir de miles de sondas con un contenido similar de GC no se prevé que
en el P. vivax o genoma humano) y la sonda en el percentil 70 (Tabla S1). Debido a que
la variable contenido de GC de diferentes genes de P. vivax podría dar lugar a falsos
niveles de expresión aparente, la optimización de la selección extensa investigación se
llevó a cabo para asegurar medidas robustas de la expresión genética en todas las
muestras. Se demuestra que los valores MOID expresión no se cambian por la
selección de la 13 ª independiente o 14 de 20 sondas clasificado (Métodos S1 Figura
III). optimización adicionales para diferentes contenidos de GC (Métodos S1), muestra
que podemos seleccionar las sondas de una matriz de suelo de baldosas de todo el
genoma para detectar con precisión la expresión génica. Para comprobar la
reproducibilidad de nuestro análisis, se analizaron tres muestras, dos y una asexual
esporozoitos en dos técnicas repeticiones cada uno, y se obtuvieron coeficientes de
correlación de Pearson de 0,986 a 0,996, lo que indica una excelente reproducibilidad,
mientras que la inferior se observa correlación entre las muestras de los grupos
divergentes asexual (Métodos IIIB figura S1-D). Los resultados fueron confirmados
también por QRT-PCR, y en comparación con las etiquetas de secuencias expresadas
(EST), como se describe en Métodos S1.

Los genes involucrados en procesos similares son co-expresados

En primer lugar, trató de abordar nuestra hipótesis de que los genes implicados en
procesos similares que se co-expresó. Se identificaron 4,326 genes expresados
diferencialmente con el corte de ANOVA p-valor <0.05 y doble cambio (FC)> 2
utilizando los valores individuales de la sonda de intensidad para cada gen utilizando
sólo los datos. genes expresados diferencialmente se agruparon utilizando la
identificación del patrón basado en ontologías (OPI), un algoritmo utilizado
anteriormente por P. falciparum y P. conjuntos de datos yoelii expresión [10] (Figura 1).
Este algoritmo comienza con 2.002 listas de genes que comparten una ontología de
genes comunes (IR) de la anotación, la literatura co-citación, u otro proceso anotado
específica del parásito, por ejemplo, hay 38 genes conocidos por estar involucrados en
la replicación del ADN. Para cada grupo de un vector de expresión perfil representativo
se calcula utilizando los valores de E de todas las condiciones para todos los genes en
el grupo. A continuación, todos los 4.326 genes expresados diferencialmente se
clasifican por el coeficiente de correlación calculado entre el vector de expresión del
gen y el vector de perfil de expresión representativa. El algoritmo a continuación,
utiliza una rutina de optimización coeficiente de correlación y crea grupos de expresión
que contiene el mayor número de genes con la anotación común y alta correlación. En
el caso de la replicación del ADN "GO proceso un grupo de 60 genes que se cree que
contiene 11 de los 38 genes anotados replicación del ADN. La probabilidad de esta
distribución se producen por azar es inferior a 10-13. Del mismo modo, hay menos de
8.10 de probabilidad de identificar 5 de los 15 genes con una anotación de la glucólisis
en un grupo de 21 genes. Además de utilizar ontologías gen que también se utilizan
otros grupos de genes. En un análisis previo de las etapas del ciclo de vida de P.
falciparum [9] que había identificado 106 genes sobreexpresados en esporozoitos, que
corresponde a 66 orthologs P. vivax en nuestra base de datos (GO: CCYCL01). De estos
35 fueron encontrados en un grupo de 366 genes con una probabilidad de
enriquecimiento mediante la probabilidad de 10-20. En general, estos datos muestran
que los patrones de expresión génica fueron aleatorias y que los genes con funciones
similares mostraron la cohesión mucho mayor de lo esperado por azar. En total, 121
grupos de genes altamente correlacionada con la anotación compartida fueron
identificados (véase el sitio web de compañía: http://carrier.gnf.org/publications/Pv).

Previo análisis de la expresión génica por P. vivax sangre escenario para parásitos
tenido en la cultura sincrónica a corto plazo se ha realizado [11] y comparamos
nuestros resultados con estos. Debido a que este estudio participaron dos
micromatrices de color y no produjo niveles de expresión, las comparaciones directas
entre los niveles de expresión no son posibles. Sin embargo, todavía podría aplicar el
mismo algoritmo de agrupamiento OPI a los datos Bozdech. La agrupación de los datos
Bozdech (véase el sitio Web Companion) dio menos información sobre los esporozoitos
y las etapas sexuales, pero reveló enriquecimiento funcional muy significativo,
especialmente en el ámbito de la biosíntesis de proteínas y función del ribosoma, que
se espera debido a la toma de muestras superior en todo el ciclo eritrocítico. Por
ejemplo, 48 o los 58 genes anotados en un papel previsto en los ribosomas citosólicos
(GO: 0022626) se encontraron en un grupo de 126 genes, con una probabilidad de
enriquecimiento de las posibilidades de 10-63. Los datos mostraron que en muchos
casos los mismos genes que se agrupan con "ribosoma citosólico" en los datos Bozdech
también el grupo con "subunidad ribosomal pequeña" en nuestros datos. El gen,
PVX_084645, compañeros de los grupos con los genes ribosomales en ambos casos y
aparece como hipotética pero su ortólogo de P. falciparum, PF14_0360, aparece como
un factor de iniciación de la traducción de proteínas eucariotas 2A y por lo tanto su
asociación con los ribosomas no es sorprendente. PVX_101135, una hipotética grupos,
con las proteínas ribosomales en ambos casos. BLASTP (p = 1,3 × 10-35), muestra un
partido fuerte a la proteína de la levadura YOR091W, una proteína de función
desconocida que se asocia con los ribosomas que interactúa con GTPasa Rbg1p [20].

