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Encyclopédie Médico-Chirurgicale 16-537-C-11

16-537-C-11

Tests de génotoxicité
M Kirsch-Volders
M De Boeck
D Lison
Résumé. – Cinq tests de génotoxicité utilisés couramment pour le biomonitorage sont présentés : le test de la
comète, celui des échanges entre chromatides sœurs, le test des micronoyaux, l’analyse des mutations
géniques sur le locus HGPRT ainsi que l’étude des aberrations chromosomiques. Une comparaison
systématique de ces tests souligne leur principe, la méthodologie pratique, leurs avantages et désavantages
ainsi que les facteurs de confusion à prendre en compte dans l’interprétation des résultats.
© 2002 Editions Scientifiques et Médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Mots-clés : comète, échange entre chromatides sœurs, aberrations chromosomiques, micronoyau, HGPRT.

Test de la comète (« single cell gel CARACTÉRISTIQUES DU TEST DE LA COMÈTE

electrophoresis assay ») – Endpoint : dommage à l’ADN.


– Biomarqueur d’exposition et/ou d’effet précoce : des dommages
de l’ADN ne correspondent pas à des mutations fixées.
PRINCIPE
Le nom du test vient de la forme des images (comètes) analysées AVANTAGES
sous le microscope. Il comporte une électrophorèse en microgel qui
permet d’évaluer les dommages à l’acide désoxyribonucléique – Approche cellule par cellule.
(ADN) cellule par cellule. La version alcaline, introduite par Singh – Applicable dans plusieurs types cellulaires.
et al [17], détecte des cassures de l’ADN, sites alcali-labiles, sites de
– Ne nécessite pas une culture in vitro.
réparation incomplète et pontages [5, 18].
– Estimation possible de la capacité de réparation globale après
expériences de challenge in vitro.
MÉTHODE
– Rapide.
Ce test est habituellement réalisé sur des lymphocytes circulants
– Simple.
mais peut être utilisé pour analyser d’autres types cellulaires
(sperme, cellules desquamées : nasales, buccales). Les cellules sont – Coût minimal.
mélangées avec de l’agarose, étalées sur lame de microscope. – Donne une indication de l’apoptose.
Ensuite, les cellules sont lysées avec des détergents et les protéines
sont extraites par des solutions salines. L’ADN nucléaire restant est
dénaturé dans un tampon alcalin et subit une électrophorèse dans le DÉSAVANTAGES
même tampon. Les fragments d’ADN, présents dans le noyau, – Le dommage à l’ADN détecté ne correspond pas à des mutations
peuvent migrer du noyau en direction de l’anode. Après fixées.
électrophorèse, les lames sont colorées avec un fluorochrome – Nécessite une référence interne pour éviter la variation
(exemple : le bromure d’éthidium). Un système d’analyse d’image interexpérimentale pendant l’électrophorèse.
est utilisé pour estimer plusieurs paramètres de dommage. Les plus
utilisés sont la longueur de la queue (tail length, TL), mesurée du
centre du noyau jusqu’à la fin de la queue ; le pourcentage d’ADN FACTEURS CONFONDANTS
dans la queue (tail DNA, TD) et le tail moment (TM = TL × TD). Pas bien précisés.
Pour la détection plus spécifique des dommages oxydatifs de l’ADN,
l’enzyme Fpg (formamidopyrimidine DNA glycosylase), qui détecte
l’adduit 8-hydroxydésoxyguanine et les sites Fpg-sensibles, peut être Test des échanges entre chromatides
incluse. sœurs (« sister chromatid exchange
test », SCE)

PRINCIPE
Micheline Kirsch-Volders : Professeur ordinaire.
Marlies De Boeck : Chercheur. Les échanges entre chromatides sœurs impliquent la cassure des
Vrije Universiteit Brussel, Laboratorium voor Cellulaire Genetica, Pleinlaan 2, 1050 Brussel, Belgique.
Dominique Lison : Professeur, université catholique de Louvain, unité de toxicologie industrielle et de
deux brins de l’ADN, suivie par un échange de duplex d’ADN
médecine du travail, Clos Chapelle aux Champs 30.54, 1200 Bruxelles, Belgique. entiers. Ceci se fait pendant la phase S du cycle cellulaire et est

Toute référence à cet article doit porter la mention : Kirsch-Volders M, De Boeck M et Lison D. Tests de génotoxicité. Encycl Méd Chir (Editions Scientifiques et Médicales Elsevier SAS, Paris, tous droits réservés), Toxicologie-
Pathologie professionnelle, 16-537-C-11, 2002, 4 p.

