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République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique


Université Mohamed Boudiaf- M’Sila

Cours
Biotechnologie végétale et amélioration des plantes

Dr. Guettouchi Ahlam


Cours: Biotechnologie végétale et amélioration des plantes Dr. Guettouchi Ahlam

Sommaire
Préfaces

Chapitre I : Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes

I.1. Multiplication végétative et reproduction sexuée…………………………….. 01


I.1.1. Multiplication végétative traditionnelle………………………………………. 01
I. 1.1.a. Le marcottage…………………………………………………………………. 02
I.1.1.b. Le bouturage………………………………………………………………….. 02
I.1.1.c. Le greffage……………………………………………………………………. 03
I.2. La méthode « In vitro »………………………………………………………. 03
I.2.1. Principes fondamentaux……………………………………………………… 04
I.2.2. Bases biologiques de la culture in vitro............................................................. 04
I.2.2.a. La multiplication……………………………………………………………... 04
I.2.2.b. Les substances de croissance (Les phytohormones)………………………….. 05
I.2.3. La totipotence cellulaire………………………………………………………. 05

Chapitre II : Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro

II.1. Les explants ………………………………………………………………….. 08


II.2. Le milieu de culture…………………………………………………………... 09
II.3. Les principales substances……………………………………………………. 09

Chapitre III : Besoins nutritifs des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques

III.1. Les sels minéraux……………………………………………………………... 13


III.1.1. Milieu de Murashige et Skoog ……………………………………………….. 13
III.2. Les vitamines…………………………………………………………………. 14
III.3. Les régulateurs de croissance………………………………………………… 15
III.4. L’environnement……………………………………………………………… 15
III.4.a. La lumière…………………………………………………………………….. 15
III.4.b. Rôle de la température………………………………………………………... 15
III.4.c. Hygrométrie…………………………………………………………………... 15
Cours: Biotechnologie végétale et amélioration des plantes Dr. Guettouchi Ahlam

III.4.d. Stérilité………………………………………………………………………... 16
Chapitre IV : Technologie de la culture in vitro

IV.a. Les étapes et les techniques de la culture in vitro…………………………….. 17


IV.b. Les étapes de la culture in vitro………………………………………………. 18
VI.b.1. Les phases de la micropropagation…………………………………………… 18
Stade 1 : Conditionnement des plants mères…………………………………. 19

Stade 2 : Établissement d’une culture aseptique……………………………… 19

Stade 3 : La multiplication des tiges : Durée 4 à 5 semaines………………… 20

Stade 4 : La rhizogénèse (enracinement)……………………………………... 20

Stade 5 : L’acclimatation……………………………………………………... 21

IV.1. Application de la culture in vitro : culture de cellule de méristème,


multiplication végétative, culture d’anthère et de pollen, culture de
protoplaste.......................................................................................................... 21
IV.1.1. Différenciation et dédifférenciation…………………………………………... 21
IV.1.1.a. La différenciation……………………………………………………………... 21
IV.1.1.b. La dédifférenciation…………………………………………………………... 21
IV.1.1. La culture de cellule de méristème ……………………………..……………. 22
IV.1.1.2. Régénération des vitroplants………………………………………………….. 25
IV.1.2. La multiplication végétative (La micro-propagation )………………………... 25
IV.1.3. La culture d’anthère et de pollen……………………………………………... 26
IV-1.4. L’obtention d’embryons somatiques…………………………………………. 27
IV.1.5. Le sauvetage des embryons…………………………………………………... 28
IV.1.6. L’obtention de protoplastes………………………………………………...... 28
IV.2. Biotechnologie et amélioration des plantes………………………………….. 29
IV.2.a. L'amélioration des plantes……………………………………………………. 29
IV.2.b. La biotechnologie…………………………………………………………….. 29
IV.2.c. Les Avantages de la culture in vitro.................................................................. 31
IV.2.1. Fusion de protoplastes……………………………………………….............. 32
IV.2.1.1. Hybridation somatique……………………………………………………….. 33
a. Signification de cette technologie…………………………………………….. 33
IV.2.1.2. Étapes importantes de l'hybridation somatique………………………………. 33
Cours: Biotechnologie végétale et amélioration des plantes Dr. Guettouchi Ahlam

a. Les protoplastes………………………………………………………………. 33
b. La fusion……………………………………………………………………… 34
IV.2.2. Haplo-méthodes (Androgenèse et gynogenèse)……………………………... 36
IV.2.2.1. Les haploïdes doublés………………………………………………………… 36
IV.2.3. Variations soma-clonales……………………………………………………... 37
IV.2.3.1. Variation somaclonale et sélection in vitro…………………………………… 38
IV.2.4. Embryogenèse somatique…………………………………………………….. 38
IV.2.5. Sauvetage d’embryon………………………………………………………… 39
IV.2.6. Transfert de gènes……………………………………………………………. 40

Chapitre V : Aspect génétique : Conformité du matériel reproduit in vitro

V.1. Origine et sources de variation somaclonale ………………………………… 41


V.2. Détection des variations somaclonales……………………………………….. 41
V.2.1. Détection morphologique ……………………………………………………. 41
V.2.2. Détection moléculaire ………………………………………………………... 41
V.2.3. Méthodes cytologiques………………………………………………………. 42
Références bibliographiques
Cours: Biotechnologie végétale et amélioration des plantes Dr. Guettouchi Ahlam

Préfaces
Ce cours proposé porte sur la biotechnologie végétale et son rôle dans l’amélioration des
plantes, décrit les méthodes de la culture in vitro et leurs applications. Il s'adresse donc à tous
les étudiants qui font la spécialité de biotechnologie

Au début de l’agriculture on choisit les graines de façon empirique. Les techniques classiques
d'amélioration des plantes reposent sur le croisement des espèces et des variétés, suivies de la
sélection de génotypes résistants. Ces méthodes rencontrent des difficultés, telles que les
barrières biologiques d'incompatibilité empêchant la reproduction sexuée entre espèces et
individus.

Depuis une dizaine d’années on pratique une sélection raisonnée. Les biotechnologies
végétales sont des techniques de laboratoire qui permettent l’optimisation et la diversification
des végétaux ou de leurs composants. Ces techniques reposent principalement sur les cultures
in vitro. Les premiers résultats intéressants de culture de tissus végétaux furent obtenus par
Gautheret, Nobecourt et White en 1938. Elles se font hors sol, en conditions stériles et très
contrôlées. Les biotechnologies végétales ont plus de cinquante ans. Elles font désormais
partie de notre environnement scientifique, quand elles ne sont pas ramenées au simple rang
de technique….. Leur développement et leur succès sont le résultat d’une longue histoire
expérimentale, mais aussi, pour une large part

Durant les dernières années la culture des tissus végétaux s’est développée, offrant un
ensemble d’outils technologiques au service de la production végétale. Ces techniques
(micropropagation) s’utilisent aujourd’hui par exemple pour la propagation par clonage des
meilleurs individus, l’obtention de plantes indemnes de virus et de maladies, l’amélioration
génétique par culture d’anthères et fusion de protoplastes, ou encore la conservation de
ressources phytogénétiques. Ces techniques offriront pour les générations futures une
importante alternative aux besoins soutenus de production agricole. Lorsque des variétés
améliorées de bon indice sanitaire parviendront effectivement aux producteurs de tous
niveaux, on aura contribué positivement à résoudre les problèmes alimentaires d’une
population en augmentation constante.
Chapitre I. Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes
Dr. Guettouchi Ahlam

I.1. Multiplication végétative et reproduction sexuée

Le remplacement des individus éliminés par la mort, caractéristique fondamentale des êtres
vivants, se réalise selon deux modalités principales qui s’opposent par de nombreuses
caractéristiques : la reproduction sexuée et la multiplication végétative.

Il n’y a pas de reproduction sexuée sans méiose (aboutissant à la production de gamètes à n


chromosomes) tandis que la multiplication végétative fait seulement intervenir la mitose. La
multiplication végétative se caractérise par la propagation d’individus génétiquement
identiques à la plante-mère, aboutissant ainsi à la constitution de clones homogènes.

La reproduction sexuée est caractérisée par la fécondation. C’est une véritable « re-
production », production d’un zygote à 2n chromosomes par fusion de deux gamètes qui
aboutit à la formation d’individus réellement nouveaux, puisque leur constitution génotypique
est différente de celle des parents (sauf dans le cas ou ceux-ci appartiendraient à une « lignée
pure »).

La reproduction sexuée permet les recombinaisons de gènes. C’est donc une source de
variabilité, facilitant l’adaptation et la survie de l’espèce lorsque changent les conditions de
l’environnement. A long terme, c’est certainement le mode de propagation le plus efficace
pour assurer la survie éventuellement l’évolution de l’espèce. Elle demeure pour le
sélectionneur l’outil essentiel.

A l’inverse de la reproduction sexuée, la multiplication végétative assure la stabilité puisque


tous les individus d’un clone sont identique, dans la mesure toutefois ou ne surviennent ni
mutation ni « variation ».

I.1.1. Multiplication végétative traditionnelle

La méthode la plus simple, la division de souches, implique en effet la formation par la


plante-mère, avant la séparation, d’un assez grand nombre de bourgeons axillaires ou
adventifs déjà enracinés ou apte à la rhizogenèse. Elle exploite donc une préadaptation à la
multiplication végétative spontanée.

