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LES ACIDES NUCLÉIQUES

PROJET DE FIN DE MODULE

Département de procédé et d'environnement

Filière d'ingénieur option génie de procédé industriel

20 MARS 2020

Réalisée par: Encadrée par:

Marya NOUAITI M. Pr. MOHAMMADI


Table des matières
définition 1
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Définition:
Substances sécrétées dans le sang par des cellules le plus souvent tumorales (cellules
cancéreuses). Ces substances sont dosées généralement dans le sang et peuvent évoquer
l’existence d’un cancer, d’une récidive de cancer ou de certaines affections bénignes.
Un taux élevé d’un marqueur tumoral ne permet pas de poser le diagnostic d’un cancer. A
l’inverse, un taux normal d’un marqueur tumoral n’exclue pas la présence d’un cancer.
La sensibilité et la spécificité des marqueurs actuellement disponibles n’atteint pas 100 %. Ils sont
habituellement absents ou présents à l’état de traces chez un sujet sain.

Signification:
L’élévation du taux d’un marqueur tumoral peut signifier :
 la présence d’un cancer ;
 la reprise évolutive de la maladie cancéreuse ;
 la présence d’une pathologie bénigne.
Le taux d’un marqueur élevé est souvent corrélé au nombre de cellules cancéreuses présentes
dans la tumeur ou disséminées à distance et formant des métastases.
 

Indications:
Sauf cas très spécifiques, les marqueurs tumoraux ne permettent pas de poser le diagnostic d’un
cancer. Ils ont pour la plupart une faible spécificité.
L’indication principale de leur dosage est la surveillance d’un patient traité de cancer. Un premier
dosage est effectué avant le début du traitement afin d’avoir une valeur de référence. D’autres
dosages sont pratiqués en cours de traitement afin d’apprécier la réponse thérapeutique
(efficacité du traitement) et d’adapter le traitement. Enfin, ils sont répétés à distance du traitement
dans le cadre du suivi, comme un moyen permettant de rechercher la survenue d’une rechute.
L’élévation continue d’un marqueur chez un patient traité de cancer correspond souvent à la
survenue d’une rechute locale ou d’une métastase à distance. Une élévation anormale précède
souvent de plusieurs mois l’apparition de signes cliniques ou de signes radiologiques. Cette
situation crée une anxiété supplémentaire chez le patient.
Une autre indication, plus rare, est la recherche d’une tumeur primitive. L’augmentation d’un
marqueur permet parfois une orientation diagnostique vers sa tumeur primitive.
Les biomarqueurs en cancérologie

Un biomarqueur est une caractéristique mesurable avec précision, utilisée


comme indicateur d'une fonction du corps, d'une maladie ou de l'action d'un
médicament.   

Au fil des ans, des biomarqueurs ont été découverts pour un grand nombre
de cancers. La recherche dans ce domaine évolue rapidement. Certains
biomarqueurs du cancer sont déjà utilisés dans la pratique hospitalière
quotidienne, d'autres sont encore en phase d'expérimentation.

Les biomarqueurs et le risque de cancer

Il existe de nombreux biomarqueurs différents. Certains fournissent une


indication sur le risque de développer ultérieurement un type particulier de
cancer. D'autres peuvent signaler la présence d'un cancer. D'autres encore
donnent des informations sur la nature et la gravité d'une tumeur ou permettent
de suivre l'évolution du traitement ...

1. Biomarqueurs et risque de cancer

Les biomarqueurs qui indiquent le risque d'être atteint d'un type de cancer
déterminé ont généralement un rapport avec l'ADN, le matériel génétique
présent dans chaque cellule du corps. Un cancer est en effet la conséquence
d'une accumulation d'erreurs, ou « mutations » de l'ADN. Pour une petite
minorité de cas (5 à 10% des cancers),  ces mutations peuvent se transmettent de
façon héréditaire. Les individus qui en héritent ont alors un risque fortement
accru de développer certains cancers (du sein, des ovaires ou de l'intestin, par
exemple). L'augmentation des connaissances sur ces mutations héréditaires a
permis le développement d'un dépistage génétique dans certaines situations bien
particulières. Les personnes chez qui on identifie ce risque héréditaire peuvent
alors bénéficier de mesures de prévention ou de dépistage spécifiques. 

