16/04/2009

NUTRIÇÃO E CULTIVO DE
MICRORGANISMOS

Verônica Ortiz Alvarenga

Introdução
• O termo crescimento refere-se ao
aumento do número de microrganismos
presentes na população.

• Este aumento é obtido através de

divisão binária, processo em que uma
célula dá origem a duas outras pela
separação do material celular em duas
metades equivalentes

Nutrição microbiana

• Fornecimento de nutrientes

Síntese de macromoléculas

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Exigências Nutricionais
• ÁGUA
– Essencial para os microrganismos:
absorção nutrientes dissolvidos
– Disponibilidade variável no ambiente
– Se ambiente possui < concentração de
água: célula aumenta
– Concentração de solutos internos
(bombeamento de íons para o interior
– Celular ou pela síntese de solutos
orgânicos)

Exigências Nutricionais
• ENERGIA

Exigências Nutricionais
Tipo Fonte de Energia Fonte de Carbono
Fotolitotrófico (ou Luz CO2
fotoautotrófico)
Fotoorganotrófico (ou Luz Composto orgânico
fotoheterotrófico)
Quimiolitotrófico (ou Oxidação de composto CO2
quimioautotrófico) químicos inorgânicos
Quimioorganotrófico Oxidação de composto Composto orgânico
(ou químico orgânicos
quimioheterotrófico)

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Exigências Nutricionais
• CARBONO
– todos os organismos requerem alguma
forma de carbono
– esqueleto das 3 maiores classes de
nutrientes orgânicos : lipídeos,carboidratos
e proteínas: fornecem energia para o
crescimento e servem como unidade básica
para biossíntese
– heterotróficos utilizam compostos orgânicos
como fonte de carbono
– autotróficos utilizam o CO2 como fonte de
carbono

Exigências Nutricionais
• NITROGÊNIO
– todos os organismos necessitam em
alguma forma
– parte essencial dos aminoácidos
(proteínas) e ácidos nucléicos
– bactérias são mais versáteis para N que
eucariotos
– podem utilizar o N2 (fixação biológica),
nitratos, nitritos e sais de amônia
– em geral compostos nitrogênio
orgânico: aminoácidos e peptídeos

Exigências Nutricionais
• ENXOFRE, HIDROGÊNIO E FÓSFORO
– essenciais a todos os organismos
– S é necessário na biossíntese de cisteína,
cistina, metionina e de vitaminas (tiamina e
biotina)
– P é essencial para a síntese de ácidos
nuclêicos e ATP
– sais inorgânicos (sulfatos e fosfatos) podem
ser utilizados para suprir
– estes elementos também presentes em
fontes protêicas (aa), DNA e RNA
– alguns destes elementos são encontrados
na água ou na atmosfera

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Exigências Nutricionais
• POTÁSSIO, MAGNÉSIO, CÁLCIO E
FERRO
– K, Mg cofatores enzimático

– Ca estabilização parede celular e

formação de endosporos

– Fe faz parte dos citocromos, e proteínas

transporte elétrons

Exigências Nutricionais
• MICRONUTRIENTES OU ELEMENTOS
TRAÇO:
– Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr
– necessários em concentração muito
baixa (µg/L)
– cofatores de enzimas
– geralmente não é preciso adicionar:
presentes na água
– se água desmineralizada: adicionar
solução elementos traços

Exigências Nutricionais
• FATORES DE CRESCIMENTO:
– compostos orgânicos: vitaminas,
aminoácidos, purinas e pirimidinas

– muitas vitaminas (tiamina, biotina,

cobalamina) atuam como coenzimas

– alguns m.o. não sintetizam os fatores

que devem ser disponíveis no meio

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Condições de cultivo
• Temperatura
importante, pois os
microrganismos não possuem qualquer
mecanismo de controle interno deste fator,
o que pode afetar as reações químicas da
célula.
– Psicrófilos: ou microrganismos que crescem em
baixas temperaturas (7- 20ºC);

– Mesófilos: ou microrganismos que crescem em

temperaturas moderadas (25 – 40ºC);

Condições de cultivo
– Termófilos: ou microrganismos que crescem em
altas temperaturas;
• Baseado nesta temperatura tem-se os
seguintes grupos:
– Hipertermófilos: toleram ou crescem em
temperatura de 100 oC ou mais
– Psicrotróficos: não possuem um ótimo de
temperatura. Crescem a 7 oC ou menos, alguns
crescem abaixo de 0 oC e outros podem crescer
em temperaturas entre 37 e 45 oC;

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Condições de cultivo
• Exigências atmosféricas
os
microrganismos podem ser divididos, ainda,
de acordo com o seu requerimento em
oxigênio e gás carbônico.
– Aeróbios obrigatórios: são microrganismos que,
para crescerem e se multiplicarem, necessitam
de uma atmosfera que contenha O2 em uma
concentração equivalente ao ar atmosférico (20-
21%).
Ex: micobactérias, fungos filamentosos (bolores);