También co-agrupado los datos Bozdech con nuestros datos para generar predicciones
más exactas de la función génica creación de un conjunto de 192 grupos diferentes
que contienen entre 2 y 493 genes y los valores de p entre 3.10 y 10 a 52 (Figura 1,
Tabla S2) . Muchas de nuestras predicciones funcional puede ser cruzada con validado
previamente publicado conjuntos de datos. En particular, se comprobó si la predicción
misma función se puede hacer sobre la base de combinados por P. falciparum y P.
yoelii conjunto de datos, utilizando previamente publicados grupos OPI [10] o un
clúster de conjunto actualizado con las anotaciones más recientes gen. Para cada
grupo de P. vivax nos encontramos pruebas de permutación para ver sus orthologs P.
falciparum forma más densa redes de proteínas que lo que se esperaría por azar
utilizando publicado dos datos híbrido [21] y la literatura de datos co-citación [10]. En
total, 75 de los 192 grupos OPI llevó a redes de proteínas con un valor de p menor de
0,05 sobre la base de 1.000 simulaciones de permutación. Por ejemplo, PVX_123920,
una supuesta ubiquitina-que activa la enzima E1 grupos con los genes implicados en la
partícula de reglamentación proteosoma, tanto en P. vivax y P. falciparum y cuenta con
el apoyo de dos híbridos, así [21]. Si bien hay numerosos ejemplos que se pueden
derivar de los procesos bien estudiados, el mayor valor de estos datos es en el apoyo a
las predicciones de los genes que no se puede encontrar en otros organismos modelo.
PVX_092415 y PVX_113830 clúster con los genes implicados en el desarrollo de
merozoitos de P. falciparum y P. vivax (GO: GNF0218) y, además, se apoyan en
estudios de interacción de dos híbridos de P. falciparum (Figura 2). Del mismo modo,
PVX_000945 muestra un patrón similar. El Toxoplasma gondii homólogo de esta
proteína se ha aislado de roptries [22], tiene, el ortólogo de Toxoplasma PVX_113800,
que también los grupos con los genes implicados en el desarrollo de merozoitos de P.
falciparum. Hay numerosos ejemplos de las etapas pre-eritrocítica así. Por supuesto,
algunos se debe tener cuidado en la evaluación de los datos porque los genes
implicados en dos procesos diferentes pueden ser co-expresadas (por ejemplo, la
replicación del ADN ocurre durante la producción de gametos) y sin embargo estar
involucrados en procesos relativamente diferentes. Sin embargo este ejercicio
agrupación da predicciones funcionales de los muchos genes que se encuentran
caracterizados en un clúster de OPI.

Figura 2. El análisis de redes.

Correspondientes orthologs P. falciparum de los miembros del grupo pueden formar
redes de interacción estadísticamente significativa de dos híbridos. miembros del gen
conocido por estar involucrado en el grupo son de color verde, predijo cuáles son color
de rosa y con el apoyo de los análisis OPI de P. falciparum y P. yoelii ciclo de vida del
conjunto de datos se muestran en azul. Interacción bordes están codificados por
colores para reflejar si se trata de una interacción directa o indirecta de una
interacción, y si tiene la literatura de apoyo co-citación o no. Una lista completa de los
genes con la validación cruzada se da en la Tabla S3.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.g002
La heterogeneidad en las muestras de sangre del paciente etapa
Una vez establecida la calidad general de los datos se examinaron los grupos de genes
que se expresan diferencialmente en un momento dado. Mientras que nuestra
expectativa inicial era que las muestras de sangre obtenidas de pacientes, sería
relativamente homogénea, de forma inesperada, observamos grandes diferencias en
los perfiles de expresión de muestras asexual con las diferencias más pronunciadas
observadas en los genes implicados en la glucólisis. Si bien hemos encontrado poca o
ninguna expresión diferencial de las tres primeras enzimas de la vía: hexoquinasa
(PVX_114315), isomerasa de glucosa-6-fosfato (PVX_084735) y 6-phophofructokinase
(PVX_099200), los ocho restantes enzimas glicolíticas: fructosa 1,6 - bifosfato aldolasa
(PVX_118255), isomerasa triosafosfato (PVX_118495), deshidrogenasa gliceraldehído-3-
fosfato (PVX_117321), fosfoglicerato quinasa (PVX_099535), fosfoglicerato mutasa
(PVX_091640), enolasa (PVX_095015), lactato deshidrogenasa (PVX_116630) y piruvato
quinasa (PVX_114445) mostraron expresión diferencial muy fuerte entre las muestras
con algunos genes que muestran a una expresión de 100 veces mayor en algunas
muestras asexual en relación con otros (Figura 3). Estos últimos ocho enzimas se
encuentran entre el 1% cuando calificados por la abundancia de transcripción in vitro
de trofozoítos de P. falciparum y se encuentran entre el 5% de los genes de P. vivax en
algunas muestras pero no en otros (Figura 3). Estas diferencias son poco probable que
ocurra por casualidad (p = 1,9 × 10-7 comparar el grupo de P. vivax 1 y grupo 2
definido en la figura 3 con una prueba t pareada). Mientras que las muestras de la
glucólisis alta fueron la minoría (dos de ocho), que eran más similares a la descrita en
Cui et al. Aquí tecnologías ecológicamente racionales de 22.236 muestras de sangre
infectada P. vivax y Tailandia [12] fueron secuenciados. Nuestros datos muestran una
buena correlación de Spearman con los números tailandeses EST y mostraron que las
muestras con valores altos glucólisis gen E fueron más similares (r = 0,53) (tabla 1 y
Métodos S1) con la cepa tailandesa. Si bien puede ser que estas diferencias de
expresión se deben a contaminación con gametocitos [23] la presencia de 00 a 10% la
contaminación gametocitos matemáticamente no puede explicar por qué la lactato
deshidrogenasa está presente en ~ 3.300 unidades en dos muestras asexual y tan bajo
como 75 (casi indistinguible de fondo) en otros [24]. Además, los genes asociados
típicamente con gametocitos (Pvs25 por ejemplo, PVX_111175) son más altos en las
muestras de la glucólisis alta (CM12 y CM13). Una alternativa es que, aunque parecía
morfologías similares, a una proporción sustancialmente diferentes de las etapas del
ciclo de principios y finales de células contenidas en las muestras de la glucólisis de
alta y baja. Los genes asociados típicamente con la esquizogonia y la invasión, tales
como proteínas motoras miosina y reticulocitos proteínas de unión, que se transcribe
más adelante en los datos del ciclo Bozdech eritrocítica, se expresa en niveles más
altos en las muestras de la glucólisis baja (Figura 1). A pesar de ello, las transcripciones
de la glucólisis no suelen mostrar el resultado de 50 a 100 veces los cambios en los
niveles de expresión en todo el ciclo de in vitro eritrocíticas de P. falciparum cultivadas
in vitro [8] [9], ni son tan grandes cambios veces observado con P. vivax cultivadas en
in vitro [11]. Además, tal hipótesis sería necesario muestras de pacientes que han
estado estrechamente sincronizados. Mientras más muestras se deben examinarse, los
datos de plantear una intrigante posibilidad de que puede haber regulación diferencial
del metabolismo en un subconjunto de las muestras obtenidas de pacientes, como se
observa en las muestras de P. falciparum deriva el paciente (Figura 3) [24].