I.1.1.a. Le marcottage

Consiste à induire la rhizogenèse avant la séparation. Remarquons que certaines espèces


(comme le Framboisier) se marcottent spontanément et se bouturent mal, ce qui suggère le

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Chapitre I. Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes
Dr. Guettouchi Ahlam

rôle essentiel dans la rhizogenèse des inter-relations entre les organes de plante-mère. (Figure
1)

Figure 1 : La technique du marcottage

I.1.1.b. Le bouturage

Implique à l’inverse la séparation de la bouture avant son enracinement. Lorsque la bouture


possède un ou plusieurs bourgeons le principal problème d’organogenèse posé par le
bouturage est la rhizogenèse. Lorsqu’il s’agit d’un fragment de tige ou de racine dépourvu de
bourgeons, la bouture doit produire à la fois des méristèmes de tige et de racine, l’ordre
d’apparition des deux sortes de méristèmes variant avec l’espèce. (Figure 2)

Figure 2 : Bouturage de géranium

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Chapitre I. Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes
Dr. Guettouchi Ahlam

I.1.1.c. Le greffage

Est un cas très particulier de multiplication végétative. Il permet en effet de multiplier le clone
auquel appartiennent les greffons. Mais il existe un support végétal, le porte-greffe, provenant
lui-même de semis, généralement. (Figure 3)

Figure 3 : La technique de greffage (greffe en fente).

I.2. La méthode « In vitro »

Une plante est un organisme multicellulaire résultant de divisions du zygote initial par mitoses
successives. Chaque cellule de la plante contient donc la même information génétique.
Cependant en examinant les différents niveaux d’organisation de la plante, on observe une
grande diversité de formes cellulaires, celles-ci se structurant sous forme de tissus et d’organe
pour développer des fonctions spécifiques dans un individu complet. La spécialisation est le
point de départ d’un système complexe et interdépendant entre ses unités constitutives. Ainsi
les cellules des racines sont spécialisées dans l’absorption et le transport de substances
nutritives tandis que les cellules de feuilles ont la forme, la structure de la fonction nécessaire
pour transformer l’énergie lumineuse en énergie chimique. Si la communication entre les
différentes parties du système est interrompue, de fortes altérations se produisent dans le
fonctionnement de l’ensemble.

C’est probablement pour cela qu’une cellule ou un morceau de tissu séparé de la plante ne
seront pas capable de croitre et de se développer dans un milieu à composition chimique
relativement simple alors que la plante complète n’aura pas de problème pour s’y développer.
Pour la culture de matériel végétal séparé de la plante il faut ajouter au milieu synthétique
toutes les substances nutritives, vitamines et régulateurs de croissance que les cellules, les

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Chapitre I. Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes
Dr. Guettouchi Ahlam

tissus et les organes auraient reçue à travers les racines ou les organes photosynthétiques de la
plante.

I.2.1. Principes fondamentaux

Lorsqu’on cultive des cellules, tissus ou organe in vitro, il faut prendre en compte quelques
principes fondamentaux. Il faut tout d’abord choisir le matériel que l’on veut cultiver puis le
prélever de la plante. On doit ensuite éliminer les microorganismes qui contaminent le
matériel végétal. Enfin il faut fournir aux cellules, tissus et organes des conditions ambiantes
appropriées en leur procurant un milieu de culture synthétique et des conditions d’incubation
adéquates. L’asepsie et l’inoculation du matériel végétal doivent être réalisées en milieu
ambiant stérile.

Les cultures in vitro peuvent être initiées à partir de presque toutes les parties de la plante.
Cependant la source originale du matériel végétal peut déterminer le succès de la mise en
place de la culture. Il est conseillé de comparer systématiquement les différentes sources de
cellules, de tissus ou d’organes avant d’en choisir une. Généralement on recommande
d’utiliser des plantes saines et vigoureuses comme source d’explants.

Le type de plante est déterminant pour le succès du culture in vitro ; par exemple les tissus par
le type de matériel végétal employé on peut classer les cultures in vitro en :

1 / culture d’organe ;

2/ culture de tissus ;

3/culture de cellules en suspension ;

Et 4/ culture de protoplastes.

L’appellation générale « culture de tissus » est utilisée pour faire référence à toutes ces
modalités.

I.2.2. Bases biologiques de la culture in vitro

a) La multiplication

La croissance des plantes se fait en plusieurs étapes qui permettent le développement d'une
graine en une plante capable de se reproduire. Pour cela, il faut d'abord une prolifération

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Chapitre I. Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes
Dr. Guettouchi Ahlam

cellulaire par mitose qui se réalise au niveau de tissus spécialisés : les méristèmes (= zone de
prolifération cellulaire). Ils sont situés :

– méristèmes primaires: apex des racines, extrémité des tiges, bourgeons apicaux,

– méristèmes secondaires: dans les tissus plus anciens responsables de l'épaississement des
tissus. Une fois la croissance réalisée, il y a différenciation de cellules qui serviront les unes à
la circulation des sèves (phloème, xylème), les autres à la photosynthèse (feuilles), à la
nutrition (racines). C'est donc un phénomène complexe qui dépend de facteurs externes et
internes.

b) Les substances de croissance (Les phytohormones)

Le développement végétal est régulé par des facteurs de croissance qui, par leur action à
distance du lieu de production sont appelés PHYTOHORMONES. Ces substances peuvent
agir en synergie ou en antagonisme.

Les hormones végétales ou phytohormones sont impliquées à tous les stades de la vie d'une
plante depuis la pollinisation provoquant la fécondation et le développement de l'embryon
zygotique, tout au long du développement de celui-ci en plante adulte jusqu'au contrôle de la
floraison, de la fructification et de la sénescence. Les mêmes phytohormones ne font pas que
diriger les processus de croissance et de développement: elles sont pour cela obligatoirement
impliquées dans des mécanismes spécifiques de division, d'élongation et de différenciation
cellulaire, mais aussi nécessairement dans les métabolismes primaire et secondaire.

Les phytohormones sont d'une importance capitale dans le contrôle des cultures in vitro de
cellules, tissus, organes ou plantes entières, c'est-à-dire dans l'orientation qu'on veut leur
donner : maintien en vie, croissance, initiation d'une organogenèse spécifique (production
d'organes tels que pousses feuillées, racines, embryons somatiques*), multiplication d'organes
ou de plantules, etc… Elles sont également largement utilisées pour le contrôle de la
production de métabolites secondaires d'intérêts divers.

I.2.3. La totipotence cellulaire

Une cellule est dite totipotente quand elle a la capacité de se différencier en n'importe quelle
cellule spécialisée et de se structurer en formant un organisme pluricellulaire. En effet, les
cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de

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Chapitre I. Fondements de la culture in vitro et multiplications des plantes
Dr. Guettouchi Ahlam

régénérer un individu complet identique à la plante mère. C'est la totipotence des cellules
végétales. Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation : les cellules peuvent redevenir des
cellules simples, non spécialisées et se différencier ensuite pour donner à nouveau les
différents types de cellules spécialisées. Grâce à la totipotence, l’arbre et d'autres plantes, mis
en milieu stérile, sont techniquement immortels.

La totipotence débute par la formation de cals : amas de cellules indifférenciées qui permet de
régénérer un individu entier génétiquement identique à la plante mère. Pour cela, il faut que
les explants soient placés dans des conditions appropriées. (Figure 4)

Figure 4 : Schéma explicatif de la totipotence

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Chapite II. Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

La culture in vitro ou culture de tissus se définit comme l'ensemble des techniques qui
permettent de faire croître en milieu artificiel (en éprouvette) des cellules spécialisés, ce qui
représente une grande variété de tissus.

Par opposition à la culture en terre ou dans des substrats imbibés de solution nutritive, la
culture in vitro se fait en laboratoire à l’abri de toute contamination cryptogamique, dans des
récipients qui peuvent être tant des tubes à essai que des bocaux à conserve. Ces récipients
sont placés dans un endroit où l'intensité de la lumière, la durée de l'illumination, la
température et l'hygrométrie sont constamment contrôlées.

Afin de mieux comprendre la culture in vitro des tissus végétaux, il faut posséder quelques
notions sur la reproduction des végétaux. La reproduction chez les végétaux peut se faire de 2
manières : - la multiplication sexuée, à l'aide d'échanges génétiques : gamètes mâles X
gamètes femelles = graine - la multiplication asexuée comme par bouturage où un seul petit
fragment de tige ou de feuille peut redonner après développement, une plante entière. C'est
précisément ce type de multiplication végétative qui est mis en pratique dans la culture in
vitro de manière accéléré à l'abri de toutes contaminations par des bactéries ou par des
champignons.

La culture in vitro végétale est possible parce que les cellules végétales présentent la
potentialité de reproduire des individus complets identiques à la plante sur laquelle les cellules
ont été prélevées. Cette propriété a été baptisée «totipotence cellulaire». La cellule animale
présente aussi cette capacité mais à un degré moindre. Toutes les cellules d'un même
organisme renferment dans leur noyau exactement les mêmes chromosomes, l’information
génétique pour reconstruire l’organisme entier. Ce message héréditaire représente toutes les
potentialités de l'individu. Cependant, à un moment donné de la vie embryonnaire, un choix
va se faire, dans un groupe de cellules données, destiné à former un organe ayant une forme et
une fonction précise. Une grande partie du message héréditaire va être mise en sommeil, dans
un autre groupe, destiné à une autre fonction, c'est une autre partie du message qui sera
occultée.

Le développement à partir d'une cellule simple va se faire par de nombreuses divisions


cellulaires (mitose) et par le blocage ou le déblocage de certains gènes, les cellules orienteront
leur développement vers une voie particulière qui formera soit un tissu, soit un organe ou
autres éléments nécessaires à la future plante.

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Chapite II. Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

Ce sont des inhibitions sélectives qui provoquent la différenciation entre les cellules et leur
spécialisation. Toutes les cellules contiennent en puissance la totalité de l'organisme, mais
elles n'en expriment qu'une partie. Cependant, contrairement aux cellules humaines ou
animales, certaines cellules végétales ont le don de se déspécialiser et de redevenir capables
d'engendrer un organisme entier. C'est précisément cette faculté que l'on exploite dans la
propagation in vitro de plusieurs plantes. Les cellules végétales appartiennent à des tissus très
spécialisés qui possèdent la possibilité de se déspécialiser, formation d'un CAL, et redevenir
capables d'engendrer une plante entière en recommençant tout le processus de spécialisation
(blocage et déblocage).