Condições de cultivo
– Microaerófilas: o oxigênio requerido para
multiplicação é menor do que aquele encontrado no
ar atmosférico (cerca de 5% de O2)
Ex: Espécies de Campylobacter, causadora da diarréia;
– Anaeróbios estritos: crescem somente na ausência
total de oxigênio.
Ex.: Clostridium botulinum;
– Anaeróbios facultativos: crescem tanto na presença
como na ausência de oxigênio.
Ex.: Enterobactérias, estreptococos e estafilococos;
– Anaeróbios aerotolerantes: não requer oxigênio e
cresce melhor na sua ausência, mas pode
sobreviver em atmosferas que contenham o mesmo.
Ex.: Lactobacilos.

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Condições de cultivo

Culturas de microrganismos
mostrando na seqüência aeróbios,
anaeróbios estritos, anaeróbios
facultativos, microaerófilos e
anaeróbios aerotolerantes.
Fonte: Brock et al. (1991).

Condições de cultivo
• O2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor
de elétrons na respiração
• Processos celulares geram formas reativas de O2
• Espécies reativas são oxidantes poderosos que
destroem constituintes celulares

• células devem ser capazes de se proteger contra

estas espécies reativas para manter sua
integridade.

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Condições de cultivo
• Superóxido dismutase (SDO) e
catalase são as enzimas mais
importantes
– Presença de catalase é variável

– aeróbios, facultativos, microaerofílicos e

aerotolerantes possuem SDO

– Anaeróbios estritos não possuem estas

enzimas e portanto não conseguem
sobreviver na presença de oxigênio

Condições de cultivo

Condições de cultivo

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Condições de cultivo

Condições de cultivo
• O envelope de Gaspak gera através
de adição de água H2 e CO2

• Jarra é fechada e O2 presente é

removido por reação com o H2
catalisada pelo paládio formando água

• usada para anaeróbios aerotolerantes

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Condições de cultivo

• Exigência em Gás carbônico

– Algumas bactérias crescem melhor na
presença de concentrações aumentadas
de CO2 , tais organismos são chamados
de capnofílicos.
Ex.: Campylobacter.

Condições de cultivo
• pH
– fator limitante do crescimento microbiano.
– A maioria das bactérias cresce bem em
meios com pH ao redor de 7,0
– Muitas espécies tolerarem variações de pH
entre 4,0 e 9,0
– Ótimo de crescimento se localiza entre 6,5 e
7,5.
– Poucas bactérias podem se desenvolver
abaixo de pH 4,5-5,0
mas esses são os
limites preferidos pelos fungos e leveduras.

Condições de cultivo

• pH

– Thiobacillus thiooxidans que transforma o

enxofre em ácido sulfúrico, e cresce bem a pH
1,0

– Vibrio comma, agente causador da cólera

asiática, que desenvolve a pH 10,0.

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Condições de cultivo
• Pressão Osmótica
– meios de cultura com pressões
osmóticas inferiores da célula,
geralmente não afetam sua viabilidade

que a rigidez da parede celular impede a
entrada excessiva de água.
– Entretanto, meios de cultura com
pressões osmóticas mais elevadas

causam a perda de água intracelular,
podendo ter efeito bacteriostático ou
bactericida.

Condições de cultivo
• Isotônico - onde a concentração de solutos em
um meio é igual àquela no interior da célula.
Não há movimento de água para dentro e para
fora da célula
• Hipertônico - concentração de solutos fora da
célula é maior que no interior. A água flui para
fora da célula resultando na desidratação e
contração da célula
• Hipotônico - a concentração de soluto no
interior da célula é maior que fora dela. A água
flui para dentro da célula: pode inchar e se
romper - plasmólise

Condições de cultivo
• Outras Exigências
• Halofílicos
crescem melhor em
concentrações aumentadas de sais.
– Geralmente as bactérias crescem em
concentrações de 0,9 %.
– Bactérias Halófilas facultativas (2 a 15% de
NaCl)
– Bactérias Halófilas extremas (30% de sal)
• Xerofílicos
crescem melhor em ambientes
mais secos, com menor teor de água.
• Osmofílicos
crescem melhor em
ambientes com altos teores de açúcares.

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Condições de cultivo

Condições de cultivo
• Meio de cultura
preparação contendo
os nutrientes necessários para cultivar e
manter microrganismos viáveis em
laboratório.
• Duas grandes classes de meios de
cultura
– Meio definido ou sintético: composição
química exata é conhecida
– Meio complexo: composição química exata
não é conhecida (composto por extratos
naturais de carne, levedo, proteínas
hidrolisadas)

Condições de cultivo

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Condições de cultivo
• Substratos para meios complexos:
– Extrato de Carne: extrato aquoso de
tecido muscular, concentrado sob a
forma de pasta, contém carboidratos, N
orgânico, vitaminas hidrossolúveis e sais.
– Peptona: produto da digestão da carne
(enzimática ou ácida), fonte de N
orgânico e vitaminas.
– Triptona: hidrolisado pancreático de
carne , rica em nitrogênio-amínico;
destinado ao isolamento de organismos
de difícil crescimento.