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Figura 3. Expresión de genes del metabolismo de P. vivax asexual parásitos de la
sangre etapa.

Los valores de expresión de cada gen en cada muestra se normalizaron al restar el

valor medio de expresión y dividiendo por la desviación estándar en todas las muestras
asexual. El gen de la deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato no se anota, pero la
región syntenic en P. vivax también muestra alta expresión en CM013 muestra
(Suplementario Figura 2). los valores de expresión génica se normalizaron al restar el
valor de la expresión media de todas las muestras y dividiendo por la desviación
estándar de los valores de expresión a través de todas las muestras. Los valores
resultantes se normalizó la expresión de color en una escala que va desde -1 hasta 2,
desde el negro para las más bajas, rojo para el centro, y blanco para los valores más
altos. Los números de identificación genética de los genes de la glucólisis que
aparecen en la Figura 3 son: la lactato deshidrogenasa (PVX_116630, PF13_0141);
enolasa (PVX_095015, PF10_0155); deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato
(PVX_117321, PF14_0598); aldolasa fructosa 1,6-bisfosfato, putativo (PVX_118255 ,
PF14_0425); fosfoglicerato mutasa 2,3-bisfosfoglicerato-dependiente (PVX_091640,
PF11_0208); isomerasa triosafosfato (PVX_118495, PF14_0378). Gene números de
identificación para el ciclo TCA y los genes respiración aeróbica son: flavoproteína
subunidad de la succinato deshidrogenasa (PVX_111005, PF10_0334); malato: quinona
oxidorreductasa (PVX_113980, PFF0815w), proteína IRP-como (hierro-proteína
reguladora similares) (PVX_083005, PF13_0229); fumarato hidratasa (PVX_099805,
PFI1340w); ATP sintetasa específica de succinil-CoA subunidad beta (PVX_084960,
PF14_0295); deshidrogenasa 2-oxoglutarato E1 componente (PVX_089325,
PF08_0045); aciltransferasa dihidrolipoamida (PVX_119310, PFC0170c); succinil-CoA
sintetasa subunidad alfa ( PVX_091100, PF11_0097); subunidad hierro-azufre de la
succinato deshidrogenasa (PVX_123345, PFL0630w); citocromo C oxidasa
(PVX_099845, PFI1375w), citocromo c chaperona de cobre oxidasa (PVX_111430,
PF10_0252), citocromo c oxidasa subunidad precursora II (PVX_084995, PF14_0288);
proteína citocromo c oxidasa montaje (hemo R: farnesiltransferasa) (PVX_080280,
PFE0970w); proteína citocromo c oxidasa de montaje (PVX_084785, PF14_0331);
deshidrogenasa NADH proteína reacción (PVX_119700, PFC0505c).

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.g003
Muchos de los expedientes necesarios para la misma función de principios
intrahepatocyte en P. falciparum son aumentada en P. vivax esporozoitos
Los determinantes moleculares que regulan la formación de hypnozoite y la recaída
son desconocidos. Una hipótesis es que el hypnozoite es una forma de fase temprana
exo-eritrocítica (EEF), que es arrestado en el desarrollo. Si esta hipótesis es correcta,
esperaríamos que el perfil transcripcional de esporozoitos de P. vivax a ser similares a
las especies que no forman hipnozoitos. Por lo tanto, comparamos nuestra P. vivax
esporozoito perfil de expresión a una muestra de esporozoitos de P. falciparum y tres
muestras de P. yoelii esporozoito analizados previamente [25], [26]. comparaciones
esporozoito transcriptoma mostró que los esporozoitos de P. vivax son generalmente
similares a P. yoelii y esporozoitos de P. falciparum con expresión positivamente
correlacionados de genes altamente expresados (r = 0,5). A pesar de algunas
diferencias de cada especie, se observó la expresión de muchos genes similares por P.
vivax que P. falciparum y P. orthologs yoelii fueron demostrado previamente para ser
aumentada en esporozoitos, incluyendo algunos de los genes más altamente
expresado en la muestra por P. vivax ( Tabla 2): Además de los genes que se sabe
upregulated en esporozoitos como el factor de iniciación UIS1, y el UIS2 fosfatasa
serina treonina, la lista contiene un número de candidatos conocidos por vacunas de
subunidades preeritrocíticas incluido el antígeno de membrana apical de 1 (AMA1 ) del
gen y la proteína circumsporozoito (CSP). Además, hay genes cuya alteración ha
llevado a esporozoitos atenuados genéticamente que eventualmente puede ser
utilizado en las vacunas organismo entero, incluyendo el ortólogo de P. falciparum
etramp10.3 o UIS4 en P. yoelii [27], [28], UIS3 [29 ] y P52] [30. En el conjunto de genes
sobreexpresados en numerosas especies (Tabla S4) hemos identificado un conjunto de
esporozoito conserva transcripciones ortólogos (SCOT), que se upregulated en
numerosas especies, pero no anotado hasta ahora de que puede proporcionar una lista
de los antígenos de los posibles candidatos para P. vivax y pre- vacunas eritrocítica, o
que cuando falla puede dar esporozoitos atenuados genéticamente.