Afin de réaliser la culture in vitro de tissus végétaux, il est important de respecter les étapes
de mêmes que les différentes conditions nécessaires, le choix de l’explant et le milieu de
culture.

II.1. Les explants

L’explant est une petite partie ou fragment du plante-mère, qui est mis en culture dans
l’éprouvette. L'état sanitaire de cette plante conditionne la nature de l'explant.

- Si le plant-mère est malade, virosée, alors il faudra prélever un explant constitué de cellules
méristématiques. Ce type d'explant est appelé indifférencier.

- Si le plant-mère est en santé, alors d'autres types d'explant pourront être prélevés, c’est
explants sont appelés différenciés.

Cependant, il est important de noter que d'autres facteurs vont conditionner les réactions de
l'explant, l'âge ou le stade physiologique du plant-mère, la structure, la taille et l'emplacement
de l'explant lui-même. En effet, des explants différents prélevés sur une même plante donnent
des résultats différents sur un milieu identique.

L’explant peut être prélevé sur n'importe quelle partie du plant-mère à condition de renfermer
des tissus vivants et de tenir compte de l’état du plant. Il y a plusieurs sortes d'explants :

- Les explants indifférenciés sont prélevés à l’apex de tige, de racine, de bourgeons, de


nœuds,

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Chapite II. Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

- Les explants différenciés sont prélevés sur la tige, la feuille, la racine. Ces explants sont des
structures constituées de cellules très spécialisées qui devront se déspécialiser avant de
pouvoir régénérer la plante entière.

II.2. Le milieu de culture

Le milieu de culture est important pour la croissance. Il est le plus souvent une solution
aqueuse rendue semi-solide ou moyen de gélose (agar). Remplaçant le sol et suppléant la
plante, il doit contenir différents éléments. Très généralement il est composé d’une base
comprenant des sucres (énergie), des éléments minéraux divers, des régulateurs de croissance,
des vitamines, des composés organiques (acides aminés, polypeptides, …).

La concentration de ces composés peut varier d'une espèce à l'autre, mais ces variations n'ont
qu'une incidence faible sur les réactions des cellules. Les facteurs essentiels sont les
régulateurs de croissance qui stimuleront la multiplication cellulaire et orienteront la
morphogenèse.

Dans le milieu de culture, on retrouve des substances qui sont : - soit endogènes, c’est-à-dire
qu’elles sont produits par la plante ;

- soit exogènes, c’est-à-dire des substances de synthèse ou artificiel mais dont l'effet est
similaire.

II.2.1. Les principales substances (régulateur de croissance)

Utilisées pour la culture in vitro sont les auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Leurs
effets varient avec les concentrations utilisées et le dosage, à doses élevés, ils peuvent se
montrer inhibiteurs ou toxiques. (Figure 5)

Dans la famille des auxines, on retrouve l’acide indolyocétique (AIA) et les substances de
synthèse à action analogue comme l'acide naphtylacétique (ANA), l'acide indolybutyrique
(AIB) ou l'acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4D). Ces substances possèdent de
nombreuses propriétés. - Activent la multiplication cellulaire (mitose) ;

- Amènent la formation de racines (rhizogénèse) ;

- Stimulent le métabolisme.

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Chapite II. Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

Dans la famille des cytokinines, certaines sont des composés endogènes comme la zéatine et
l'isopentényladénine (IPA), ou de synthèse comme la benzyladénine (BA) ou la kinétine.

- Agissent en synergie avec les auxines avec un effet stimulant sur le métabolisme et sur la
division cellulaire. Si de fortes concentrations de cytokinines sont combinées à des
concentrations plus faibles d'auxines, les cytokinines ;

- Agissent en synergie avec les auxines ;

- Activent la multiplication cellulaire (mitose) avec la formation d'un cal.

Dans la famille des Gibbérellines on retrouve que des substances endogènes. La plus utilisée
est l'acide gibbérellique (GA3). Les gibbérellines seront utiles dans les cas ou seule la
croissance est souhaitée. - Stimulent l'élongation cellulaire et la multiplication cellulaire ;

- Elles peuvent rendre les cellules plus sensibles à l'action des


auxines.

Comportements des deux grands types d'explants dans le milieu de culture Pour les explants
indifférenciés, lorsqu’ils sont disposés sur le milieu approprié, on observe rapidement une
cicatrisation de la blessure. Il se produit alors la différenciation ou la spécialisation. Par la
suite, plusieurs modalités sont possibles :

- la plus simple, (œillet ou chrysanthème) un seul milieu contenant une auxine et une
gibbérelline suffira pour assurer la croissance de la jeune plante jusqu'au stade
d'acclimatation. Dans ce cas, l’auxine et la gibbérelline assurent la croissance de la jeune tige
qui émettra ensuite des racines.

- la plus complexe, (rosier ou pommier) une succession de milieux est nécessaire pour assurer
les différentes étapes de la morphogenèse.

Pour les explants différenciés, ils doivent effectuer un retour à l'état méristématique. Après le
repiquage on observe la formation du tissu cicatriciel (le cal), qui procédé la multiplication
cellulaire. Il se produit la dédifférenciation ou la déspécialisation qui sera suivit d'une
différenciation ou d'une spécialisation. Si cette phase se réalise, plusieurs voies sont possibles
selon les espèces.

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Chapite II. Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

- la première est la voie de la callogenèse dans laquelle les cellules se multiplient activement,
forment un massif globuleux et sont plus ou moins fortement liés. Ce stade qui constitue la
première étape du retour peut être le seul atteint, ensuite, quel que soit le milieu, il n'est pas
possible d'obtenir de néoformations de bourgeons. Quelquefois cette phase est un préalable à
l'organogenèse.

- la seconde voie qui parcourt toutes les étapes et conduit à l’état méristématique soit à partir
du cal ou de certaines cellules épidermiques.

- la troisième voie est celle qui conduit à la formation d'embryons somatiques (les clones).
Elle peut se produire après la formation d'un cal ou bien directement à partir de quelques
cellules ou de cellules isolés. Les embryons somatiques mis en culture sur un milieu de
croissance redonnent une plantule identique au pied-mère.

Dans ce type d'explant, il faut noter que le comportement est conditionné par d'autres facteurs
comme l'âge du plant-mère, les dimensions de l'explant, la manière de placer l'explant dans le
milieu de culture, l'exposition du plant-mère à la lumière, …

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Chapite II. Phénomènes physiologiques liés à la réalisation de culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

Figure 5 : Le fonctionnement des hormones

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Chapitre III. Besoins nutritifs des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques
Dr. Guettouchi Ahlam

Les techniques de culture in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement


(température, lumière, composition du milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de
l’orienter vers un programme d’évolution déterminé.

Premier élément : toutes les cellules du végétal n’ont pas les mêmes potentialités au cours du
développement. Certaines se spécialisent et se différencient et perdent leur possibilité de se
diviser. D’autres forment des plages de cellules indifférenciées qui forment les méristèmes et
qui se divisent activement. Ce sont des zones à l’origine de la croissance (en largeur ou en
longueur) des plantes.

Deuxième élément : des régulateurs de croissance ont été identifiés. Ils affectent la vitesse de
croissance des cellules et leur différenciation, et sont impliqués dans les corrélations entre
organes. La découverte de ces substances (auxines, gibbérellines, cytoquinines, acide
abscissique, éthylène, oligosaccharines) a permis le développement des techniques de culture
in vitro.

D’autres facteurs interviennent et notamment le choix de l’explant, dont dépend la totipotence


des cellules prélevées. Ces mécanismes de « vieillissement » sont dus à des modifications de
la structure des méristèmes. Pour donner un exemple on peut citer l’aptitude au bouturage qui
décroît lorsque l’âge des pieds-mères augmente. Mais la perte liée à l’âge ne se retrouve pas
de façon égale au niveau des différentes parties de la plante, la partie racinaire de la plante
constituant souvent le pôle de juvénilité de la plante. Idem pour la période de l’année dans
laquelle on se situe : réapparition d’un fonctionnement de type juvénile au début de chaque
poussée annuelle, ou même de chaque réitération. Ou encore « retour en arrière » lors de la
floraison : c’est la régénération plus ou moins complète du potentiel morphogénétique initial,
et celle-ci précède la différenciation des organes floraux. On pourra donc intervenir sur la
qualité de l’explant : en fonction de l’âge du pied-mère, en fonction de l’époque de
prélèvement, en fonction de sa localisation sur le pied-mère, en fonction aussi de sa taille et
de sa nature.

III.1. Les sels minéraux


Les besoins nutritifs des plantes en culture in vitro concernent d’abord les sels minéraux. Le
praticien doit avant toute chose recréer pour la plante un milieu de vie comparable au sol dont
elle sera maintenant dépourvue. Tous les éléments essentiels à sa croissance doivent donc être
incorporés au milieu sans quoi une carence minérale peut survenir. De plus, le choix des

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Chapitre III. Besoins nutritifs des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques
Dr. Guettouchi Ahlam

différents sels devra respecter un équilibre ionique afin de favoriser une croissance
harmonieuse sans créer d’inhibition. Les besoins des cultures de tissus en éléments minéraux
ont été étudiés par différents auteurs et le fruit de leurs recherches a donné lieu à différentes
compositions minérales toujours utilisées aujourd’hui. Ces formulations portent souvent le
nom de leurs auteurs tels que GAMBORG (Canada), GAUTHERET (France), HELLER
(France), MURASHIGE et SKOOG (Etats-Unis), WHITE (Etats-Unis), MOREL (France),
etc.
La composition du milieu de culture Murashige et Skoog est sans doute la plus utilisée car
elle convient à un très grand nombre de plantes de familles botaniques différentes. Ce milieu
est très riche en sels minéraux et il convient souvent de le diluer de moitié ou plus afin
d’éviter des effets osmotiques inhibiteurs, particulièrement chez les espèces à croissance très
lente.