Il est probable que l'on découvrira dans un proche avenir davantage de mutations


prédisposant au cancer, ce qui augmentera également les possibilités de
dépistage et de prévention.

2. Biomarqueurs et dépistage

Les marqueurs tumoraux sont des substances - généralement des protéines


- présentes chez chacun en très faibles quantités. Ces marqueurs peuvent aussi
être produits en excès par certaines cellules cancéreuses. Des quantités
anormales de ces protéines dans le sang, l'urine, les selles ou dans certains
tissus, peuvent donc indiquer l'existence d'une tumeur. Mais la présence ou
l'absence d'un marqueur tumoral n'est pas une preuve suffisante de l'existence
d'un cancer. Des examens complémentaires sont nécessaires pour obtenir un
diagnostic de certitude. À titre d'exemple, une augmentation du taux de PSA
(Prostate-Specific Antigen - antigène prostatique spécifique) dans le sang peut
révéler un cancer de la prostate mais aussi avoir bien d'autres causes
(inflammation, augmentation banale du volume de la prostate, tumeur bénigne,
etc.). À l'inverse, un taux normal de PSA ne garantit pas l'absence d'un cancer de
la prostate. L'interprétation des taux de marqueurs tumoraux est donc délicate.

Pour pouvoir être utilisés dans le dépistage, l'idéal serait d'avoir des marqueurs
tumoraux parfaitement spécifiques des différents cancers. Les recherches en ce
sens se poursuivent...

3. Biomarqueurs et traitements

Il est important d'établir avec un maximum de précision la nature et le degré


d'agressivité d'un cancer pour pouvoir adapter le traitement au cas par cas.
Certains biomarqueurs peuvent y contribuer. Dans le cancer du sein, par
exemple, il est possible, en analysant l'activité de septante gènes différents
(segments d'ADN), de prévoir le risque de micro métastases susceptibles de
provoquer une rechute. L'intensité du traitement peut être adaptée en fonction
des résultats. Autre exemple : la présence de l'anomalie appelée chromosome de
Philadelphie, spécifique à certaines formes de leucémies, est importante pour le
choix d'un traitement sur mesure.

Les biomarqueurs peuvent également fournir des indications utiles pour le suivi
des malades. L'évolution des taux (diminution / normalisation du biomarqueur
lorsque le traitement parvient à éliminer les cellules cancéreuses) permet de
savoir relativement vite si un traitement donné est efficace ou pas. 

Le "marché" des biomarqueurs

L'explosion actuelle des connaissances sur les biomarqueurs fait craindre une


forte augmentation des (auto)tests commerciaux.

Pour autant que ces tests commerciaux soient fiables (il en circule déjà via
Internet), il est important de bien en mesurer toutes les conséquences.

Ainsi, la découverte d'une prédisposition héréditaire au cancer a non seulement


un impact pour l'individu, mais également pour les autres membres de sa
famille, eux aussi susceptibles d'être porteurs de la même anomalie. Sans oublier
les risques de discrimination professionnelle ou autre qui pourraient résulter d'un
usage incontrôlé de ce genre de test. Il faudra donc veiller à ce que l'utilisation
des biomarqueurs se fasse dans un cadre médical et légal adéquat, afin de
pouvoir protéger et accompagner au mieux les patients.
LES BIOMARQUEURS
Par Dr Audrey Gabelle, Dr Gaël Chételat

La maladie d’Alzheimer se caractérise par des modifications cérébrales dont


certaines peuvent être mesurées in vivo grâce à des biomarqueurs. Les
biomarqueurs diagnostiques de la maladie d’Alzheimer sont des marqueurs
reflétant, du vivant du patient, les lésions cérébrales caractéristiques de la
maladie : les plaques séniles (composées de peptides beta-amyloïdes), les
dégénérescences neuro-fibrillaires (composées de proteine Tau
hyperphosphorylées), et les pertes neuronales et synaptiques.

Pour le diagnostic de maladie d’Alzheimer, deux catégories de biomarqueurs


sont utilisés : les marqueurs d’imagerie morphologique et fonctionnelle et les
marqueurs biologiques mesurés dans le Liquide Cérébro-Spinal (LCS, liquide
qui entoure le cerveau).