Tabla 2. La mayoría de los genes altamente expresados por P. vivax en la fase de

esporozoito.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.t002
Hay también, por supuesto, los genes que no se encuentran en P. falciparum que son
aumentada en esporozoitos de P. vivax y puede jugar algún papel único en la biología
de P. vivax u otros parásitos que forman hypnozoite. Ejemplos de la esporozoito grupo
específico combinado OPI (GO: GNF0006) incluyen hasta 63 genes sin orthologs P.
falciparum. También hay algunos genes previamente demostrado ser aumentada en
esporozoitos de P. falciparum, pero cuya orthologs fueron regulados a la baja o apenas
aumentaron en esporozoitos de P. vivax o viceversa (Tabla S4). Un gen ApiAP2
(PVX_090110) y dos proteínas dedo de zinc (PVX_099045, PVX_099045, PVX_081725),
que a menudo funcionan como factores de transcripción, fueron regulados a la baja al
igual que varias proteínas de unión a ARN (PVX_098995, PVX_098995, PVX_100715) y
varias quinasas, incluyendo dos de serina / treonina proteína quinasas (PVX_081395,
PVX_081395, PVX_002805), un FIKK de calcio dependientes de la proteína quinasa
(PVX_091755) y una quinasa MAP (PVX_084965). Aunque algunas de estas diferencias
podrían deberse a la variación de la cepa específica de recogida o esporozoito hemos
podido confirmar estas diferencias de cada especie en la expresión genética de 19
genes con QRT-PCR (cuadro S5).

Los genes sobreexpresados en gametos / cigotos son en su mayoría caracterizados

El proceso de desarrollo sexual y la meiosis son mal caracterizado en muchas especies.
Un perfiles de expresión de la mezcla de macrogametes y los cigotos (Tabla 1)
derivado de cultivo in vitro de gametocitos fertilizado derivadas del paciente mostró
regulación al alza de sólo unos pocos genes caracterizados son aquellos con funciones
en la replicación del ADN, la meiosis y la estructura de la cromatina (Tabla 3). La
mayoría de los genes expresados diferencialmente están fuertemente caracterizados,
aunque muchos se había demostrado que aumentan su expresión durante la inducción
de gametocitos de P. falciparum in vitro [15]. Como se predijo, la alta expresión de la
ortholog P. vivax de Pvs25 (PVX_111175), la proteína de superficie ookinete, se
encuentra en esta etapa. Otro gen de la proteína de la membrana, el ortólogo del
Toxoplasma gondii PhIL1 (fotosensible INA-proteína marcada 1) (PVX_081335), fue uno
de los que más aumentaba (> 20 veces) en los gametos por P. vivax / cigotos. Esto
asocia con proteínas del citoesqueleto, y se localiza en el extremo apical de la
membrana plasmática [31] en el que puede funcionar como una proteína de superficie
ookinete específico para la invasión del intestino medio. El factor de transcripción de
proteínas de alta movilidad de grupo, HMGB2 (PVX_089520) se encuentra entre los 20
primeros genes que se expresan en esta muestra (Ver Tabla S1). Se demostró ser un
regulador crítico del desarrollo de ooquistes y aparece para activar los genes que están
más transcritas en gametocitos, pero después se almacenan y se traducen en
ookinetes [32]. Curiosamente, algunas de estas proteínas no caracterizadas también
aumentan su expresión durante la meiosis en los seres humanos, como los ortólogos
humanos de PVX_117890 [33]. Una proporción excepcionalmente grande de los genes
sobreexpresados en cigotos (Tabla 3) no caer en los grupos con enriquecimientos de
genes conocidos, poniendo de relieve el problema de la utilización de "culpabilidad por
asociación", cuando la base de conocimientos existente es escasa.

Cuadro 3. Genes que muestran la mayor probabilidad de regulación al alza diferencial

en cigotos.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.t003
Ookinete la expresión génica
agrupación OPI Gene ontología basada reveló algunas funciones de los genes anotados
para ser aumentada en ookinetes. Este hallazgo probablemente refleja la dificultad de
obtener cantidades suficientes de esta etapa de desarrollo en el estudio in vitro.
Hemos encontrado una alta expresión de genes implicados en la cromatina (histonas,
por ejemplo) y la traducción, lo que podría reflejar el hecho de que una vez que el
parásito llega al intestino medio y forma de ooquistes, miles de rondas de replicación
del ADN es probable que comience. específicamente los genes sobreexpresados en
ooquistes fueron caracterizados en su mayoría. Ookinete genes de proteína de
superficie, tales como el ortólogo de P. vivax del CSP y de la proteína relacionada con
la TRAMPA (PVX_095475), previamente demostrado ser esenciales para la invasión
ookinete [34], [35], la transmisión de bloqueo objetivo antígeno Pfs230 (PVX_003905),
un antígeno de fase sexual s48/45 de dominio que contienen proteínas (PVX_003900),
bloqueando la transmisión de destino antígeno precursor Pfs48/45 (PVX_083235),
mostraron niveles moderados de regulación al alza (<3 veces) en ookinetes en relación
con cualquier otra etapa. En P. falciparum, las transcripciones de muchos de estos
picos en gametocitos etapa temprana [15], y por lo tanto alta expresión no
necesariamente sería de esperar en ookinetes P. vivax, incluso si la proteína se detecta
en la actualidad.

Por otro lado había un número de genes no caracterizados que mostraron regulación al
alza sustancial en ookinetes (> 3 veces). Estos pueden codificar las proteínas que se
necesitan para la formación de ooquistes temprana. Algunos ejemplos (ver Tabla S1
para más detalles) incluyen una cinasa dependiente de calcio posible, (PVX_083525), y
la sintasa de ácido 5-aminolevulínico (PVX_101195), una enzima clave en la vía de
síntesis de la porfirina que conduce a la síntesis del grupo hemo. Proteasas y otras
enzimas de degradación puede ser necesaria para salir de la harina de sangre,
penetrar en el peritrófica matriz oa la de ooquistes en el intestino medio del mosquito.
Una serie de proteasas fueron regulados en ookinetes, incluyendo Ulp1 (proteasa
proteína ubiquitina-específica-como, PVX_100650), que se requiere específicamente
para la progresión del ciclo celular en otras especies.