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16-537-C-11 Tests de génotoxicité Toxicologie
Pathologie professionnelle
induit par des mutagènes qui forment des adduits à l’ADN ou qui sans étape supplémentaire in vitro. Les MN observés dans des
interfèrent avec la réplication de l’ADN. La formation des SCE a été cellules exfoliées ne sont pas induits lorsque les cellules se trouvent
corrélée avec la réparation de recombinaison, avec l’induction des à la surface de l’épithélium mais au niveau basal.
mutations ponctuelles, l’amplification génique et la cytotoxicité. Une analyse ex vivo/in vitro des lymphocytes en présence de
cytochalasine B (ajoutée après 44 heures de culture), un inhibiteur
MÉTHODE des actines, permet de discriminer facilement entre cellules
mononucléées qui ne se sont pas divisées et cellules binucléées qui
Le test SCE est d’habitude effectué sur des lymphocytes humains ont effectué une division cellulaire pendant la culture in vitro [7].
du sang périphérique. Puisque les lymphocytes se trouvent en Dans ces conditions, les fréquences de cellules mononucléées
principe en phase G0 du cycle cellulaire, ils doivent, pour se diviser, contenant un MN fournissent une indication du niveau de base des
être stimulés par un antigène aspécifique, comme la mutations chromosomiques/génomiques accumulées in vivo. Les
phytohémagglutinine. Un inhibiteur du fuseau mitotique comme la fréquences de cellules binucléées contenant un MN indiquent le
colchicine est ajouté juste avant la fixation (après 72 heures de dommage accumulé avant la culture, et les mutations exprimées
culture) pour bloquer les cellules dans la (pro)métaphase de la pendant la première division in vitro.
deuxième mitose.
La combinaison du test du MN avec l’hybridation fluorescente in
Afin d’obtenir une coloration différentielle qui permet la
situ (FISH) pour une sonde spécifique pour la région
discrimination entre les deux chromatides, du bromo-désoxyuridine
(péri)centromérique des chromosomes permet la discrimination
(BrdU) est présent dans la culture pendant les deux cycles
entre MN contenant un chromosome entier (MN centromère positif)
cellulaires. Les chromatides dans lesquelles un brin d’ADN a
et un fragment acentrique d’un chromosome (MN centromère
incorporé du BrdU présentent une coloration de Giemsa foncée
négatif) [10].
normale. Les chromatides dans lesquelles deux brins d’ADN ont
incorporé du BrdU présentent une coloration moins foncée. Des En absence de cytochalasine B, les cellules mononucléées sont
échanges entre les deux chromatides sœurs sont donc détectés analysées pour la présence de MN, de préférence après 24 heures de
aisément (chromosome arlequin) [12, 14]. culture (à ce moment les MN observés résultent d’une division in
vivo et non d’une division ex vivo/in vitro). Les cellules binucléées
sont de préférence fixées après 72 heures de culture. Le meilleur
CARACTÉRISTIQUES DU TEST SCE moment pour évaluer la fréquence des cellules apopto-
– Endpoint : détection des sites réciproques, échange symétrique ou tiques/nécrotiques se situe 24 heures après le début de la culture [11].
asymétrique entre les chromatides sœurs d’un chromosome,
probablement lié à la réparation de recombinaison.
CARACTÉRISTIQUES DU TEST DE MICRONOYAU
– Biomarqueur d’exposition : les échanges de chromatides sœurs ne
correspondent pas à des mutations fixées. – Endpoint : mutations chromosomiques/génomiques.