L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) structurale permet de mettre


en évidence une diminution de la taille des structures cérébrales, ou atrophie
cérébrale, dans la maladie d’Alzheimer. Le plus souvent, l’atrophie touche en
priorité la région hippocampique, en lien avec les troubles de mémoire
épisodique, avant de s’étendre au néocortex temporal latéral puis au cortex
cingulaire postérieur, temporo-pariétal et frontal avec l’avancée de la maladie.
La tomographie par émission de positon (TEP) utilisant le glucose
radiomarqué (FDG) comme traceur est une autre technique d’imagerie
fréquemment utilisée dans le bilan diagnostique de la maladie d’Alzheimer.
Cette technique permet de mesurer la consommation de glucose dans les
différentes structures cérébrales et renseigne donc sur le fonctionnement des
structures. Il existe un profil caractéristique de diminution de consommation
cérébrale de glucose (ou hypométabolisme) dans la maladie d’Alzheimer : le
cortex cingulaire postérieur est le plus touché, de même que le cortex temporo-
pariétal. Avec l’évolution de la maladie, l’hypométabolisme s’étend notamment
dans le cortex frontal et progressivement dans l’ensemble du cortex. La nature et
le degré des troubles cognitifs sont liés de façon relativement spécifique avec le
degré et la localisation de l’atrophie et de l’hypométabolisme dans la maladie
d’Alzheimer.

Aujourd’hui, il est également possible d’utiliser la TEP pour visualiser les


lésions neuropathologiques caractéristiques de la MA : les dépôts amyloïdes et
les dégénérescences neurofibrillaires, en fonction du traceur qui est injecté au
patient.

Les études en TEP-amyloïde ont montré une répartition relativement diffuse


des dépôts amyloïdes sur l’ensemble du néocortex avec une prédominance dans
les régions cingulaire postérieure, frontale médiane et temporo-pariétale. La
présence (et la quantité) de dépôts est peu corrélée aux performances cognitives
(certaines personnes âgés sans aucun trouble cognitif ont autant de dépôts
amyloïdes que des patients Alzheimer). Cependant, elle est associée à un risque
plus élevé de développer la maladie et à un déclin cognitif et une atrophie
subséquente plus élevés. Les études en TEP-tau tendent quant à elles à mettre en
évidence une répartition plus focale, initialement localisée principalement au
niveau du lobe temporal et s’entendant progressivement au lobe pariétal et
frontal, avec un lien plus étroit avec les troubles cognitifs que les dépôts
amyloïdes. Malgré leur intérêt, la réalisation de TEP-amyloïde et/ou TEP-Tau
n’est pas autorisée en France pour le diagnostic de maladie d’Alzheimer en
pratique clinique de routine.

Actuellement, le seul examen disponible en pratique clinique qui permet de


visualiser les lésions caractéristiques de la maladie d’Alzheimer in vivo est le
dosage des biomarqueurs du Liquide Cérébro-Spinal (LCS). Après
réalisation d’une ponction lombaire diagnostique dans des conditions
standardisées (anesthésiants locaux, aiguilles atraumatiques, tubes de
prélèvements spécifiques, chaîne de traitement du prélèvement adapté pour une
bonne détermination des concentrations des protéines d’intérêt), les trois
biomarqueurs sont mesurés. De nombreuses études ont souligné l’intérêt de ces
biomarqueurs pour le diagnostic positif (maladie d’Alzheimer versus sujets
contrôles sains), pour le diagnostic différentiel (MA versus autres types de
démences, démences fronto-temporales, maladie à corps de Lewy, démences
vasculaires) et pour le diagnostic dès les stades précoces de la maladie. Le profil
typique des biomarqueurs du LCS de la maladie d’Alzheimer associe une
diminution de la concentration du peptide Aβ42 et une augmentation des
protéines Tau et de leurs formes phosphorylées P-Tau. En cas de profil atypique,
comme par exemple, une augmentation de Tau et de P-Tau sans diminution
d’Aβ42, le dosage de l’Aβ40 et la mesure du ratio Aβ42/Aβ40 sont réalisés pour
améliorer la pertinence diagnostique. Une échelle PLM permet également de
définir en fonction du profil des biomarqueurs la probabilité d’être atteint de
maladie d’Alzheimer. 