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resistencia a los medicamentos de la expresión génica
Mientras que en la resistencia a muchas drogas casos en los parásitos de la malaria es
conferida por polimorfismos de nucleótido único [36] - [38], en algunos eventos de
amplificación de los casos de transcripción en un objetivo o en una bomba [39]
confieren una mayor tolerancia a las drogas. Por lo tanto, compararon los niveles de las
transcripciones de drogas gen de resistencia para determinar si algo interesante se
puede encontrar. La mayoría de los genes implicados en la resistencia a los
medicamentos como pvcrt (transportador de resistencia a la cloroquina, PVX_087980),
dhps (sintasa dihidropteroato, PVX_123230), gtpch (ciclohidrolasa GTP, PVX_123830) o
MDR1 (gen de resistencia a múltiples fármacos 1, PVX_080100) mostraron patrones
similares en P. vivax y P. falciparum. Una excepción fue la dihidrofolato reductasa
(DHFR, PVX_089950), el objetivo del fármaco antifolato ampliamente utilizados contra
la malaria, la pirimetamina. Sorprendentemente, la expresión dhfr fue 50 veces mayor
en los esporozoitos la India VII P. vivax (confirmado por QRT-PCR, véase el cuadro S6) y
10 veces a 30 veces mayor en P. vivax en comparación con las etapas asexuales de P.
falciparum, donde era de fondo cerca en todas las etapas. Curiosamente, mientras que
P. falciparum es sensible a la pirimetamina, P. vivax se considera intrínsecamente
resistentes [40], aunque en los datos de sensibilidad in vitro de drogas no está
disponible para la mayoría de las cepas de P. vivax. Ambas mutaciones dhfr [41], [42] y
ampliaciones [43] Se ha demostrado que confieren resistencia de P. falciparum. Por lo
tanto, la expresión dhfr mayor en P. vivax en relación con P. falciparum pueden
conferir una mayor tolerancia a la pirimetamina.

genes vir mostrar el menor promedio de expresión

Aunque gran parte de nuestros datos muestran que los patrones de expresión génica
son conservadas a través de las especies de Plasmodium los datos también revela las
posibles funciones de información acerca de los muchos genes no caracterizados, que
son específicos de P. vivax, incluidos los miembros de la familia multigénica. La mayor
familia de genes parálogos de P. vivax es la superfamilia de genes de diversas
variantes de proteínas de superficie (VIR) que se encuentran en las regiones
subtelomeric [44] y puede estar relacionado con los genes del Rif, de P. falciparum y
los genes de P. yir yoelii [45] . La proteína de superficie muy variable var familia de
genes de P. falciparum no tiene orthologs en P. vivax. Los niveles de expresión de la
mayoría de los 274 genes vir en la matriz fueron inferiores a los de otros genes. El
promedio de los genes vir fue de 210 unidades (aproximadamente el percentil 35) con
el valor más alto en un momento dado (MaxExp Suplementario en el cuadro 1), en
comparación con 572 unidades (aproximadamente el percentil 80) en medio de otros
genes. Además 39 de los 109 genes en el genoma, que no fueron detectados como
expresados diferencialmente en ninguna muestra, fueron los genes vir. Sólo 27 de los
274 genes vir probaron mostró regulación diferencial fuerte (> 5 veces el cambio,
Panova <0,001) frente a 1.044 de los restantes 5.420 genes. Curiosamente, cuatro de
los genes más expresados vir (PVX_086860, PVX_096970, PVX_096980, PVX_096985)
estuvieron entre los más genes expresados en las dos muestras de la glucólisis asexual
alta, lo que indica posibles mecanismos alternativos de control de la expresión. Tres de
estos genes vir altamente expresadas son adyacentes el uno al otro lo que sugiere la
regulación coordinada de toda la región. Cui et al. También se encuentran estos tres
genes vir y otro gen en la misma región (PVX_096975) presentó el mayor número de
tecnologías ecológicamente racionales en sus muestras de los pacientes [12].

La mayoría de los miembros de las familias altamente expresado multigénica son co-
transcritos con las proteínas exportadas
parásitos de la malaria se sabe que poder decorar la superficie de los eritrocitos
infectados con las proteínas que juegan un papel en el secuestro y la evasión inmune.
Muchas de las proteínas exportadas contienen secuencias, llamadas motivos PEXEL o
VPS que dirigen fuera de la vacuola parasitófora y la superficie [46], [47] y muchos de
ellos miembros de la familia multigénica, presumiblemente debido a mayores niveles
de recombinación entre los miembros o epigenética conmutación entre los miembros
de la transcripción permite al parásito evadir la respuesta inmune del huésped a estas
proteínas expuestas. Muchos de los genes exportados en P. falciparum se transcriben
en específico, las etapas a mediados de trofozoito del ciclo celular del parásito [47]. El
número del valor de exportación de proteínas en P. vivax no es tan grande como en P.
falciparum, muy probablemente debido a problemas en el reconocimiento de PEXEL /
VPS motivos de esta especie. Por ejemplo, sólo 160 de las 346 proteínas contienen vir
predijo motivos de exportación [48]. Además de los genes vir los 20 miembros de la P.
vivax PHIST (plasmodios helicoidal subtelomeric intercalados) que se exporten familia
de genes (PV-fa-b) [49] en la matriz se espera que sean exportados, así como algunos
miembros de la PV- fam-h y las familias Pv-e fam.