III.1.1. Milieu de Murashige et Skoog (Tableau 1)


Le milieu de Murashige et Skoog (ou Milieu MS ou MSO) est un milieu de culture utilisé dan
s les laboratoires debiologie végétale pour la culture de cellules ou de tissus de plantes. Le
milieu MS a été mis au point par lesphysiologistes végétalistes Toshio Murashige et Folke K
Skoog alors que Murashige effectuait des recherches pourtrouver un nouveau régulateur de
croissance chez le tabac.

13
Chapitre III. Besoins nutritifs des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques
Dr. Guettouchi Ahlam

Tableau 1 : Milieu MS (Murashige et Skoog) 1962

Constituant Solution mère (mg Volume à ajouter Concentration


par litre) (ml par litre) finale (mg par litre)
Macro-éléments 50 ml
20X
NH4NO3 33 000 1 650
KNO3 38 000 1 900
CaCl2-2 H2O 8 800 440
MgSO4-7 H2O 7 400 370
KH2PO4 3 400 170
Micro-éléments 10 ml
100X
MnSO4- H2O 2 230 22.3
ZnSO4-7 H2O 860 8.6
H3BO3 620 6.2
KI 83 0.83
Na2MoO4 -2 H2O 25 0.25
CuSO4 -5 H2O 2.5 0.025
CoCl2 -6 H2O 2.5 0.025
Fer 100 X 10 ml
Na2EDTA 3 730 37.3
FeSO4-7 H2O 2 780 27.8
Acides aminée et 10 ml
vitamines 10 X
Glycine 20 mg pour 100 L 2.0
Ac. Nicotinique 5 mg pour 100 L 0.5
Pyridoxine – HCl 5 mg pour 100 L 0.5
Thiamine – HCl 1 mg pour 100 L 0.1
Sucres
Myo-inositol 100
Sucrose 30 000
Agar 10 000

III.2. Les vitamines


Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles
sont particulièrement utiles en micropropagation lorsqu’un fragment seulement de la plante
est utilisé pour générer la culture de plantes entières. On comprendra que dans ces
circonstances, la synthèse endogène (par le tissu végétal lui-même) de vitamines risque d’être
insuffisante et que le milieu devra y suppléer en conséquence. Les vitamines les plus
fréquemment utilisées sont la thiamine HCL, la pyridoxine, la biotine, le pantothénate de
calcium et le myo-inositol (le myo-inositol est parfois considéré comme un sucre). Les

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Chapitre III. Besoins nutritifs des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques
Dr. Guettouchi Ahlam

concentrations sont souvent faibles et il sera alors nécessaire de fabriquer des solutions-mères.
La conservation de ces solutions-mères pourra se faire au congélateur en contenants de
plastique ou distribuées dans des cubes à glaçon par petits volumes (exemple 10 ml), puis
démoulés une fois gelés et rangés dans des sacs à congélation. Une fois la solution sortie et
décongelée, elle devra être utilisée dans les 2 à 4 semaines qui suivent.

III.3. Les régulateurs de croissance


On les appelle aussi « phytohormones » ou « hormones végétales », mais considérant qu’il
s’agit variablement de produits de synthèse ou de produits synthétiques, il est préférable
d’utiliser le terme régulateurs de croissance. Ces substances sont utilisées à des doses très
faibles (0.01mg/l à 10 mg/l) et nécessitent le plus souvent d’être pesées sur une balance de
précision à 0.0001g. Il est toutefois possible de fabriquer des solutions-mères à partir de
masses s’élevant à 100 mg et d’opérer par la suite une série de dilutions. Les trois principaux
groupes de régulateurs de croissance d’usage fréquent sont les AUXINES, les
CYTOKININES et les GIBBERELLINES.

III.4. L’environnement

III.4.a. La lumière

Besoin de lumière Chez les plantes cultivées in vitro, la photosynthèse n'est pas une activité
nécessaire puisque l'énergie est fournie par les glucides du milieu. Cependant, même réduite
la photosynthèse persiste dans les tissus. De plus la lumière est indispensable au
déclenchement et au bon déroulement de certains processus morphogénétiques : nécessité de
jours longs pour obtenir des boutons floraux par ex. La puissance lumineuse à fournir dépend
de la durée de l'éclairement et de la qualité spectrale de la lumière reçue par la culture. On
exprime l'intensité lumineuse en W.m-2, intensité mesurée au niveau de la culture. On obtient
généralement 100 à 150 W.m-2 pour des tubes fluorescents placés à 20cm au dessus des
récipients de culture.

III.4.b. Rôle de la température

La température est généralement régulée à 20/25°C en continu. Il ne faut pas négliger que la
température dans les flacons de cultures peut être supérieure de 2 à 4°C à la température de la
pièce à cause de l'éclairage.

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Chapitre III. Besoins nutritifs des tissus et cellule cultivés en conditions aseptiques
Dr. Guettouchi Ahlam

III.4.c. Hygrométrie Elle doit atteindre les 100% d'humidité relative dans les flacons.
Cependant, il faut veiller à ne pas noyer les explants par un excès de condensation à la surface
du milieu.

III.4.d. stérilité

Le propre de la culture végétale est qu'il s'écoule un laps de temps important entre les
repiquages (jusqu'à 3 mois). Comme les milieux sont riches et les conditions de cultures
chaudes et humides, toutes les conditions d'un développement bactérien ou fongique sont
réunies. Les causes d'infection sont nombreuses. Il faut donc manipuler dans des conditions
d'asepsie rigoureuses : - matériels passés à l'alcool ou flambés, - désinfection des plantes à la
Javel puis rinçage à l'eau distillée avant l'extraction de l'explant.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

IV.a. Les étapes et les techniques de la culture in vitro

Les cultures in vitro de plantes sont des cultures d'explants de plantes, sur un milieu nutritif
artificiel, en conditions stériles, dans un environnement contrôlé et dans un espace réduit.
C'est donc, une méthode pour maintenir et cultiver indéfiniment des plantes ou des cellules
sur des milieux nutritifs artificiels. Les explants peuvent être des parties d'organes ou des
organes entiers, (tige, feuille, racine, fleurs, etc.), des tissus, des pièces florales, des graines ou
des embryons, des bourgeons ou des apex ou des méristèmes, des cellules somatiques ou
sexuelles, des cellules végétales débarrassées de la paroi ou protoplastes. L'explant est choisi
en fonction de la technique utilisée, de l'objectif visé, mais aussi de l'espèce travaillée.

Les techniques de culture in vitro, outre l’aspect technologique, doivent permettre de pallier
un certain nombre de difficultés :

• maintenir l’explant en vie et en activité ;

• permettre à cet explant d’entrer normalement en croissance si il est déjà une structure
organisée (apex, méristème, bourgeon) ;

• induire chez des cellules différenciées (fragment de feuilles, de racines, de tiges, de


pétioles, etc.) un processus de dédifférenciation.

La composition du milieu de culture est l’élément déterminant de la réussite de la


multiplication végétative in vitro. Les différents éléments composant un milieu de culture
idéal sont les suivants : eau, sels minéraux (macroéléments et micro éléments), fer chélaté,
vitamines (généralement du groupe B), phytohormones (ou régulateurs de croissance), la
source carbonée (généralement du saccharose), et l’agent gélifiant pour les milieux solides; le
milieu le plus utilisé dans le monde actuellement est celui de Murashige et Skoog baptisé
milieu MS. Le milieu synthétique sera renouvelé toutes les 4 à 5 semaines pour une croissance
optimale des vitroplants. Les conditions stériles ou d'asepsie sont obtenues par un ensemble
d’opérations qui permettent de protéger l’explant à multiplier et son milieu contre toute
contamination microbienne.

Les explants sont désinfectés, les milieux et les récipients stérilisés à l'autoclave et les
opérations de mise en culture se font sous hotte à flux laminaire. Le contrôle de
l'environnement de culture des explants se fait par le contrôle des conditions de température,
d'éclairement (durée et intensité) et d'humidité relative.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

L'espace est réduit car les plantes sont miniaturisées, cultivées dans des récipients posés sur
des étagères éclairées, ce qui permet d'avoir la possibilité de replanter des hectares de terrain à
partir de plants cultivés sur quelques mètres carrés. Toutes les étapes de développement des
plantes peuvent être reproduites in vitro; c'est le cas par exemple de la tubérisation.

IV.b. Les étapes de la culture in vitro

Quatre étapes principales sont nécessaires pour établir une espèce, un cultivar, une variété in
vitro.

Une première étape d'initiation de la culture est nécessaire : c'est la phase la plus sensible qui
consiste à désinfecter les boutures (racine, bourgeon, etc.) ou les graines afin de les rendre
stériles, avant de les placer sur un milieu de culture approprié. Viennent ensuite les étapes de
multiplication, d'enracinement et enfin de sevrage ou acclimatation. Le sevrage est le passage
des conditions de laboratoire aux conditions de serre. Cette phase s'avère souvent critique, car
les plantes en tubes ont perpétuellement leurs stomates ouverts, même les plantes succulentes
peuvent sécher si le changement d'environnement se fait trop brusquement.

Les techniques de culture in vitro sont des outils qui vont aider l'obtenteur de plantes à
différents niveaux de son programme d'amélioration, notamment pour réduire les délais de
production des nouveaux cultivars, mais aussi pour assainir les variétés, les améliorer, les
conserver et réduire les coûts de production. Elles sont multiples et se classent en deux
groupes; celles qui vont aboutir à une multiplication conforme: micropropagation,
embryogenèse somatique, culture de méristèmes etc., celles qui vont aboutir à une création de
variabilité : mutagenèse, variations somaclonales, transgenèse etc.