Tous ces marqueurs d’imagerie (atrophie hippocampique, hypométabolisme


temporo-pariétal, dépôts amyloïdes dans le néocortex) et du LCS (abaissement
de l’amyloïde et augmentation de Tau) apparaissent de façon précoce dans le
développement de la maladie, bien avant le stade de démence, et même avant
l’apparition des premiers troubles cognitifs. Ils ont été intégrés aux critères
diagnostiques révisés et permettent d’améliorer l’efficacité (la sensibilité et la
spécificité) du diagnostic clinique, de proposer un diagnostic plus précoce (au
stade pré-démentiel) afin de définir avec le patient une stratégie de prise en
charge adaptée et personnalisée.

De nombreuses recherches sont en cours sur ces biomarqueurs pour optimiser


leur utilisation pour le diagnostic, mais aussi pour élucider les mécanismes
physiopathologiques de la maladie et découvrir de nouvelles pistes
thérapeutiques

UNE NOUVELLE COMBINAISON DE BIOMARQU


POUR LE DIAGNOSTIC DE LA MALADIE D’ALZH
RECHERCHE Mis en ligne le 16 février 2018
Les résultats d’une étude conduite par le Professeur Harald Hampel
(Sorbonne Université) de l’ICM, titulaire de l’AXA Research Fund &
Sorbonne Université Chair “Anticiper la Maladie d’Alzheimer” et
Simone Lista, montrent pour la première fois le potentiel diagnostic
de trois biomarqueurs présents dans le liquide cérébro-spinal dans
la maladie d’Alzheimer.

Deux des principales caractéristiques de la maladie d’Alzheimer sont l’accumulation


de protéines amyloïdes sous la forme de plaques et l’accumulation de protéines Tau
agrégées. Les concentrations d’amyloïdes et de protéines tau dans le liquide
cérébro-spinal, le liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière, ont
ainsi été validées comme biomarqueurs fondamentaux de la maladie.

De nouveaux mécanismes à différents stades de la maladie ont été mis en évidence


suggérant de nouveaux biomarqueurs potentiels pour détecter la maladie et son
évolution. 3 nouveaux marqueurs de la neurodégénérescence ont été
particulièrement étudiés et ont atteint des stades de validation clinique avancés :
NFL, la neurogranin et YKL-40.

Une étude conduite par le Pr Harald Hampel et Simone Lista s’est intéressée au
potentiel diagnostic de ces trois nouveaux marqueurs en combinaison avec les
biomarqueurs fondamentaux de la maladie. Ils ont exploré les performances de ces
biomarqueurs pour différentier des sujets sains, des individus présentant des
troubles cognitifs modérés et des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ou
d’une dégénérescence fronto-temporale.

Leurs résultats montrent que ces nouvelles combinaisons de biomarqueurs donnent


des résultats satisfaisants pour différencier les démences causée par la maladie
d’Alzheimer de celles dues aux dégénérescences fronto-temporales, cependant,
elles ne sont globalement pas plus performantes que l’analyse des biomarqueurs
fondamentaux (amyloïdes et protéines tau).

« Des études longitudinales sont requises chez des patients asymptomatiques à


risque de développer la maladie d’Alzheimer pour évaluer si certains biomarqueurs
parmi ceux identifiés pourraient prédire la progression de la maladie ou l’apparition
des symptômes ou de la démence. » Pr Harald Hampel (Sorbonne Université).

MARQUEURS DE TYPE RFLP

Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de l'ADN (RFLP)

La technique RFLP repose sur la digestion d'un DNA cible par une ou plusieurs
enzymes de restriction spécifiques des sites de restriction portés par le DNA. Après
électrophorèse, les fragments séparés sont hybridés avec un DNA sonde, provenant
souvent de banques de DNA génomique ou complémentaire. Cette sonde peut provenir
d'une espèce proche de l'espèce à étudier (sonde hétérologue).
Si deux individus diffèrent par un ou plusieurs sites ou, même, par la distance séparant deux
sites identiques consécutifs, il se crée une différence dans la longueur des fragments générés
par l'enzyme de restriction. Les milliers de fragments obtenus après digestion enzymatique et
révélés par le bromure d'éthidium (BET), montrent sous UV un seul voil continu (smear). Une
fois transféré sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose (Southern, 1975) et hybridé par
un DNA sonde, le DNA cible digéré est visualisé par autoradiographie, si la sonde est marquée
au P32 (sonde chaude) ou par méthodes biochimiques si la sonde est non radioactive (sonde
froide).
Les causes du polymorphisme sont :

- perte ou gain d'un site de restriction


- mutation de type insertion-déletion

Dans les deux cas les loci sont généralement bialléliques et l'expression des allèles est
codominante.
POLYMORPHISME DU A LA DISPARITION D'UN SITE DE RESTRICTION
POLYMORPHISME DU A UNE MUTATION DE TYPE "INSERTION-DELETION"

PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DES MARQUEURS RFLP.

