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Plan de cours MCB 1980

 
1) Description du cours; classification et historique

2) Structure et composition des bactéries


 
3) Nutrition et croissance des microorganismes
 
4) Action des agents physiques et chimiques sur les
bactéries

5)  Génétique bactérienne

6)  Relation hôte-microorganisme

1
La croissance des microorganismes
Définition : La croissance est définie par un accroissement du nombre
de cellules ou de la masse cellulaire totale  multiplication=division

•  Chez la plupart des procaryotes, la croissance d’une


cellule se poursuit jusqu’à sa division en deux nouvelles
cellules par fission binaire (scissiparité) lorsqu'on parle de croissance on parle
d'une population et non de la cellule.

2
Courbe de croissance microbienne
•  La courbe de croissance d'une population bactérienne se
développant dans un milieu de culture liquide (système fermé; en
‘batch’ ou discontinue) peut être représentée par le log10 de la
concentration bactérienne (bact./ml) en fonction du temps
d'incubation (heures).
culture fermé en tube
On observe alors 4
phases de croissance:

-latence,
-exponentielle,
-stationnaire et
-de mortalité

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1) Phase de latence

-  Phase d’adaptation dans laquelle il n’y a aucune division cellulaire


durée peut être très longue comme elle peut être très courte
La durée de la phase de latence varie en fonction :
- de l'âge des bactéries
- de l'origine (composition et température du milieu)
le changement de milieu va influencer le temps de latence

4
2) Phase de croissance exponentielle (log)
population la + homogène

2) Exponentielle (logarithmique) :

- Accélération de la croissance des bactéries ainsi que de la division


cellulaire
- Les microorganismes se développent et se divisent à la vitesse maximale
- La population est uniforme (propriétés chimiques et physiologiques)
- La phase de croissance exponentielle est de courte durée…
- Relation entre la concentration des nutriments et la croissance

5
Phase stationnaire et phase de mortalité

3) Stationnaire: il y a tjrs de la division mais il a aussi de la mortalité, donc la population reste stable.
- Le nombre total de microorganismes viables reste constant (Équilibre
entre division et mort cellulaire) (109 cellules/ml)

Causes: - Limitation des nutriments


- Accumulation de conditions défavorables (déchets
toxiques, acidité,…)

4)  Phase de mortalité :


- Arrêt de la division cellulaire
- Le nombre de bactéries viables diminue de façon constante en fonction
du temps

Causes:
- Dégâts irréparables conduisant à une perte de viabilité
- Réponse génétique déclenchée (Mort cellulaire programmée)
- Formation de cellules viables non cultivables (VNC) (dormance)
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La culture continue (ouvert)

•  Apport de nutriments
•  Elimination des déchets
•  La phase de croissance exponentielle est maintenue sur
une longue période
•  Concentration constante de la biomasse
•  Il y a 2 types: Chémostat et turbidostat
–  Chémostat : Apport constant de nutriments à la même
vitesse que le milieu est éliminé
–  Turbidostat: vitesse de dilution déterminée par la
densité

7
Le chémostat

Système de culture continue (ouvert)

8
Mesure de la croissance des microorganismes
1)  Méthodes directes:

A) Décompte total des microorganismes (dépend de la taille)

- Compteur Coulter et Cytomètre de flux (protistes, levures et cellules


mammifères)

- Chambre de comptage observée au microscope


•  Hémocytomètre: Les levures et cellules mammifères
•  Cellule de Petroff-Hausser: Les bactéries

Avantages: - facile à utiliser, rapide et peu coûteux


- informations sur la taille/morphologie des microorganismes

Désavantages: - densité microbienne élevée (petit volume)


- décompte des cellules mortes et vivantes
*Il existe maintenant des kits commerciaux permettant de distinguer les cellules mortes et vivantes (Live/Dead
BacLight Bacterial Viability)

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Chambre de comptage observée au microscope

Hémocytomètre:
Dimensions:
0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 1/10000 cm3

Cellules/ml: 10000 x cellules comptées x


facteur de dilution

Cellule de Petroff-Hausser:
Dimensions : 10 fois plus petit que
l’hémocytomètre
Cellules/ml: 100000 x cellules comptées x
facteur de dilution

Live/Dead BacLight Bacterial


Viability
10
Décompte des unités viables
B) Décompte des unités viables
(capables de se reproduire)

- Méthode des dilutions en milieu liquide et d'étalement


sur gélose
- Méthode des filtres de cellulose

Avantages: les colonies proviennent seulement des


cellules vivantes capables de se reproduire

Désavantages: Amas de cellules = 1 colonie

= Unités Formant des Colonies (UFC)