VI.b.1. Les phases de la micropropagation

Voici globalement les cinq stades de la micropropagation:

1. Conditionnement des plants mère;

2. Établissement (ou initiation) d’une culture aseptique;

3. Multiplication des tiges;

4. Rhizogénèse (ou enracinement des tiges);

5. Acclimatation des plantules.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

Stade 1 : Conditionnement des plants mères

Dans la description de cette technique on passe souvent sous silence le stade 1 qui contribue
pourtant pour beaucoup au succès des stades suivants. Ce stade 1 réfère au conditionnement
du plant mère. En effet, le plant mère devrait être dépourvu de carences minérales et en pleine
turgescence donc sans stress hydrique important. Au mieux et dans presque tous les cas, le
plant devrait être en croissance active, donc mis en culture en dehors de sa période de
dormance. Ceci limite dans le calendrier de production, les dates préférables de mises en
culture pour le stade d’initiation. Mais, une fois in vitro, ces plants pourront être multipliés à
l’année longue. Aussi les plants mère choisis le seront en fonction de leur état sanitaire. Des
plants infestés d’insectes peuvent apporter des problèmes de taille à toute une chambre de
culture.

Stade 2 : Établissement d’une culture aseptique

La littérature fournie souvent les premières informations essentielles au départ d’une culture.
On trouve dans les livres ou revues spécialisés le détail des formulations (recettes) de milieux
nutritifs convenant à de très nombreuses espèces végétales. Généralement les auteurs
précisent aussi le protocole de désinfection de surface des explants ainsi qu’une description de
l’explant mis en culture. Ce stade est de première importance puisqu’il comporte de
nombreux facteurs critiques : Le choix du plant mère; Le choix du fragment végétal à mettre
en culture; Une stérilisation de surface adéquate garantissant la survie de l’explant tout en
assurant l’asepsie; · La découpe de l’explant et sa position sur la gélose; Le choix du milieu
de culture qu’il est parfois nécessaire d’ajuster légèrement par la suite suivant la réponse de
l’explant; · La qualité du travail en asepsie de la technicienne ou du technicien. Dans plus de
50 % des cas, les premiers essais de mise en culture sont très satisfaisants et demandent très
peu ou pas d’ajustements. Pour certains autres cas, la difficulté réside dans la désinfection des
végétaux, pour d’autres dans l’ajustement de l’équilibre hormonal. Mais selon tous les
auteurs, théoriquement tous les végétaux quels que soient leur espèce ou leur cultivar, peuvent
être cultivés in vitro. Les explants les plus aptes à entreprendre une multiplication sont
généralement riches en bourgeons ou en zones méristématiques potentielles. Ils varient selon
les espèces :

Les feuilles (ex. Ficus, Saintpaulia, Bégonia…);

· Les tiges (asperge, colza…);

19
Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

· Les bourgeons (fraisier, vigne, lilas,…);

· Inflorescences (chou-fleur, gerbera, hosta, poireau …).

La multiplication à partir de la croissance de bourgeons axillaires offre les meilleures chances


de conserver les caractéristiques de l’espèce ou de la variété. En effet, cette technique ne fait
qu’accélérer le fonctionnement normal des méristèmes de bourgeons déjà présents sur la
plante. Par contre, on diminue les chances d’une stabilité génétique en provoquant
l’apparition de bourgeons nouveaux (la plupart du temps à partir d’un cal, en des endroits
inhabituels tels les feuilles, les tiges, les racines).

Stade 3 : La multiplication des tiges

Cette étape s’effectue au repiquage des plantules obtenues au stade précédent. On veut ici
accroître le nombre de plants d’un facteur de 4 à 5 à chaque cycle chez les ligneux, et d’un
facteur de 4 à 12 chez les herbacées. Le milieu nutritif utilisé est souvent identique à celui du
premier, bien qu’une différence parfois mineure s’observe dans la balance hormonale
(équilibre auxine-cytokinine). Au stade de la multiplication, les cytokinines sont généralement
présentes en plus grande concentration dans le milieu que les auxines. Ceci s’explique d’un
point de vue physiologique par le fait que les cytokinines s’opposent à la dominance apicale
donc stimulent la croissance de nouvelles tiges. Encore une fois, la littérature fournie
généralement les informations nécessaires nous permettant de fixer notre choix sur une
formulation appropriée. La vitesse de croissance des plantes in vitro se module à celle in situ.
Si l’espèce mise en culture est à croissance lente, on peut s’attendre à observer une croissance
lente dans les tubes.

Stade 4 : La rhizogénèse (enracinement)

Cette étape se caractérise par la naissance de racines sur les tiges feuillées obtenues au stade
de la multiplication. Il arrive parfois que des espèces présentent un système racinaire plus ou
moins développé au stade de la multiplication. Dans ce cas, il serait avantageux de faire des
essais pour le passage immédiat en acclimatation. On économise ainsi temps et argent s’il
nous est possible de passer outre cette étape (ex. Bégonia, Saintpaulia, fougère). Toutefois, si
ce stade s’avère nécessaire, le milieu de culture varie quelque peu des milieux précédents. Les
sels minéraux et les vitamines demeurent généralement les mêmes. Mais dans le cas du rosier
par exemple, on suggère de diminuer la concentration des sels minéraux de moitié. La

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

différence majeure se situe principalement au niveau de l’équilibre hormonal qui se fera cette
fois en faveur des auxines. Des tiges très feuillées et bien pourvues de bourgeons
s’enracineront assez facilement dans un milieu dépourvu de régulateurs de croissance. Les
jeunes feuilles et les bourgeons sont des sites naturels de production d’auxine et à l’image des
boutures traditionnelles, ces jeunes plantules sauront s’enraciner d’elles-mêmes. Par contre,
certaines espèces exigent l’apport d’auxines afin de stimuler l’initiation de leurs racines. Cet
auxine est souvent fourni sous forme d’AIA.

Stade 5 : L’acclimatation

Il s’agit de la dernière étape qui consiste à adapter progressivement les microplantules aux
conditions qui prévalent dans la serre ou à l’extérieur. Après avoir éliminé la gélose de la base
des plants, ils sont transférés dans un substrat horticole. Les parties aériennes sont ensuite
recouvertes de manière à les maintenir dans un environnement qui avoisine les 100 %
d’humidité relative. Les stomates de ces jeunes feuilles cultivées in vitro demeurent
constamment ouverts et laissent donc s’échapper l’eau de transpiration de manière continue.
Les risques de dessèchement sont très élevés. Aussi doit-on attendre la croissance de
nouvelles feuilles fonctionnelles avant d’enlever progressivement la pellicule de
recouvrement.

IV.1.Application de la culture in vitro : culture des méristèmes, culture de pollen

IV.1.1. Différenciation et dédifférenciation

IV.1.1.a. La différenciation

Les cellules d’un organisme proviennent toutes d’une même cellule-œuf ou zygote. Au cours
de l’ontogenèse la mise en place des différents tissus implique la différenciation des cellules.
Cette différenciation fait apparaitre une diversité qui se situe à plusieurs niveaux : niveau
cytologique des structures et infrastructures cellulaires, niveau biochimique, niveau
physiologique du fonctionnement.

IV.1.1.b. La dédifférenciation

A l’inverse, des tissus déjà différenciés peuvent se dédifférencier c'est-à-dire recouvrer les
caractéristiques cytologique et les potentialités des cellules embryonnaires.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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Bien que les phénomènes de dédifférenciation puissent être observés chez les animaux, leur
fréquence et leur importance chez les végétaux est à la base de la multiplication végétative,
souvent conditionnée par la possibilité de néoformation des méristèmes.

Il est évident que la dédifférenciation ne peut affecter que des cellules qui ne sont pas trop
engagées dans une spécialisation trop poussée.

La dédifférenciation peut être observée dans des conditions naturelles, lors de la formation de
bourgeons et de racines adventives. La néoformation d’une ébauche de racine à partir de
cellules péricycliques ou celle d’une ébauche de bourgeon à partir d’un fragment de feuille
nécessite une dédifférenciation accompagnée d’une reprise de l’activité mitotique.

IV.1.2. La culture des méristèmes

Les plantes se développent grâce à des méristèmes, soit des petits groupes de cellules non
différenciées qui se divisent. Dans le reste de la plantes, les cellules se différencient en
fonction de leur situation: cellules de surface (épiderme), cellules de remplissage
(parenchyme), cellules conductrices de la sève (Phloème, Xylème), … et cessent de se diviser

Ces méristèmes se trouvent dans les bourgeons, aux extrémités des racines et sur la longueur
des tiges et des racines (méristèmes latéraux: ils induisent la croissance en épaisseur).

- Les bourgeons axillaires : ce sont les bourgeons situés à la base des feuilles.
- Le bourgeon terminal : il s'agit de celui situé au sommet de la plante.
- Les bourgeons adventifs : des cellules de la plante se dédifférencient et forment un
nouveau méristème qui va développer un bourgeon (bourgeon adventif) puis une tige,
ou une racine. Ces tiges ou racines sont alors appelées tiges ou racines adventives.(
Figure 6)

La culture de méristèmes peut être considérée comme un microbouturage. Elle a été mise au
point et utilisée pour la première fois par MOREL et MARTIN (1952, 1955) avec le Dahlia et
la pomme de terre pour la reconstitution de clones sains à partir de plantes infestées par des
maladies à virus. Puisque elle utilise des points végétatifs préexistants, le seul problème
d’organogenèse que pose (à première vue) la culture de méristème est la rhizogénèse.

Cependant, à la suite des observations de MOREL (1960) sur les orchidées et de divers
auteurs sur la possibilité de déclencher la prolifération des bourgeons axillaires à partir de

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

l’apex cultivé initialement il est apparu que la culture de méristèmes (ou d’apex), outre son
intérêt phytosanitaire, pouvait permettre la multiplication avec un taux très élevé.