Condições de cultivo
• Substratos para meios complexos:
– Extrato de Levedura: extrato aquoso de
células de leveduras lisadas, fonte excelente
de substâncias estimulantes do crescimento
como vitamina complexo B; contém
compostos orgânicos de N e C.
– Extrato de malte: extrato aquoso de cevada
malteada. Rica em carboidratos, contém
material nitrogenado, vitaminas e sais
minerais.
– Tripticase: peptona derivada da caseína por
digestão pancreática,fonte rica em
nitrogênio de aminoácidos.

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Condições de cultivo

• Meios complexos são altamente

nutritivos
– geralmente mais fáceis de preparar

– são os mais usados ( composição exata

não é necessária)

– mais adequados para fastidiosos

Condições de cultivo
• Quanto ao estado físico os meios podem ser:
– líquidos: (caldos) nutrientes são dissolvidos em
água e esterilizados
– sólidos: são preparados a partir da adição, ao
meio líquido de um agente solidificante, antes
da esterilização do meio.
– ágar-ágar: polissacarídeo obtido de algas
marinhas . Usado como agente solidificante dos
meios. Funde a 100°C e gelifica qua ndo a
temperatura é menor de 45°C. Concentração
1,5 - 2% p/v. Não serve como nutriente!!!!
– semi-sólidos: obtido através da adição de uma
quantidade reduzida de agente solidificante (0,3
a 0,5% de ágar)

Condições de cultivo
• Meios líquidos: multiplicação celular ;
processos industriais em reatores
• Meios sólidos: usados para imobilização
de m.o. em placas ou tubos
– aparecimento de massas celulares: colônias
– Colônia: originada da multiplicação de m.o.
em meio sólido importante para a
caracterização dos m.o. para colônia ser
visível : ≈1 x 106 células são isolados em
meios sólido visando obtenção de culturas
puras
– Cultura pura: contém um único tipo de m.o.
sem contaminantes

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Condições de cultivo

Condições de cultivo

Meios de cultura com finalidades

especiais
• Meios Seletivos
permitem crescimento
de um tipo particular de microrganismo
suprimindo o desenvolvimento de outros
– ágar Sabouraud: pH 5,6 e alta concentração de
glicose (seletivo para fungos)
– ágar verde brilhante: seletivo para
enterobactérias Gram - (Salmonella); o corante
verde brilhante adicionado ao meio inibe as
bactérias Gram (+)
– Adição de antibióticos: seletivos para os m.o.
resistentes à estes agentes antimicrobianos

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Meios de cultura com finalidades

especiais

Meios de cultura com finalidades

especiais

• Meios diferenciais : permitem a distinção

entre diferentes grupos de m.o.

– Produção de enzimas: adição substrato e

verificação halo hidrólise

– Hemólise em ágar sangue: Streptococcus e

Staphylococcus hemolíticos

Meios de cultura com finalidades

especiais

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Meios de cultura com finalidades

especiais
• Meios Seletivos/Diferenciais
agem como
seletivos e diferenciais muito úteis no
diagnóstico de patogênicos (coliformes fecais)
– Ex: ágar MacConkey - contém sais biliares e corante
cristal violeta, que inibem o crescimento de
Gram + e permitem o desenvolvimento de
Gram - e ainda lactose e o indicador
vermelho neutro, que distingue as Gram
negativas produtoras de ácido (vermelhas)
das Gram negativas não produtoras de
ácido (amarelas) identificação de coliformes

Meios de cultura com finalidades

especiais

Meios de cultura com finalidades

especiais
• Meios de Enriquecimento
usados para
selecionar microrganismo presente em
pequenas quantidades em relação à população
de um ambiente.
– favorece o crescimento da espécie desejada,
mas não o crescimento das outras espécies
presentes em uma população mista

– Ex: isolamento de bactérias que oxidam o fenol

- podem ser isoladas de amostras do solo,
utilizando meio de enriquecimento, contendo
sais de amônia, e fenol como única fonte de
carbono e energia somente os microrganismos
capazes de oxidar o fenol estarão presente em
grande número depois de vários cultivos

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Meios de cultura com finalidades

especiais

• Meios de Estocagem
utilizado para a

manutenção da viabilidade e das
características fisiológicas de uma cultura

– meio diferente do ótimo para o crescimento -

desenvolvimento rápido: morte rápida

– a glicose favorece o crescimento, preferível

omiti-la na preparação de um meio de
estocagem.

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