– N’est pas un bon indicateur pour les radiations ionisantes. – Biomarqueur d’effet : pertinence pour l’estimation du risque pour
le cancer.
– L’expression d’un MN nécessite une division cellulaire.
AVANTAGES
– Les MN peuvent contenir un chromosome complet ou un
– Approche cellule par cellule.
fragment acentrique.
– Codétection possible de la prolifération cellulaire.
– Discrimination entre cellules mononucléées et cellules binucléées
– L’estimation des cellules à fréquence élevée d’échanges (HFC) en présence de cytochalasine B : cellules mononucléées = dommage
offre une plus grande puissance statistique. accumulé avant la culture ; cellules binucléées = dommage accumulé
avant la culture + dommage exprimé pendant la culture.
DÉSAVANTAGES
– Ne détecte pas des mutations. AVANTAGES
– Nécessite une culture in vitro (deux mitoses). – Avec/sans cyto-B :
– Nécessite l’addition de BrdU. – approche cellule par cellule ;
– Prend beaucoup de temps. – détection simultanée des mutations chromosomiques et
génomiques ;
FACTEURS CONFONDANTS – discrimination entre clastogène et aneugène ;
Surtout : tabagisme. – codétection possible d’apoptose et de nécrose ;
– applicable dans plusieurs types cellulaires ;
Test du micronoyau (MN) – rapide ;
– coût minimal ;
PRINCIPE – simple ;
Un MN est formé pendant la transition métaphase/anaphase de la
– possibilité d’automatisation ;
mitose (division cellulaire). Un MN peut contenir un chromosome
complet (événement aneugène menant à la perte d’un chromosome) – puissance statistique.
ou bien un fragment acentrique d’un chromosome (événement – Avec cyto-B :
clastogène) qui ne s’est pas intégré dans les noyaux filles.
– discrimination entre cellules qui ont subi la division cellulaire
et cellules qui ne l’ont pas subie ;
MÉTHODE
– détection possible des ponts dicentriques et nucléoplasmiques ;
L’évaluation des MN peut être réalisée de façon relativement simple
et dans différents types de cellules importants pour le biomonitoring – estimation de la prolifération cellulaire ( % de cellules
humain : lymphocytes, fibroblastes et cellules épithéliales exfoliées, binucléées).

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Toxicologie Tests de génotoxicité 16-537-C-11
Pathologie professionnelle
DÉSAVANTAGES – Le gène hgprt est considéré comme modèle pour les mécanismes
– Avec/sans cyto-B : de mutagenèse.

– ne détecte pas toutes les aberrations structurelles (seulement les – Détermination possible de l’effet de la réparation de l’ADN sur la
fragments acentriques) ; fréquence et le spectre des mutations géniques.
– nécessite une division cellulaire pour exprimer un MN .
– Avec cyto-B : DÉSAVANTAGES

– interférence possible de cyto-B avec des produits chimiques – Travail intensif.


comme des inhibiteurs du fuseau ; – Sensibilité modérée.
– interférence possible avec autres inhibiteurs de la cytokinèse ; – Demande des compétences et des expertises spécifiques.
– cytotoxicité de cyto-B même qui varie selon type cellulaire et – Demande plusieurs divisions cellulaires.
parfois selon subtype du même type cellulaire.

FACTEURS CONFONDANTS FACTEURS CONFONDANTS

– Âge. – Sexe.
– Tabagisme ? – Âge ?