 La culture de méristème est une culture aseptique sur milieu artificiel du dôme apical
sans ébauche foliaire. Il mesure 0,2 à 0,3 mm de côté et la dissection se fait sous loupe
binoculaire. La technique peut être associée à de la thermothérapie: culture à
température élevée, pour favoriser l'élimination des virus. (Figure 7)

Figure 6 : Les méristèmes

Figure 7 : Schématisation de la culture de méristème

C'est la seule façon d'obtenir des plantes saines indemnes de virus.

23
Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

 La culture de méristèmes permet le sauvetage des variétés menacées de disparition car


très virosées. Elle concerne essentiellement les plantes à reproduction par voie
végétative: bouturage, marcottage, etc. tels le Pelargonium, le dahlia, le chrysanthème,
la pomme de terre, l'artichaut, le fraisier, framboisier, etc. car cette voie favorise la
transmission des virus à la descendance.

Les plantes produites sont saines: sans virus, champignons et bactéries et répondent
aux normes phytosanitaires d'échanges internationaux de plus en plus draconiennes.

Les plantes assainies ont une vigueur accrue, et des qualités de floraison et de
fructification restaurées.

On obtient des variétés conformes à la variété d'origine et que l'on peut multiplier en
grande quantité, la production est homogène.

 Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues résistantes aux
virus. Elles peuvent être recontaminées via des insectes si des mesures de prophylaxie
ne sont pas prises. Pour certaines variétés qui présentent des chimères: plantes
panachées de Petunia ou de Pelargonium par exemple, par culture de méristèmes il est
possible de ne pas retrouver à la régénération ce caractère horticole.

 De nombreuses variétés de diverses espèces ont été sauvegardées grâce à cette


technique: pomme de terre (Belle de Fontenay en 1954), dahlias, fraisiers, vigne, iris,
framboisiers etc.

Récemment la Violette de Toulouse a été sauvée du déclin grâce à la culture de


méristèmes qui a permis de régénérer des plantes sans virus.

Beaucoup de plantes horticoles de grande diffusion tels le Pelargonium, le


chrysanthème etc. sont produites à partir de pieds mères qui ont été assainis par culture
de méristèmes. Il en est de même pour des espèces maraîchères tel l'artichaut ou
encore le fraisier.

IV.1.1.2. Régénération des vitroplants

On comprend aisément que l'excision suivie de la culture in vitro des méristèmes aboutisse à
la régénération de la plante. Selon l'espèce et les hormones utilisées dans Biotechnologies du

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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clonage des génotypes, le méristème excisé donne des formations diverses : plantes, tiges,
embryons, cals régénérants d'autres méristèmes, etc.

Toutes ces structures produites par les méristèmes gardent une très forte potentialité de
déroulement du programme de morphogenèse et sont généralement très fortement
régénérantes. Ce sont donc des explants de choix pour produire des vitroplants, surtout dans
les cas où un méristème excisé donne in vitro une structure développant de nombreux
méristèmes adventifs, augmentant ainsi le pouvoir de multiplication de l'opération.

Chaque ébauche mise en place par les méristèmes terminaux est pré-programmée pour son
développement ultérieur (bourgeons végétatifs et bourgeons floraux chez un fruitier par
exemple).

La partie terminale de l'ébauche est stratifiée, elle aussi, en un méristème qui se mettra à
fonctionner comme le méristème apical mais en prenant comme origine de programme
génétique l'étape qui est inscrite dans ses cellules. On peut aussi in vitro cultiver ces
méristèmes axillaires. S'ils sont très jeunes (sous l'angle du programme génétique), ils
régénèrent des individus qui ont un développement sensiblement normal ; s'ils ont un âge
génétique plus avancé, ils peuvent donner des régénérants déjà «âgés» (par exemple des pieds
de tomate dont la floraison est ainsi hâtée, ce qui peut être intéressant). Mais il faut noter aussi
que le milieu de culture in vitro constitue, en lui-même, un système de résonance avec
l'explant et qu'il peut, par les hormones choisies, dédifférencier le tissu mis en culture,; c'est-
à-dire décorréler le réseau épigénique et ainsi rajeunir le programme génétique. Un stade, se
rapprochant du point zéro, est obtenu fréquemment en utilisant le 2-4 D qui déclenche la
production d'une forte callogenèse.

IV.1.2. La multiplication végétative (La micro-propagation)

Elle permet de reproduire un individu et le multiplier en très grand nombre, à partir de


cellules ou d’un fragment d’organe. Elle se réalise par exemple à partir de nœuds, de pousses
axillaires et s’apparente au bouturage des jardiniers. Mis en culture, ces tissus se développent
et donnent une plante entière grâce à l’usage séquentiel de milieux nutritifs adaptés.

25
Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

Figure 7 : Schématisation du microbouturage

IV.1.3. La culture d’anthère et de pollen

Une plante haploïde est une plante dont le nombre de chromosomes est égal au nombre
chromosomique des gamètes de la plante dont elle est issue. Les chromosomes de chaque
paire n’y sont présents qu’à un seul exemplaire sauf quand il s’agit d’autopolyploides. De
tailles plus réduite que le parent diploïde correspondant, L’haploïde est morphologiquement
identique à celui-ci mais stérile. Ce n’est qu’après le doublement de son nombre
chromosomique, lequel peut etre spontané, inhérent au processus lui-même, que la fertilité est
recouvrée et que la fixation de l’information génétique du génome haploïde par la duplication
de celle-ci se produit. On obtient alors des haploides doublés lignées homozygotes pour
l’ensemble de leurs gènes. Ce sont donc des lignées théoriquement parfaitement pures. Cette
méthode, appelée « haplodiploidisation » permet donc d’accélérer la phase de fixation des
produits de la recombinaison génétique issus d’un croisement.

 C'est la régénération de plantes entières à partir de culture de cellules sexuelles mâles:


des grains de pollen immatures, soit par culture de pollen isolé, soit par culture
d'anthères.
 Obtenir des plantes haploïdes doublées, (après doublement spontané ou artificiel par
colchicine ). Ainsi des lignées pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 à 10
ans par technique classique d'autofécondations.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

L'obtention de lignées pures est une étape presque toujours nécessaire des programmes
d'amélioration des plantes.

 C'est une technique utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le tabac, le maïs,
l'asperge, le piment, etc. et en routine chez le colza, l'orge et l'aubergine.

Le blé Florin a été la première variété issue d'androgenèse inscrite au catalogue


français. Ce fut une première mondiale initiée par le laboratoire d'Amélioration des
Plantes d'Orsay. Aujourd'hui de nombreux cultivars de diverses espèces et issus de ces
techniques d'haplo-diploïdisation sont déposés chaque année.

 Cette technique amène un important gain de temps, ce qui permet de mettre plus
rapidement sur le marché de nouvelles variétés présentant des avantages pour
l'agriculteur, l'industriel ou le consommateur. En effet une plante homozygote est
directement obtenue, ce qui évite de faire une dizaine de générations
d'autofécondations pour obtenir une lignée pure, état nécessaire aux programmes de
sélection végétale.

Les plantes obtenues par cette technique sont totalement homozygotes, cela permet de
dévoiler des caractères intéressants par l'expression des allèles récessifs
habituellement cachés. Ces gènes pouvant être exploités éventuellement.

Des recombinants intéressants peuvent ainsi être détectés et exploités, une résistance à
une maladie par exemple.

 Le rendement, (nombre de plantes viables/100 anthères cultivées) est souvent


dépendant du cultivar.

Certaines variétés de céréales produisent un grand nombre de plantes albinos, donc


non viables.

Des applications pour d'autres techniques :

IV.1.4. L’obtention d’embryons somatiques L’embryogénèse somatique est la production


d’embryons à partir de cellules non germinales (par exemple cellules méristématiques)
soumises à un traitement hormonal. Après cette induction, il se produit une multiplication des
cellules suivie d’une différenciation progressive des embryons en culture.

27
Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

IV.1.5. Le sauvetage des embryons Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être
prélevés, mis en culture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage d’embryons
consiste à prélever un embryon précocement, à le cultiver in vitro, soit pour accélérer les
cycles végétatifs, soit parce qu’il ne pourrait pas se développer dans les tissus maternels, par
exemple lorsqu’il résulte d’un croisement interspécifique.

IV-1-6- L’obtention de protoplastes Les protoplastes sont des cellules débarrassées de la


paroi pectocellulosique par hydrolyse enzymatique. Ils peuvent être obtenus à partir de
différents tissus d’une plante, de préférence des limbes de jeunes feuilles. Limités seulement
par la membrane cytoplasmique, les protoplastes peuvent fusionner ce qui permet de créer de
nouvelles variétés, d’introduire des caractères à hérédité cytoplasmique. Des plantes
transgéniques peuvent être obtenues à partir de protoplastes transformés par électroporation.,
Cette méthode permet d’introduire de l’ADN nu (construction génique) dans les protoplastes
par l’utilisation d’un champ électrique de haut voltage qui rend perméable leur membrane
cytoplasmique.
L’ensemble de ces techniques permet de régénérer des plantes entières. (Figue 8)

Figue 8 : Les applications de la culture in vitro

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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IV.2. Biotechnologie et amélioration des plantes

IV.2.1. L'amélioration des plantes

II y a des centaines de milliers d'années, alors que l'un de nos ancêtres ramenait dans sa hutte
des fruits pour les consommer en famille et laissait s'échapper des graines dans des détritus
permettant une germination à proximité de l'habitation, l'amélioration des plantes était
amorcée. Domestication inconsciente d'abord, jardinage ensuite, échanges, codification de
l'agronomie, maîtrise des descendances renforcée par les premières lois génétiques, puis
développement de l'amélioration des plantes en tant que science et éruption des
biotechnologies. Et pourtant la création d'une nouvelle variété est-elle une véritable science ?
Dessiner le profil d'un idéotype répondant mieux aux besoins de l'homme et de ses industries
est aussi œuvre artistique, intuitive, sensible autant au confort de l'utilisateur qu'aux
potentialités techniques du matériau. En revanche, c'est une science que de replacer l'objet
rêvé dans le concret et de calculer la trajectoire la plus efficace et la plus économique pour
aller du matériau-source jusqu'à cet idéotype. C'est dans ce compromis qui tient de la science
et de l'art que se joue l'amélioration des plantes.