Cabe destacar que muchos de los miembros de la familia multigénica, así como la
mayoría de las proteínas exportadas predijo que muestran la transcripción fuerte
diferencial de mostrar la expresión máxima en tan sólo una de nuestras muestras de
sangre el escenario, CM115 (Figura 4). Cinco de los ocho genes PHIST exportado, seis
de las diez de la familia Pv-fa-e de GTPasas RAD (algunos exportado), nueve de los 11,
PV-fa-d, y 9 o el 11 Pv-fam-a los genes que muestran fuertes (> 5 veces) la expresión
diferencial de nuevo pico en su mayoría en CM115. Aunque los genes vir muestran
niveles más bajos de expresión en general, muchos de los que son expresados
diferencialmente también máximo en CM115. Cabe destacar que 17 de los 38
expresadas por encima de 300 unidades de mostrar los niveles máximos de
transcripción en CM115 muestra. Muchos de los genes que muestran una regulación al
alza espectacular (hasta 100 veces) en CM115 muestra se transcribe en abundancia.
La PV-fa-d de la familia con 16 genes de función desconocida tiene dos genes en el 1%
de todos los genes calificados por la máxima expresión al igual que la PV-fa-expresión
de una familia de ricos triptófano antígenos (PvTRAg, máximo promedio en cualquiera
muestra = 1.969 unidades). Un antígeno de P. vivax ricos en triptófano, PvTRAg
(PVX_090265), ha mostrado una tasa de seropositividad muy alta la presencia de
anticuerpos en los pacientes de malaria por P. vivax [50]. Otro antígeno altamente
inmunogénico de esta familia multigénica es PvATRAg74 (PVX_101510), las versiones
recombinantes de los cuales mostraron actividad de unión de eritrocitos y fueron
reconocidos por los sueros de pacientes P. vivax probado [51]. Este gen también se
ubica en la parte superior del 1% de las transcripciones en el CM115. Muchos de los
genes exportados en P. falciparum se transcriben en específico, las etapas a mediados
de trofozoito del ciclo celular del parásito [47] y parece probable que la mayoría de los
parásitos en CM115 muestra asexuales son en esta etapa de exportación permisiva.
Así, muchos de los genes que están específicamente upregulated en CM115 puede
desempeñar un papel en la evasión inmune. Mientras que los genes implicados en la
replicación del ADN también son aumentada en CM115, estos mismos genes también
son aumentada en cigotos, mientras que los que codifican las proteínas exportadas no
puede ser. Estos datos ilustran muy bien cómo las colecciones al azar de datos de
expresión génica que pueden ser obtenidos a partir de un parásito olvidadas se pueden
utilizar para crear predicciones de alta calidad si los datos lo suficientemente aleatoria
y diversa aún está disponible. Los datos también muestran que una ventaja del uso de
muestras de los pacientes P. vivax es que un alto nivel de sincronía puede existir, que
es confirmado por los datos Bozdech (Figura 4).

Figura 4. Co-expresión de los miembros de la familia multigénica.

Nuestro conjunto de datos, así como la de Bozdech (muestras TP) de tres muestras
tomadas de los parásitos en la cultura de corto plazo se combinaron y se somete a la
agrupación jerárquica. Una parte del dendrograma se expande. En contraste con otras
áreas del dendrograma casi todos los genes son hipotéticas o miembros de familias
multigénicas, puede de que puedan ser exportados. Las áreas grises indican los
experimentos para los que no hay datos disponibles.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.g004
De los miembros del curso de las familias multigénica que comparten similitud de
secuencia pueden tener diferentes funciones celulares en función de su expresión en el
ciclo de vida del parásito. Un ejemplo es el grupo de genes de la proteasa de cisteína
que se refiere a los antígenos de repetir, serina (SERAS). En P. falciparum, PFB0325c,
uno de los siete genes SERA se expresa en los esporozoitos, mientras que los otros se
expresan en las etapas de sangre. La interrupción de este ortholog SERA, llamado ECP1
en P. berghei, los resultados en los parásitos que no son capaces de migrar fuera del
ooquiste [52]. Aunque P. vivax contiene 13 paralogs SERA cisteína proteasa, sólo el
ortólogo ECP1 (PVX_003790) se reguló dramáticamente en los esporozoitos (105X).
Otros dos mostraron regulación al alza sustancial en CM12 muestra. Ninguno de los
SERAS mostrar el resultado de la expresión máxima en CM115 muestra, ni ningún
miembro de la PV-fa-c, homóloga a la familia de genes SURFIN de P. falciparum. Estos
no son sensiblemente expresados en cualquiera de nuestras muestras y puede estar
funcionando en otras etapas de la vida.

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Exploración de circuitos de regulación transcripcional
En muchos organismos, incluyendo especies de Plasmodium, los genes que son co-
expresados motivos comparten secuencia en las regiones aguas arriba de sus páginas
de inicio de traducción [16]. Para determinar si esto sería cierto en P. vivax buscamos
motivos enriquecido en diversas agrupaciones OPI creado con nuestros datos o la
combinación de datos más grande. Aquí es posible 6-9 mers se cuentan dentro de un
grupo de genes co-expresados y estos números se comparan con el número que se
encuentran en todas las regiones de aguas arriba. Un p-valor corregido que da cuenta
de la hipótesis de múltiples pruebas entonces se computa. En general nos encontramos
con que el control de la transcripción se conserva y que muchos de los mismos
motivos, que aparecen para controlar la expresión génica en P. falciparum también
parecen controlar la expresión génica en P. vivax. Por ejemplo, una búsqueda imparcial
de secuencias excesivamente aguas arriba de los 70 genes específicos esporozoito con
secuencias del promotor (GO: GNF0006) en relación con las regiones superiores de la
totalidad de su genoma se encuentran un motivo similar al que está asociado con los
genes de P. falciparum esporozoitos. Esta secuencia supuesta reglamentación,
TGCATG, se encuentra aguas arriba de 44 de los 70 genes de P. vivax grupo específico
esporozoito-OPI. La probabilidad corregida de enriquecimiento por casualidad en esta
relativa establecida en el resto de las regiones de aguas arriba en el genoma es de
0,02. Además, 48 de 65 genes en la lista de genes SCOT figura el motivo TGCATG
(Tabla S6, p = 9,16 × 10-7). Esto es similar a la CATGCAG motivo PfM24.1 esporozoito-
regulador específico identificado en P. falciparum [16], compartiendo el núcleo
secuencia CATGC e idéntica a la secuencia (Tabla S6), vinculado por el factor de
transcripción P. falciparum ApiAP2 PF14_0633 [53] . El ortholog yoelii P. de este factor
de transcripción (PY00247) es uno de los más genes expresados en esporozoitos
intestino [10], apoyando la hipótesis de que esta proteína funciona como un activador
de la transcripción específicos esporozoito [25].