*Résultat significatif entre 30-300 colonies

TP séance #3 11
Décompte des unités viables
Méthode des filtres de cellulose
L’échantillon est passé sur un filtre de cellulose dont la porosité
retient les microorganismes

12
Prescott, Fig 7.19
Mesure de la croissance des microorganismes

2)  Méthodes indirectes


A) Mesure de l’activité

- En mesurant la consommation de substrats (C, N2, O2 ou un facteur


spécifique de croissance), la concentration des constituants cellulaires (ATP,
FAD ou FMN, ADN, protéines) ou l'excrétion de certains produits (CO2 ou NH3),
il est possible d'évaluer la concentration microbienne d'un échantillon

B) Mesure de la masse cellulaire

- Poids sec
•  Récolte des microorganismes (filtration sur membrane)
•  Lavage + dessiccation (100 à 110oC)
•  Pesée (toutes les bactéries, mortes ou vivantes sont pesées)
•  Valeurs exprimées en g/L

- Turbidité par la densité optique (D.O.): Turbidimétrie

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Turbidimétrie
Évaluation de la concentration cellulaire à l'aide de sa densité optique [D.O.]
(absorption lumineuse) à une certaine longueur d'onde (Ex 600 nm)

•  Dans une certaine limite (106/ml < [ ] < 108/ml), la D.O. d'une suspension


microbienne est directement proportionnelle à sa concentration cellulaire

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Prescott, Fig. 7.21
Expression mathématique de la croissance bactérienne

A) Temps de génération ou de doublement (g)


-Intervalle de temps entre deux divisions cellulaires successives

g = t/n (t = Temps, n=nombre de générations)


Ex: Escherichia coli (20 min)
Mycobacterium tuberculosis (800 min)

B) Taux de croissance (k)


- Nombre de générations par unité de temps (inverse du temps de génération)
k = n/t (t = Temps, n=nombre de divisions)
Ex: Escherichia coli (3/h)
Mycobacterium tuberculosis (0,075/h)

C) Nombre de générations (n)


n = (LogNt – LogNo)/log2
Nt: nombre de cellule au temps t
No: nombre initial de cellule de la population

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Les besoins nutritifs courants

Glucide, lipide,
Macroéléments protéine, acide
nucléique

co-facteur d’enzyme

Microéléments
(oligoéléments)
Besoins particuliers

TP séance #3

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Les besoins nutritifs courants
Voir manuel de TP
Nutriments:
substances utilisées pour la biosynthèse et la conversion
de l’énergie requis pour la croissance microbienne

-10 éléments nécessaires en grandes quantité (macroéléments)


pour la synthèse de macromolécules (C HOPK’NS) (’= Fe, Ca, Mg)

-C : nécessité d’une source de carbone


-H et O (hydrogène et oxygène)
H2O (eau: indispensable)
pH (sensible à la concentration en H+)
O2 (indispensable à toxique)

-Facteurs de croissance (acides aminés, vitamines et bases


azotés)

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Classification des microorganismes 

selon leurs besoins nutritifs

Tous les êtres vivants ont besoin pour subsister:

- Source de carbone: Unité structurale de base de toutes molécules organiques


Autotrophes: CO2 seul ou principale source
Hétérotrophes: Molécules organiques préformées (Ex. glucide, lipide …)
- Source d’énergie
Phototrophes: Lumière
Chimiotrophes: Oxydation des composés organiques (Ex. glucose)
et inorganiques (Ex. H2S, NH4+, Fe2+,…)
- Source d’électrons (H/e-)
Lithotrophes: Molécules inorganiques réduites (H2S, NH4+, Fe2+,…)
Organotrophes: Molécules organiques réduites (Ex. glucose)
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Sources d’énergie des microorganismes
Phototrophie Chimioorganotrophie Chimiolithotrophie

Composé Composé Composé Composé


organique organique inorganique inorganique
réduit oxydé réduit oxydé

Énergie chimique

Travail

19
Prescott 2002, p174
Principaux types Sources d'énergie, Microorganismes
nutritionnels d’électrons et carbone représentatifs

Énergie lumineuse, Donneur Algues, Bactéries


Photolithoautotrophe sulfureuses pourpres et
inorganique, CO2
vertes, Cyanobactériie

Bactéries non sulfureuse


Photo-organohétérotrophe Énergie lumineuse, Donneur pourpres, Bactéries non
organique d’e-, Source organique sulfureuse vertes
de carbone

Chimiolithoautotrophe
Source chimique d'énergie Bactéries oxydant le
(inorganique), Donneur soufre, le fer, Bactéries
inorganique d’e-, CO2 oxydant l'hydrogène (H2),
Bactéries nitrifiantes