Les rendements de grandes productions telles que blé, betterave, maïs, colza, etc. ne cessent
de progresser. On peut chiffrer statistiquement ce gain à 1% en moyenne chaque année. Bien
sûr une bonne partie de ces augmentations doit revenir aux améliorations phytotechniques
(engrais, traitements, machinisme).

Mais des estimations de sources diverses annoncent que la moitié des gains réalisés doit être
attribuée au progrès génétique, qui se traduit par l'introduction de nouvelles variétés.

Si ces rendements sans cesse croissants ont parfois été obtenus au détriment de la qualité, cela
ne constitue que quelques cas très particuliers. La standardisation des blés impose des normes
de valeurs boulangères bien définies qui n'ont pas freiné les gains de production, les valeurs
diététiques de l'huile de colza ont progressé en même temps que les rendements, les taux
d'extraction des jus de betterave à sucre sont meilleurs et les rendements par hectare sont
simultanément en augmentation, etc.

IV.2.2. La biotechnologie

Est un terme relativement récent puisqu’il est apparu pour la première fois vers 1960. Il est
composé de bios (« vie » en grec) et de technologie (entré dans la langue française en 1656,

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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au sens « d’étude des outils, machines et matières premières ». Bien que son étymologie soit
assez précise, sa définition est un peu plus vague, voire parfois subjective. L’utilisation
d’organismes vivants et de leurs produits à des fins commerciales en est une définition large.
Les premiers fabricants de vin et de pain peuvent donc être considérés comme des
scientifiques en biotechnologie avant la lettre. Un sens plus restreint du terme «
biotechnologie » l’associe aux réalisations des soixante dernières années comprenant toutes
les techniques de culture in vitro, ainsi que les différents aspects de la génétique moléculaire,
tels que le clonage de gènes, le séquençage et le génie génétique. De même, il existe deux
définitions possibles du terme « biotechnologie végétale ».

La première est une définition au sens large et traditionnel, selon laquelle la biotechnologie
végétale est l’intervention humaine sur du matériel végétal au moyen d’instruments
technologiques afin de produire des effets temporaires.

La seconde définition, au sens strict et moderne, décrit la biotechnologie végétale comme


l’intervention humaine sur du matériel végétal au moyen d’instruments technologiques afin de
produire des effets permanents (transmissibles à la descendance), incluant le génie génétique,
ou manipulation génétique, pour obtenir des plantes transgéniques.

Le génie génétique végétal consiste à introduire de façon non naturelle de l’ADN externe dans
un matériel végétal pour créer de nouveaux caractères héréditaires. On obtient ainsi des
plantes génétiquement modifiées (PGM) ou plantes transgéniques.

La biotechnologie végétale utilise une technique majeure, appelée « culture de tissus


végétaux », associée à la culture in vitro de protoplastes, cellules, tissus et organes et qui
consiste à cultiver des tissus ou des cellules en milieu totalement artificiel. Malheureusement,
il est impossible de contrôler entièrement tous les facteurs et de reproduire exactement les
mêmes procédures in vitro. La culture de tissus végétaux implique les étapes suivantes :

- la croissance de matériel végétal exempt de microbes en milieu stérile (dans des tubes à
essai ou autres récipients scellés). Toutes les précautions sont prises pour maintenir des
conditions stériles strictes lors de la manipulation et de la culture du matériel végétal ;

- l’utilisation de supports composés d’éléments connus et stériles car de nombreux


composants organiques et inorganiques sont employés dans la culture in vitro de matériel
végétal ;

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
Dr. Guettouchi Ahlam

- l’utilisation d’une chambre de croissance dans laquelle l’environnement (lumière et


température) est contrôlé

IV.2.3. Les avantages de la culture in vitro

- L’assainissement des végétaux


La culture in vitro permet l’élimination des virus et des bactéries.
Exemple : le virus de la pomme de terre.

-La multiplication de masse

Grace à cette technique, on peut obtenir rapidement et indépendamment des conditions


climatiques, un grand nombre de plantes qui sont stockées dans un espace réduit.

-L'accroissement de la diversité

Des plantes rares, en voie de disparition, peuvent être conservées et multipliées en culture in
vitro. De même, des plantes qui font peu de semences et qui sont difficiles à bouturer et/ou à
greffer bénéficient aussi de cette technique. On peut ainsi obtenir des rosiers ou des vignes sur
leurs propres racines.

-La multiplication de nouvelles espèces/variétés ou de plantes stériles:

- plantes résultant de croisement (hybrides) qui sont souvent stériles.


- plantes transgéniques
- plantes à fruits sans pépin
- plante présentant une caractéristique intéressante comme par exemple la couleur
particulière de ses fleurs ---> nouveau cultivar.

-La multiplication de plantes sélectionnées:

- Pour leur résistance aux maladies


- Pour leur production plus importante
- Pour leur tolérance à divers facteurs (sécheresse, excès d'eau, trop ou trop peu
de sels, froid/chaud, herbicide)
- Pour leur vigueur

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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-La sélection de plantes résistantes

On peut exercer une pression de sélection en cultivant les plantes sur des milieux contenant
des concentrations croissantes en sels ou en herbicides. Les plus résistantes sont repiquées sur
du milieu de plus en plus concentré. On peut, par la même technique, sélectionner des plantes
capables de vivre sur des milieux pauvres ou des plantes résistantes à certains pathogènes.

IV.2.1. Fusion de protoplastes

Introduction

Un des développements les plus significatifs de ces dernières années en matière de cultures de
tissus végétaux est l’isolement, la culture et la fusion des protoplastes.

Le terme protoplaste désigne la partie de la cellule qui se trouve entourée par la paroi
cellulaire et que l’on peut plasmolyser et isoler par de moyens mécaniques ou enzymatiques.
L’absence de paroi cellulaire dans les protoplastes est le motif essentiel de leur emploi comme
modèle et outil de travail en physiologie végétale, radiobiologie, virologie et pathologie,
cytogénétique, biochimie, biologie moléculaire, génétique et amélioration des plantes.

Cet important domaine de recherche n’a prospéré qu’à partie de 1960 lorsque Cocking mis au
point la méthode d’obtention des protoplastes par la voie enzymatique. Depuis cette date de
nombreux articles ont été publiés.

IV.2.1.1. Hybridation somatique

a- Signification de cette technologie

La reproduction sexuée est l'un des mécanismes les plus stricts que les processus évolutifs ont
mis en place pour empêcher les flux génétiques entre les espèces. Bien plus, à l'intérieur de
l'espèce elle-même, des frontières très précises permettent tel ou tel type d'accouplement
autorisant ou non l'allogamie ou l'autogamie et définissant par là même la structure génétique
plus ou moins hétérozygote du génotype. La méiose en elle-même impliquant l'appariement
des chromosomes homologues élimine tout remaniement profond des chromosomes et
contrôle ainsi l'homogénéité de l'espèce. Les biologistes ont constaté, au cours des
manipulations cellulaires, que l'on pouvait obtenir des agrégations entre des cellules
débarrassées de leur paroi pecto-cellulosique et qu'il en résultait une fusion des éléments
nucléaires et cytoplasmiques ; le principe même de l'hybridation somatique était né. Melchers

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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montra ensuite que cette fusion était possible entre des protoplastes différents (tomate et
pomme de terre), indiquant ainsi que l'on pouvait transgresser les frontières de l'hybridation
sexuée.

IV.2.1.2. Étapes importantes de l'hybridation somatique

a- Les protoplastes

Dans la cellule végétale, la membrane plasmatique ou plasmalemme est doublée par une paroi
squelettique constituée de fibres de cellulose et de pectine. La cellule exerce une pression sur
ces fibres à la manière d'une chambre à air sur un pneu. Ainsi les plantes herbacées ont une
certaine rigidité due à leur tonicité. Bien que l'état protoplaste ait été connu depuis le début du
siècle, ce n'est que vers les années 1960 que Cocking montrait que, par des enzymes du type
cellulase et pectinase, on pouvait attaquer les fibres pecto-cellulosiques et dissocier les tissus
végétaux, mettant ainsi à nu la membrane plasmatique de chaque cellule. Divers explants sont
utilisables : feuilles, cotylédons, hypocotyles. Il est également possible de partir de matériel
déjà dédifférencié : cals ou suspensions cellulaires. L'accès de l'enzyme aux tissus est facilité,
selon le cas, par dilacération des explants ou infiltration sous vide. Pour le mésophylle
foliaire, la technique classique consiste à ôter l'épiderme inférieur. Malgré la diversité des
origines possibles, le mésophylle foliaire reste la source de protoplastes la plus utilisée. En
effet, cet explant est généralement disponible en grande quantité, son prélèvement ne lèse pas
trop la plante et le matériel produit est abondant et homogène. Les explants préparés sont
alors incubés dans la solution enzymatique, dans de très strictes conditions de durée, de
température, d'éclairement et de pression osmotique. Chaque unité cellulaire dénudée apparaît
alors sous une forme sphérique appelée protoplaste. Chez la luzerne, on obtient ainsi environ
12.106 protoplastes par gramme de feuille traité. Les protoplastes, récupérés par
centrifugations et lavages, et mis dans de bonnes conditions de survie, reconstituent très vite
leur paroi pecto-cellulosique (en quelques heures on voit apparaître les premières fibres).
Ensuite, si les conditions de milieu sont toujours favorables, les protoplastes entrent en mitose
et donnent ainsi des microcolonies qui deviennent des microcals, puis des cals. Les premières
divisions apparaissent entre le 3e et le 5e jour de culture. Outre la nature du milieu, la densité
de mise en culture joue un rôle important pour l'obtention d'un taux de divisions correct (30 à
80 000 protoplastes par ml, et généralement plus pour les monocotylédones).