Una rica variedad de motivos de otro promotor se puede encontrar buscando en los
distintos grupos y otros OPI. La secuencia TGTAnnTACA se encuentra enriquecido en el
1000 bases aguas arriba de 383 genes de un grupo de OPI que contiene 12 de los 19
genes mencionados en el análisis de un desarrollo sexual de P. falciparum (GO:
PM16005087, 92/364 genes, p = 1,69 × 10 -26). Este motivo (Figura 5) es idéntico al
motivo que se encuentra en 65 de los 246 genes aumentan su expresión durante el
desarrollo sexual en P. falciparum [15]. Un grupo de genes enriquecido para los que
tienen un papel en la motilidad de deslizamiento dio el motivo TGTnnACA (genes de 86
o 155, p = 0,00224). Una búsqueda de un grupo con muchos genes está previsto que
participen en el desarrollo de merozoitos (GO: GNF0218) produjo el motivo GTGCA en
392 de 443 genes con una probabilidad de enriquecimiento por casualidad, de 4,31 ×
10-13. microarrays de unión a proteínas han demostrado que el P. falciparum AP2
factor de transcripción, se une PFF0200c este motivo [53]. También se encuentra
aguas arriba de los genes transcritos por P. falciparum durante esquizogonia [16]. Al
igual que con P. falciparum [54], la CACAC secuencia fue enriquecido en un grupo de
genes que contienen una gran cantidad de genes de replicación del ADN (GO:
0030894, 192 de 228 regiones promotoras, p = 4,7 × 10-6). Nuevos motivos también
fueron encontrados. Un grupo de enriquecimiento de los genes identificados en un
gametos masculinos (GO: PM16115694 [55]), dado el motivo CGTACA en 35 de 66
genes (p = 0,0645) y la secuencia GCTATGC se encuentra aguas arriba de 36 de los
105 genes con secuencias del promotor en el clúster que contiene muchos de los
componentes estructurales de los ribosomas (GO: 0003735, p = 0,007). Este motivo es
similar al sitio de unión para el factor de transcripción AP-2-O (TAGCTA) que funciona
como un regulador positivo de la expresión génica ookinete [56]. Mientras que estos
motivos no pueden ser los mismos, la expresión de las proteínas ribosomal es
aumentada por etapas ookinete y hay que tener en cuenta que el factor de
transcripción vinculante es probable que sea combinatoria y un determinado gen
puede tener múltiples sitios de regulación contenida dentro de su región aguas arriba.

Figura 5. motivos de secuencia asociados con determinadas etapas de expresión.

A. La figura muestra diferentes motivos relacionados con la expresión de diferentes

etapas del ciclo de vida. B. La alineación de las regiones promotoras mostrando el
motivo de desarrollo sexual. El motivo TGTAnnTACA fue descubierto en GO:
PM16005087 en 92 de las regiones promotoras 364 genes. Si bien la mayoría de los 92
genes eran hipotéticos, los 22 con una función prevista se muestran aquí. La distancia
es el número de bases antes del sitio de inicio de la traducción.

doi: 10.1371/journal.pntd.0000653.g005
Comienzo de la página Discusión
El análisis del transcriptoma de las etapas de la sangre y esporozoitos de P. vivax
revela que los mecanismos generales de crecimiento, el desarrollo, el metabolismo y
las interacciones huésped-parásito son compartidos por todas las especies de
Plasmodium. Algunas de las diferencias de expresión que existen entre las especies
puede proporcionar información sobre las bases moleculares y genéticas de las
diferencias biológicas que distinguen a la especie. Las diferencias más significativas
incluyen la formación de hipnozoitos por P. vivax, procesos patogénicos de la retención
y la variación antigénica, y la distribución geográfica más amplia de P. vivax en
regiones templadas. Sin embargo, el examen de un número mucho mayor de cepas
diferentes, probablemente será necesario determinar que las diferencias de las
diferencias que encontramos son probable que se deba a la especiación y que se
deben a la variabilidad de las cepas o la experimentación.

Debido a las dificultades de trabajar con P. vivax, la transcripción y estudios

proteómicos representan una de las maneras más eficaces para encontrar genes
candidatos para vacunas u otros procesos. Muchos de los genes que se agrupan con
los antígenos para las vacunas probadas preeritrocíticas como CSP puede valer la pena
investigar sobre todo si los sueros procedentes de individuos que viven en regiones
endémicas de P. vivax muestra reactividad cruzada con las proteínas afines [57]. Un
análisis de datos de alto rendimiento por P. falciparum proteómicos [58] reveló una
proteína denominada esporozoito excepcionalmente abundantes Ag2 en P. falciparum
[59] o Celtos en P. berghei [60], que era más inmunogénica de antígenos previamente
identificados como CSP. En P. falciparum es la transcripción abundantes tercera en
esporozoitos. un Ag2 de los antígenos pocos que es capaz de proporcionar inmunidad
entre especies y de hecho también les resulta altamente expresado en nuestra
muestra esporozoitos. Teniendo en cuenta que muchos de los genes SCOT muestran
una expresión fuerte sólo en las etapas de esporozoitos, que su alteración puede
conducir a esporozoitos atenuados genéticamente que no se puede desarrollar en el
hígado, pero que, sin embargo proporcionar inmunidad.

El gameto / datos de expresión cigoto y ookinete ofrece información sobre la biología

del intestino medio del mosquito de un parásito de la malaria segundo humanos que
infectan, y confirma la expresión de genes comunes etapa específica compartida por
varias especies de Plasmodium. Los procesos de desarrollo sexual, la meiosis y la
replicación del ADN se hicieron evidentes en el gameto / transcriptoma cigoto. Algunos
genes de proteínas de superficie ookinete mostrar el resultado de más alta expresión
en el gameto / fase de cigoto. Ookinetes producir proteínas de superficie específicas
etapa, proteasas secretadas y relacionados con la invasión plano proteínas de la
motilidad. Si bien se observa la regulación positiva de genes de la superficie celular
involucradas en la invasión en nuestra gametos / cigotos y ookinetes en relación con
las etapas asexuales, esta conclusión debe considerarse a la luz del hecho de que
nuestra expresión de genes fase asexual representado etapas anillo y trofozoito, pero
no esquizontes y la expresión de genes merozoito etapa, lo que predispone el análisis
contra los parásitos de la sangre etapa invasiva.