- Marqueurs reflétant un polymorphisme de longueur de fragment


- Marqueurs codominants

SEGREGATION DES MARQUEURS RFLP.

VALEURS COMPARATIVES DES MARQUEURS BIOCHIMIQUES ET


MOLECULAIRES.

La Technique RFLP et réalisation d'une


électrophorèse
Technique de la RFLP

La première méthode d’analyse de l’échantillon utilisée correspond à l’étude du polymorphisme de


longueur des fragments de restriction qui porte aussi le nom de RFLP (Restriction Fragment Long
Polymorphism). Cette technologie s’appuie sur la découverte des mini-satellites, définis
précédemment.

L’échantillon d’ADN placé dans un microtube est découpé par de véritables ciseaux moléculaires,
les enzymes de restriction. La taille des fragments obtenus est analysée grâce à la technique
d’électrophorèse qui consiste à faire migrer l’ADN sous l’effet d’un champ électrique dans un gel
servant de tamis moléculaire. Ainsi, les molécules d’ADN chargées négativement à pH basique
migrent vers le pôle positif. Les grands fragments se déplacent plus lentement que les petits, car ils
sont davantage freinés dans le gel. La position relative des fragments à l’arrêt du courant est
proportionnelle à leur taille. L’ADN dans le gel est à ce moment invisible ; une étape
supplémentaire est don nécessaire. Les fragments sont transférés, tout en gardant leurs positions
respectives, sur une membrane synthétique, plus facile à manipuler. Nos régions d’intérêt, les mini-
satellites, sont ensuite repérées à l’aide de sondes radioactives. Les sondes sont des petits
morceaux d’ADN synthétisés en laboratoire dont la séquence nucléotidique est déterminée, en
fonction de la zone à étudier, de façon à s’hybrider par complémentarité avec la séquence que l’on
souhaite détecter. La révélation de l’hybridation est réalisée par autoradiographie : le rayonnement
des sondes radioactives impressionne un film radiographique.

En biologie moléculaire, le polymorphisme de longueur des fragments de


restriction (ou RFLP, de l'anglais restriction fragment length polymorphism) est utilisé dans
deux sens :

 comme une caractéristique des molécules d'ADN permettant de les distinguer les unes
des autres,
 comme la technique de laboratoire qui utilise cette caractéristique pour différencier ou
comparer des molécules d'ADN. Cette technique est utilisée pour la réalisation
d'empreintes génétiques et dans les tests de paternité.
Étapes de la technique RFLP :

1. extraction d'ADN,
2. hydrolyse de l'ADN par une enzyme de restriction,
3. séparation des fragments de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose,
4. dénaturation de l'ADN par la soude pour obtenir de l'ADN monocaténaire,
5. transfert sur membrane, renforcement de la fixation.
6. visualisation des fragments par hybridation avec une sonde.
L'ADN d'un individu ou d'une cellule est d'abord extrait et purifié. L'ADN est ensuite coupé
en fragments de restriction par une enzyme de restriction, cette dernière coupant l'ADN au
niveau d'une séquence qui lui est spécifique (site de restriction). Les fragments d'ADN ainsi
obtenus, nommés fragments de restriction, sont ensuite séparés selon leur longueur
par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel obtenu est ensuite analysé par Southern
Blotting et révélé avec une ou plusieurs sondes.
La distance entre deux sites de coupure de l'enzyme de restriction (site de restriction) varie
selon les individus (du fait du polymorphisme des individus) : de ce fait la longueur des
fragments de restriction varie. Les positions de certaines bandes d'ADN (sur le gel
d'électrophorèse) seront donc différentes d'un individu à l'autre. Le polymorphisme existant
entre individus d'une même espèce peut être ainsi visualisé grâce au polymorphisme de leur
ADN. Cette technique permet de mettre en évidence les "particularités" d'un individu. Elle
permet également de montrer les relations génétiques qui peuvent exister entre individus, du
fait de la transmission des caractères génétiques de parents à enfant. La technique est
également utilisée pour étudier les relations entre différentes espèces.