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SPECTROFLUORIMETRIE MOLECULAIRE

I. INTRODUCTION
 C’est une méthode spectrale d’analyse mettant à profit l’absorption par les molécules d’une radiation
lumineuse suivie de l’émission instantanée d’une radiation d’une longueur d’onde supérieure.
 Aspect quantitatives : mesure de l’intensité de fluorescence.
 Aspect qualitatif : l’étude de la position des spectres et leur forme.
II. PRINCIPE
 Une molécule à l’état fondamental absorbe de l’energie, elle se trouve dans un état énergétique supérieur
qui est atteint rapidement (10-15S) et qui est instantané, il ne dure que 1 à 10 nanoS.
 Emission d’énergie après retour à l’état fondamental.

 Selon la loi de Beer Lambert, l’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de la


substance à analyser : IF = I0.ε.l.c.ΦF
III. APPAREILLAGE
1) Source de lumière : Les plus utilisées sont :
 Lampe à Xénon ;
 Source Laser.
2) Sélecteurs de radiation : filtre ou monochromateur (MC)
 Les fluorimètres utilisent des filtres colorés ou interférentiels.
 Les spectrofluorimètres utilisent des monochromateurs à réseau ou à prisme.
 La sélection de deux types de longueur d’onde : d’excitation et d’émission
3) Cuve : En verre, en quartz ou en milieu synthétique
4) Système de détection :
 Une cellule photoélectrique et un photomultiplicateur
 Système de traitement des données.
IV. MISE EN ŒUVRE
 La cuve bien remplie, propre et sec
 Eviter les bulles d’air dans la solution d’échantillon
 Interrogatoire avant le prélèvement pour éviter les interférences : Médicaments et certains aliments
 Isolement et purification : Par déproteinisation, ou Chromatographie
V. APPLICATIONS
 Méthode très sensible : dosage de substances à très faibles concentrations pg/l
 Grande spécificité : dosage des médicaments ou de substances naturelles
 Couplée à l’HPLC et aux méthodes immunochimiques (immunofluorimétrie)
 Biochimie : AA ; Catécholamines ; Métanéphrines urinaires, Sérotonine ; Stéroïdes ; vit du groupe B
 Toxicologie : Barbituriques ; Benzodiazépines ; Antidépresseurs tri-cycliques ; Phénothiazines…
 Industrie pharmaceutique : Certains antibiotiques tels les tétracyclines.

SFM + Chimie sèche 2017 Dr. OUASSOU Abdelaziz


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CHIMIE SECHE

I. INTRODUCTION
 C’est une technique dans laquelle les réactifs nécessaires au dosage sont déposés à l’état déshydraté sur
un support solide.
 Avantage : Simplicité, Utilise peu de volume d’échantillon, Grande stabilité des calibrations (six mois).
II. PRINCIPES
 Technique utilisant le principe de réflectivité = rapport entre l'intensité de lumière incidente Io et la
lumière réfléchie Ir
 Transformé de Williams et Clopper : Établi la relation entre réflectance (logarithme de la réflectivité) et
concentration dans une plaque.
III. APPAREILLAGE
1) Le système optique
 La source lumineuse:Lampe halogène, xénon
 La sphère d’Ulbrich
2) Le spectrophotomètre à réflexion
 Mesure la réflexion sur un support solide
 Le flux lumineux incident est projeté sur la plaque selon un angle de 45°.
3) Les plaques
a) Colorimétriques
 Couche d’étalement:
 Etalement uniforme de l’échantillon
 Filtre les macromolécules
 Fournit un fond blanc pour la réflexion.
 Couche(s) analytique(s): Contient: Enzymes, Substrats, Catalyseurs, Anticorps, tampons
 Couche d’enregistrement: C’est le site Des réactions, De lecture
 La couche Support: Totalement transparente
b) Immunochimique
 Principe de Base: immunodosage en phase hétérogène
 Exemples de dosage: Digoxine, Phénytoïne, Protéine C réactive
c) Potentiométrique
 Comporte 2 électrodes + membrane sélective, reliées par un pont en papier
 Les tests potentiométriques: (Na) (K) (Cl)
4) Types de mesures envisageables
a) Lecture en cinétique directe : − Créatine kinase MB − GGT − LDH − Cholinestérase – ASAT
− PAL − ALAT − Créatine kinase
b) Lecture en cinétique deux points : Amylase, Lipase, Créatinine, Fer, Théophylline
c) Lecture en point final : − Albumine, − Cholestérol − Glucose − Protéine T − Triglycéride − Urée
IV. APPLICATIONS
 Les bandelettes réactives : Méthode semi-quantitative
Bandelette pour glycosurie, BU (Ketodiastix®)
 Réflectomètres :
Les dosages sont quantitatifs,
La lecture peut se faire soit par réflectométrie soit en potentiométrie.

SFM + Chimie sèche 2017 Dr. OUASSOU Abdelaziz


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