La función de la familia de genes vir aún se desconoce, pero los datos publicados
parece indicar que su función es fundamentalmente diferente de los genes var.
Mientras que P. falciparum genes var pantalla expresión mutuamente excluyentes sólo
durante las etapas maduras [61], diferentes vir [11], yir [62] y ref [63] los genes se
expresan en diferentes etapas dentro de la eritrocítica y gametocitos [64]. Estudios
previos mostraron que la expresión vir no es clonal, y subfamilias múltiples vir se
expresan en parásitos individuales de los pacientes infectados [65]. Este es el soporte
de nuestro análisis de la expresión vir en vivo, con la expresión de alto nivel de un
pequeño subconjunto de los genes vir en la glucólisis, las muestras de alta junto con
otros genes, como los genes PvTRAG que puedan participar en la variación antigénica y
la evasión inmune. Sin embargo, el examen de los datos también muestran que los
niveles de expresión de los genes vir muchos fue muy bajos o no detectables, indicó
que puede ser silenciada. Está formalmente posiblemente que ninguno de los parásitos
que se recogieron en una etapa donde los genes vir están siendo activamente
transcrito, potencialmente, porque de secuestro. Los bajos niveles global también
podría atribuirse a que los parásitos mixta etapa en nuestras muestras, sin embargo
muchas otras células del ciclo de los genes regulados, como las histonas mostraron
fuertes (> 50) la expresión diferencial de veces en algunas de nuestras muestras de
sangre el escenario. Por último, las diferencias genéticas entre Vir gen de la cepa de
referencia del genoma, Salvador I, y las muestras del Perú [66] podría contribuir a
reducir los niveles de expresión, aunque se encontró una alta expresión de duda, para
otros miembros de familias de genes variables. Con excepción de estas advertencias,
nuestros datos son consistentes con un modelo en el que algunos genes son vir-
transcripcionalmente silenciadas.

El análisis aquí OPI ofrece predicciones funcional para un gran número de genes. Sin
embargo, su limitación es que utiliza los conocimientos existentes y es probable que
los grupos de interés de los genes pueden ser de función mixta, que se puede estimar
mediante el examen de las tasas de falsos positivos y verdaderos positivos en cada
grupo de consulta en la Tabla 2. En algunos casos, el enriquecimiento funcional puede
inducir a error y por lo tanto se debe tener precaución en la interpretación de las
etiquetas. Muchas de las proteínas exportadas y antígenos de la sangre etapa se
encuentran en un clúster de OPI llamado "actividad ribonucleasa" refleja el hecho de
que este es el único proceso celular bien anotado pasando en este momento.
Finalmente, 501 de los genes expresados diferencialmente no figuran en ninguno de
los grupos de OPI. Esto puede ser debido a que están jugando un papel de ookinete,
ooquistes o función hypnozoite. agrupamiento jerárquico tradicional o k significa-es
probable que la mejor manera de descubrir la función de estos genes (véase el sitio
web de compañía). Por último, 296 no se consideraron expresados diferencialmente.
Algunos de ellos pueden ser aumentada en las etapas esporozoito hígado o de
ooquistes o pueden ser silenciados.

Una de las cosas más notables sobre el análisis de expresión genética es su robustez y
la insensibilidad a la contaminación de la muestra o mezcla. Nuestro grupo figuran
algunos ejemplos se centró en los primeros parásitos estado sexual y sólo una muestra
de un solo cigoto y aún así fueron capaces de extraer los grupos de genes de los que
se podían extraer una transcripción desarrollo sexual motivo de los factores. Por
supuesto, el hecho de que no teníamos ooquistes esporozoito glándulas salivales o
etapas del hígado significa que este conjunto de datos no es exhaustiva y más trabajo
tendrá que ser hecho. Aunque P. vivax es de ninguna manera un modelo de los
organismos los datos de expresión génica descrito aquí puede ser más útil para
descubrir los motivos que participan en la regulación de la transcripción como el menor
contenido de AT puede ser menos problemático. También hay que señalar que los
éxitos no se depende de tener el mayor conjunto de datos estructurados Bozdech
como muchos de los motivos podría ser extraído de los grupos OPI creado con nuestros
datos por sí solos. Un grupo de genes enriquecido para los que tienen papeles en el
desarrollo sexual (GO: PM16005087) podría ser extraída de los datos cuando se
agrupan de forma independiente (p 7 de los 19 genes en un grupo de 172, = 10.05) y
podría ser utilizado con motivos hallazgo. Sin embargo hay grupos de genes
enriquecido para los que tienen papeles en el desarrollo sexual se encontraron cuando
los datos Bozdech se analizó de forma independiente (véase el cuadro 2 de consulta).
Sin embargo, cuando los conjuntos de datos se combinaron, la calidad de la agrupación
mejorados (12 de los 19 genes en un grupo de 246, p = 8.10), aunque las muestras
Bozdech no se prevé que contienen parásitos sexuales etapa. Por lo tanto, más datos y
la diversidad es mejor.

Estos datos de expresión génica in vivo de las infecciones de los pacientes, los
gametos / cigotos, ookinetes y esporozoitos del parásito P. vivax proporcionan una
base importante y de referencia para futuros estudios. Numerosas diferencias en la
expresión génica sugieren muchas hipótesis a ser probada por los investigadores en el
laboratorio y en el campo, y puede ser utilizado para guiar el tratamiento de drogas y
el desarrollo de vacunas para P. vivax. Otros estudios pueden proporcionar las
correlaciones entre la variabilidad del parásito in vivo la expresión de genes entre las
muestras de los pacientes y los fenotipos de la gravedad de la enfermedad y la
resistencia a los medicamentos. En combinación con precisión los resultados de
tratamiento de drogas y los datos del paciente, vamos a comenzar a identificar los
principales determinantes de las interacciones huésped-parásito en este agente
patógeno importante.