Mutations géniques sur le locus Test des aberrations chromosomiques


hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransférase PRINCIPE
Les aberrations chromosomiques structurelles peuvent être induites
PRINCIPE par des cassures d’ADN causées par différents types de mutagènes.
Localisé sur le chromosome X chez l’Homme, le gène hgprt code Ces cassures d’ADN peuvent se rejoindre de façon à ce que le
l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase, qui joue un rôle chromosome soit restauré dans son état original. Elles peuvent se
dans la synthèse des bases puriques. Outre son substrat normal, rejoindre incorrectement ou ne pas se rejoindre du tout. Les deux
hgprt catalyse la transformation des analogues puriniques comme la derniers cas peuvent être observés sur des préparations
6-thioguanine (6-TG) ce qui les rend cytotoxiques pour les cellules microscopiques des cellules en métaphase. Cependant, certains de
normales. Des cellules avec une mutation dans le gène hgprt ne ces changements ne permettront pas la survie cellulaire après
peuvent pas phosphoribosyler l’analogue et survivent donc à un division, mais servent comme indicateurs de l’induction de
traitement par la 6-TG [1, 2]. changements plus petits, non observables, qui permettent la survie
cellulaire mais qui auront des conséquences fatales pour
l’organisme.
MÉTHODE
Après prélèvement du sang et isolement des cellules mononucléées,
les cellules sont comptées et cultivées sur plaque dans un milieu MÉTHODE
sans 6-TG pour déterminer l’efficience du clonage non sélectif et Le test des aberrations chromosomiques est surtout réalisé sur les
dans un milieu contenant la 6-TG pour déterminer l’efficience du lymphocytes sanguins [6, 15]. Puisque les lymphocytes se trouvent en
clonage sélectif [13]. Les cultures sont incubées durant une période phase G0 du cycle cellulaire, ils doivent, pour se diviser, être
suffisamment longue pour permettre aux colonies de se former et stimulés par un antigène aspécifique, comme la phytohémagglu-
de faciliter la distinction des puits positifs. Ensuite, les puits sont tinine. Après 46,5 heures de culture, juste avant la fixation (à
évalués comme positifs ou négatifs sous microscope inversé. Les 48 heures), un inhibiteur du fuseau mitotique comme la colchicine
colonies visibles sont considérées comme mutantes. La fréquence est ajouté pour bloquer les cellules dans la (pro)métaphase de la
des mutants est le rapport entre les valeurs de clonage calculées première mitose.
dans le milieu sélectif et dans le milieu non sélectif.
Les aberrations chromosomiques peuvent être classées en deux
Le test HGPRT est capable de détecter les substitutions de bases de
catégories principales : les aberrations de type chromosomique,
l’ADN, importantes délétions, petites inversions et recombinaisons
impliquant les deux chromatides d’un chromosome, et les
somatiques entre chromosomes non homologues. Une augmentation
aberrations de type chromatidique, n’impliquant qu’une des deux
statistiquement significative des fréquences de mutants dans une
chromatides. Les radiations ionisantes induisent des aberrations de
population exposée par rapport à une population contrôle est
type chromosomique (aberrations symétriques), comme des
considérée comme un résultat positif [4, 16]. Un résultat positif signifie
chromosomes dicentriques, inversions, chromosomes circulaires,
donc que l’agent induit des mutations géniques in vivo dans les
dans la phase G0 ou G1 du cycle cellulaire (avant réplication). Les
lymphocytes des individus exposés. Un des avantages de ce test est
aberrations de type chromatidique (aberrations asymétriques),
qu’il permet dans un second temps la caractérisation moléculaire
comme des cassures et des trous, sont produites pendant la phase S
des mutations induites par une analyse des colonies survivantes.
ou G2 du cycle cellulaire (pendant ou après réplication). La plupart
des mutagènes chimiques sont des clastogènes S-dépendants et
CARACTÉRISTIQUES DU TEST HGPRT produisent donc des aberrations de type chromatidique.
– Endpoint : mutations géniques sur le locus HGPRT. Plusieurs types d’aberrations peuvent être distingués :
– Biomarqueur d’effet : pertinence pour l’estimation du risque pour – aberrations structurelles :
le cancer.
– trous ;
– Détermination de la cytotoxicité.
– cassures ;
AVANTAGES – chromosomes dicentriques ;
– Détermination possible du spectre des mutations géniques. – chromosome circulaire ;

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Pathologie professionnelle
– aberrations numériques : – Identification avec précision des différents types de mutations
chromosomiques.
– polyploïdie (4n).
– Codétection des indices mitotiques possible.
– Bonne valeur prédictive pour le cancer.
CARACTÉRISTIQUES DU TEST DES ABERRATIONS
CHROMOSOMIQUES
– Endpoint : mutations chromosomiques (et génomiques). DÉSAVANTAGES

– Biomarqueur d’effet : important pour l’estimation du risque pour – Demande une culture in vitro.
le cancer [3, 8, 9]. – Travail intensif.
– Discrimination entre aberrations de type chromatidique et de type – Demande des compétences et des expertises spécifiques.
chromosomique.
FACTEURS CONFONDANTS
AVANTAGES – Tabagisme.
– Approche cellule par cellule. – Âge.

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