Chimiolithohététrotrophe Source chimique d'énergie Certaines bactéries


(inorganique), Donneur oxydatrice de soufre
inorganique d’e-, carbone
organique

**Chimio-organohétérotrophe Source chimique d'énergie Protozoaires, Mycètes, La


(organique), Donneur organique plupart des bactéries non
d’e-, Source organique de photosynthétiques, (la
carbone plupart des agents
pathogènes)

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Exigences Nutritionnelles
•  1) Carbone (C)

•  2) Azote (N)

•  3) Phosphore (P)

•  4) Soufre (S)

•  5) Ions inorganiques (Na+, K+, Mg2+, Fe2+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+)

•  6) Facteurs de croissance

•  7) Eau
•  8) Oxygène
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Exigences nutritionnelles en carbone (C)
(1)  Carbone: Unité structurale de base de toutes molécules organiques

A)  Source de carbone inorganique pour les autotrophes


- Les chimioautotrophes et les photoautotrophes peuvent utiliser le CO2
comme seule source de carbone pour la biosynthèse de leurs
macromolécule

B) Source de carbone organique pour les hétérotrophes


- Substances hydrocarburées (glucides, protides, lipides, hydrocarbures, acides
organiques, polyalcools,…)

- Presque toutes les substances carbonées peuvent être dégradées

- Lorsque aucun chimiohétérotrophe ne peut dégrader une substance, cette


dernière est considérée NON-BIODÉGRADABLE

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Exigences en azote (N)
Synthèse des acides aminées (protéines), bases azotées (ADN: purines,
pyrimidines), certains glucides/lipides, cofacteurs enzymatiques,…

A) Forme inorganique pour certains microorganismes

-  Azote atmosphérique (N2): Fixation de l’azote atmosphérique (besoin de


nitrogénases) certaines bactéries seulement (Ex: Rhizobium, Azotobacter)

- Ammoniaque (NH3): Oxydation de l’ammoniaque en nitrites (nitrosation)


Ex: Nitrosomas

- Nitrites (NO2): Oxydation des nitrites en nitrates (NO3) (Nitration)


Ex: Nitrobacter (Nitrification = nitrosation + nitration)

- Sels d’ammonium (NH4+): Plusieurs espèces Ex: E. coli, Pseudomonas

B) Forme organique utilisée par un grand nombre de microorganismes


- Composés azotés tels les acides aminées, les bases azotés, phospholipides,…
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Exigences Nutritionnelles (suite)

(3) Phosphore (P) : Élément essentiel des acides nucléiques, phospholipides, de


nombreux coenzymes et de l’ATP
- Absorbé sous forme inorganique (PO42-)

(4) Soufre (S) : Élément essentiel de certains acides aminés (cystéine, méthionine)
- Principalement absorbé sous forme de sulfate (SO42-) ou de composés
soufrés organiques (cystéine)

(5) Ions inorganiques (Na+, K+, Mg2+, Fe2+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+) :
Essentiels pour l’équilibre physicochimique de la cellule (constituants des
enzymes et des coenzymes, constituants des structures cellulaires, cofacteurs
enzymatiques)

24
Exigences Nutritionnelles (suite)

(6) Facteurs de croissance : Composés organiques essentiels à la croissance


que la bactérie ne peut synthétiser elle-même (doivent être préformées)

Trois types:
1)  acides aminés
2)  vitamines
3)  bases azotés (purine/pyrimidine)

A) Prototrophe: microorganisme de type sauvage du point de vue nutritionnel


Autonome, pouvant croître sur un milieu minimal*

B) Auxotrophe:
- Perte de capacité à synthétiser certains métabolites essentiels (comparé
au type sauvage)

- Incapable de croître sur un milieu minimal (il faut l’enrichir avec la


substance)
25
Exigences Nutritionnelles (suite)
(7) Eau : - Principal constituant cellulaire des microorganismes
- Indispensable comme solvant et dans les réactions biochimiques

Les états de l’eau


Eau liée: liée aux macromolécules, ions ou toute surface hydrophile

Eau libre: suffisamment éloignée d’une surface chargée et libre de


ses mouvements, propriétés physico-chimiques normales

*Seule l’eau libre du milieu est disponible pour les microorganismes

Activité de l’eau libre: indice de la disponibilité de l’eau pour les


microorganismes

Aw (Activity water): Pression partielle de vapeur d’eau d’une solution


Pression partielle de vapeur de l’eau pure

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Exigences en Eau

►La plupart des microorganismes exigent de grande quantité d'eau libre pour
leur croissance

27
Exigences en oxygène

(9) Oxygène :
- Accepteur final d’électrons dans la chaîne respiratoire pour les organismes
AÉROBIQUE
- Toxique pour les bactéries ANAÉROBIQUES

Procaryotes : L’oxygène est soit nécessaire, toléré ou toxique

Eucaryotes : L’oxygène est presque toujours essentiel


Certaines levures peuvent croître en absence d’oxygène (fermentation)

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Exigences en oxygène (suite)

► On distingue 5 groupes de bactéries selon leur réponse à l'égard de l'oxygène:


1)  Aérobies stricts

•  Bactéries qui exigent obligatoirement l'oxygène libre pour se


multiplier

•  L'oxygène libre est utilisé comme accepteur final d'électrons


dans la chaîne respiratoire.

Ex.: Nitrobacter, Nitrosomonas, la plupart des Pseudomomas,…

2)  Microaérophiles

•  Bactéries qui ne se développent qu'en présence d'une faible


pression d'oxygène libre, inférieure à celle de l'atmosphère

•  Pression d’oxygène libre de 2 à 10 % et non 20 % comme dans


l’air

Ex.: Azotobacter, Hydrogenomonas, Campylobacter 29


Exigences en oxygène (suite)

3) Anaérobies stricts ou obligatoires

•  Bactéries qui peuvent se multiplier seulement en absence totale


d'oxygène libre

•  L'oxygène libre ne peut être utilisé comme accepteur final


d'électrons dans la chaîne respiratoire

•  Elles utilisent d'autres substances oxydatrices comme des


nitrates, des sulfates ou des carbonates comme accepteur final
d'électrons, c’est la respiration anaérobie

Ex.: Clostridium, Veillonella, Desulfovibrio, Bacteroides,…

*Si l’accepteur final est un composé organique on parle alors de la


fermentation (il y a dégradation incomplète du glucose).

30
Exigences en oxygène (suite)

4)  Anaérobies facultatifs (aéro‑anaérobies)

•  Bactéries capables de croître en présence ou en absence totale


d'oxygène libre

•  Ces bactéries peuvent se développer à l'aide de la respiration


(aérobie) ou de la fermentation (anaérobie)

Ex.: la très grande majorité des espèces bactériennes

5)  Anaérobies aérotolérants

•  Bactéries anaérobies mais la présence d’oxygène ne les tue pas

•  En présence d’oxygène, leur croissance est plus faible que celle


des anaérobies facultatifs car elles n’utilisent pas l’oxygène.

Ex.: Enterococcus faecalis 31


Toxicité de l’oxygène
► L’oxygène est vital pour la très grande majorité des organismes vivants
•  il est toutefois potentiellement toxique, car la réduction de l'oxygène
(gain d’électrons) produit une série de radicaux libres

La réduction de l’oxygène provoque une série de radicaux libres toxiques


O2 + e- = O2-. (anion superoxyde)
O2-. + e- + 2H+ = H2O2 (peroxyde d’hydrogène)
H2O2 + e- + H+ = H2O + OH. (radical hydroxyle)
OH. + e- + H+ = H 2O (eau)

Le processus est accéléré grâce à 2 enzymes:


1)  Superoxyde dismutase (SOD) : Dismutation
2 O2- + 2 H+ = H2O2 + O2

2) Catalase : transformer le peroxyde en eau et en oxygène


2 H2O2 = 2 H2O + O2
32
Comment faire croître les anaérobies ?

1) Bouillons au thioglycolate
2) Jarres anaérobies (Systèmes ‘GasPak’)
3) Tube de Hall

Prescott, 1995, p.66


33
TP séance # 5
Types de bactéries selon les besoins en oxygène
Bouillons nutritifs au thioglycolate (agent réducteur)

Aérobies
stricts

Brook p163, 2007

Microaérophiles
Anaérobies
stricts Anaérobies Anaérobies
facultatifs aérotolérants 34
Comment faire croître les anaérobies ?

4) Chambre de travail anaérobie

35
Facteurs physiques influençant la
croissance des microorganismes

1)  La température

2)  L’acidité (pH)

3)  La pression osmotique

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La température

►La température est un facteur très important dans la croissance des


microorganismes

Elle affecte directement les réactions enzymatiques (métabolisme)


des microorganismes
 

Température minimale: Température la plus


basse à laquelle un microorganisme peut
croître

Température optimale: Température idéale


permettant aux microorganismes un taux
de croissance maximal

Température maximale: Température la plus


élevée à laquelle un microorganisme peut
croître

37
Classes de microorganismes

•  Selon l’échelle caractéristique de leur croissance

psychrophile < 10 °C
psychrotrophe 20 - 30 °C
mésophile 20 - 45 °C
thermophile 55 - 65 °C
hyperthermophile 80 - 133

38
www.cliffsnotes.com
La température

Prescott 2002, p127

(Températures optimales)
(80-133oC)

(55-65oC)

(20-45oC)

(20-30oC)

(<10oC)

Réfrigération 4oC Corps humain 37oC Pasteurisation 66-71oC


39
La température (exemple)

Prescott, 2002, p127

40
L’acidité (le pH)
►L'activité enzymatique des microorganismes est directement influencée par
le pH. En milieu acide ou en milieu alcalin, les enzymes sont normalement
inactivées.

pH minimal: valeur de pH la plus basse à laquelle


un microorganisme peut croître

pH optimal: valeur de pH idéale permettant aux


microorganismes un taux de
croissance maximal

pH maximal: valeur de pH la plus élevée à laquelle


un microorganisme peut croître
pH
Type de microorganismes selon le pH optimal:
1) Acidophiles  : pH 0-5.5
2) Neutrophiles : pH 5.5-8.0
3) Alcalophiles : pH 8.5-11,5
 
Les bactéries préfèrent un milieu à pH 6-7 tandis que les mycètes préfèrent un pH
à ~5-6 41
L’acidité (le pH)

42
Prescott
La pression osmotique: les solutés et l’activité de l’eau
La présence d’une membrane plasmique à perméabilité sélective fait en sorte
que les microorganismes sont affectés par des modifications de la
concentration en solutés (concentration osmotique) de leur milieu

* Lorsque les bactéries sont placées en milieu hypotonique, l'eau entre dans la
cellule mais la paroi oppose une certaine résistance mécanique à la pression
osmotique

* Lorsqu’une bactérie est placée en milieu hypertonique, l'eau quitte la cellule


au profit du milieu ambiant (déshydratation)
- Plasmolyse (la membrane se rétracte de la paroi)
- Faible disponibilité en eau libre

43
La pression osmotique

Types de microorganismes selon leur réponse à la pression osmotique

1) Osmotolérants: tolèrent une pression osmotique élevée


Ex: - Champignons (sucre: confitures)
- Staphylococcus (tolère de 5-20% NaCl)
2) Osmophiles: nécessitent une pression osmotique élevée pour croître (milieux
hypertoniques)
Halophiles: nécessitent une concentration en NaCl > 0.2M
Ex: - Pseudomonas, Vibrio vulnificus (3.5% NaCl)
- Halobacterium, Vibrio costicolus (20-30% NaCl)
(bactéries des saumures)

** Composés osmocompatibles ou osmorégulateurs: Glycine, bétaïne, glycérol,…


•  Permettent d’ajuster l’activité de l’eau du cytoplasme sans nuire aux
réactions biochimiques des cellules
44
Résumé 3
Croissance

Les bactéries se divisent par scissiparité

•  Phase de croissance: (latence, log, stationnaire, mortalité)


•  Culture continue (phase exponentielle) (chemostat/ turbidostat)

•  Mesure de la croissance
–  Direct: décompte: total (chambre) ou unité viable
(dilution/ filtration)
–  Indirect: activité ou masse (poids sec/ turbidité)

45
Résumé 3: Nutrition
•  C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe (C HOPK’NS)
–  Classification:
•  Carbone: autotrophes (CO2) ou hétérotrophes
•  Energie: phototrophes (lumière) ou chimiotrophes
•  Electrons: lithotrophes (inorganiques) ou organotrophes
–  Macroélément, élément trace, facteur de croissance, H2O
–  Oxygène (aérobie strict, microaérophile, anaérobie strict,
anaérobie facultatif, anaérobie aérotolérant)

•  Facteurs physiques affectant la croissance:


- Température (psychrophile, psychrotrophe, mésophile, thermophile,
hyperthermophile)

- pH (acido-, neutro- ou alacalophile)


- pression osmotique (osmotolérant/osmophile) (halophile = sel)
46
TP MCB1980 séance #3
A"en%on : la séance 3 est longue. Bien se préparer.
Quiz #2 !
Lire p. 53-62

•  A) ColoraFon Gram
•  B) Isolements de microorganismes
•  C) Besoins nutriFfs des bactéries
–  source de carbone (organique: glucose)
–  Sels minéraux (P, S et oligo-éléments)
–  (NH4)2SO4: Source chimique (inorganique) de N et S
–  Hydrolysat de caséine (HC): source N (pepFde)
–  Extrait de levure (EL): riche, bases azotées, vitamines…
•  D) Comptage des unités viables

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