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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Les petites colonies sont visibles, à l'œil nu, après une quarantaine de jours. La totipotence
peut être maintenue dans ces cals issus de protoplastes et s'exprime dans un milieu de
régénération approprié où le cal donne des formations méristématiques qui se développent en
jeunes plantes, ou, dans des cas plus favorables, en embryons somatiques qui donneront des
plantules. Chez certaines espèces, dont le nombre s'accroît sans cesse, on sait donc boucler le
cycle plante — protoplastes — plantes.

Les pourcentages de régénération de plantes sont généralement faibles, comparés au très


grand nombre de protoplastes obtenus dans une opération : ils sont le produit de l'efficacité
d'étalement (probabilité pour un protoplaste de donner un cal) par le nombre moyen de plantes
régénérées par cal (fréquence de régénération). Même dans de bonnes conditions opératoires
et avec un matériel végétal favorable, le cycle plante — protoplastes — jeunes plantes est
relativement long (quelques mois).

b- La fusion

On appelle «fusion» l'agrégation de deux, ou plusieurs, protoplastes. L'intérêt du passage de


la cellule isolée par le stade protoplaste réside dans l'accessibilité de cette dernière structure.
Généralement, les protoplastes se repoussent à cause de leurs charges électrostatiques
négatives. Cette charge est due en majorité aux groupes phosphates et pour une part plus
faible à des protéines. L'accolement des protoplastes, étape préalable indispensable pour la
fusion, doit donc être provoquée par l'expérimentateur.

Des agents chimiques, comme le calcium ou des substances «surface-actives» non ionisées,
comme le polyethylene glycol (PEG), sont dans ce but assez efficace. Une fois les
protoplastes accolés, la dilution de ces substances induit des perturbations membranaires
provoquant alors la fusion. Les taux de fusion ainsi obtenus varient entre 0% et 5% environ.
Mais, depuis ces dernières années, on a pu faciliter l'agrégation des protoplastes en pratiquant
l'électrofusion. Cette technique consiste à placer sur la solution de protoplastes dans la boîte
de Pétri un système multi-électrodes (14 électrodes écartées de 2 mm) relié à un générateur de
courant sinusoïdal de haute fréquence couplé avec un second générateur d'impulsion de
courant carré. Lorsqu'on applique le champ électrique (125 V/cm, 1MHz) induit par le
courant sinusoïdal, les protoplastes se comportent comme des dipôles et s'alignent en suivant
les lignes de champs, assurant ainsi leur contact intime. La fusion a alors lieu dans un
deuxième temps où l'on envoie des impulsions très courtes (20 à 30) d'un courant carré de 1,3

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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KV/cm. La fusion peut être observée sous microscope inversé, donnant une estimation des
taux de fusion réalisés. La suspension des protoplastes fusionnés est alors reprise par dilution
progressive dans un milieu de culture, comme pour les fusions provoquées par voie chimique.
Cette technique permet d'obtenir des taux de fusion de l'ordre de 80%. La fusion se produit
d'une manière aléatoire, due aux relations de voisinage des protoplastes et à la neutralisation
de leurs charges ; leur volume intervient donc vraisemblablement. Si le mélange contient en
quantité égale deux espèces différentes A et B et si l'on admet, de manière théorique, que les
divers types de fusion sont équiprobables, on doit observer : un quart d'autofusions AA, une
moitié d'hétérofusions AB et un quart d'autofusions BB (dans cette estimation nous ne tenons
pas compte des fusions multiples, qui en général sont assez rares, ni des fusions partielles).
Lors de l'accolement de deux protoplastes, l'ensemble du contenu cellulaire est mis en
commun : on peut donc aboutir à l'addition totale des trois compartiments héréditaires :
nucléaire, mitochondrial et chloroplastique. Cette addition totale accroît le niveau de ploïdie
de l'unité résultante. Mais deux phénomènes viennent perturber le déroulement sans accident
de l'agrégation :

— d'une part, les échanges ne sont pas toujours totaux : on peut aboutir à une addition
incomplète et à un microplaste résiduel ;

— dès la fusion réalisée, des compétitions et des éliminations se mettent en place. Par
exemple, à chaque mitose subséquente il se peut que certaines paires chromosomiques soient
rejetées et ne participent plus aux noyaux télophasiques. Cette éviction chromosomique peut
aller jusqu'à l'élimination totale de l'un des deux noyaux parentaux.

Pour le compartiment mitochondrial, les phénomènes sont encore plus complexes, car ils
comportent des compétitions entre les vitesses de réplication et des auto- et hétéro-
recombinaisons en des sites privilégiés. On peut donc trouver des populations contenant tous
les dosages intermédiaires entre l'addition totale et l'absence de l'un des types. Chez les
chloroplastes, les règles paraissent plus strictes puisque généralement l'un des types parentaux
élimine totalement l'autre : il ne subsiste donc qu'une seule population d'ADN chloroplastique.
Lorsque les noyaux se sont additionnés partiellement ou en totalité, on parle d'hybride
somatique ; s'il ne subsiste que l'un des noyaux parentaux avec un cytoplasme composite et/ou
recombiné, on parle de «cybrides» (cytoplasme hybride). Bien qu'il apparaisse des formes
majoritaires, on voit bien qu'une même opération de fusion produit tout un spectre de
structures génétiques entre lesquelles il est parfois difficile de se retrouver.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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IV.2. 2. Haplo-méthodes (Androgenèse et gynogenèse)

Les haploïdes ont toujours suscité un très vif intérêt des sélectionneurs, pour la claire lisibilité
de leur génome, mais surtout parce qu'ils sont la source d'homozygotes parfaits puisqu'on sait
autodoubler leur stock haploïde de chromosomes. Depuis longtemps on est capable d'obtenir
des plantes haploïdes à très faible fréquence à la suite de polyembryonie ou plus simplement
de graines à embryons doubles. On sait aussi obtenir des descendances haploïdes à partir
d'hybridations interspécifiques suivies de cultures in vitro des jeunes embryons ainsi induits.
Mais il y a une trentaine d'années, pour la première fois étaient régénérées des plantes à partir
de culture in vitro de microspores ayant donc un stock haploïde de chromosomes chez le
tabac. Cette voie d'obtention volontaire de plantes haploïdes s'est vite étendue à d'autres
espèces, puis on a diversifié les méthodes. A l'androgenèse (régénération de plantes in vitro à
partir de culture de microspores) s'est ajoutée la gynogenèse obtenue à la suite de culture
d'ovules non fécondés ; puis, plus récemment, des apomixies provoquées par irradiations, soit
du gamétophyte mâle, soit du gamétophyte femelle, ont aussi été sources d'individus
haploïdes.

IV.2.2.1. Les haploïdes doublés

Les plantes obtenues par les diverses techniques sont issues, en principe, d'une cellule
haploïde : ce sont donc en fait des «plantes sans mère» (androgenèse) ou des «plantes sans
père» (gynogenèse). Cependant, dans de nombreux cas, l'individu régénéré est diploïde ou
même parfois polyploïde (pétunia, asperge, par exemple) ; c'est que l'état haploïde est instable
et que lors des mitoses haploïdes la télophase ne se déroule pas normalement. On a donc une
endomitose et un retour à l'état 2n. De toute manière, la plante haploïde est stérile dans la
majorité des cas où l'individu de départ était un véritable diploïde (lorsque l'individu de départ
est tétraploïde, on appelle «dihaploïde» la structure 2n = 2x obtenue après haploïdisation).
Utilisation des haploïdes doublés Pour utiliser une plante régénérée par l'une quelconque des
voies d'haploïdisation, il faut donc la rendre fertile et provoquer artificiellement un
doublement des chromosomes si celui-ci n'a pas été spontané. Par des traitements qui inhibent
l'alignement des microtubules du fuseau, on provoque des endomitoses qui rétablissent le
niveau diploïde. La colchicine est l'un des agents les plus couramment employés pour obtenir
cette autocopie du stock haploïde. On récupère donc chez ces haploïdes doublés une
homozygotie totale. De telles plantes fertiles, diploïdes et homozygotes reproduites par

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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autofécondation donnent des descendants tous parfaitement semblables à la plante mère ; on a


«fixé» le type sous la forme d'une lignée pure.

Pour un sélectionneur partant d'une hybridation, l'haploïdisation dès la F1 donne, sous forme
d'individus régénérés tous différents les uns des autres, l'expression visuelle d'une ségrégation
gamétique. Avec le doublement des chromosomes, on rend fertiles Haploïdisation et stables
ces nouveaux génotypes parmi lesquels il suffit de choisir ceux qui sont les plus proches de
l'idéotype.

L’haplodiploïdisation intéresse aussi les sélectionneurs et les généticiens plus fondamentaux.


Actuellement, des progrès dans la compréhension du déterminisme génétique de caractères de
grande importance agronomique viennent de l’utilisation conjointe des haplométhodes et du
marquage moléculaire (orge, maïs, piment). Les principales limitations de
l’’haplodiploïdisation restent la difficulté et le coût de l’obtention des plantes haploïdes
doublées. De plus, certains sélectionneurs considèrent que le temps nécessaire pour fixer la
lignée lors de la sélection généalogique leur donne l’opportunité de mieux connaître les
réactions de la future variété vis à vis des stress.

IV.2. 3. Variations soma-clonales

Vitrovariants Lorsque les éléments excisés sur la plante donneuse perdent les repérages
apportés par les réseaux de signaux ou sont incapables, du fait du milieu de culture et
notamment de l'utilisation du 2-4 D, de les restructurer, des réactions épigéniques différentes
gèrent un déroulement modifié du programme génétique. Par ailleurs, les systèmes de
sauvegarde de l'intégrité génotypique sont relâchés, la réparation des mutations, l'excision des
erreurs de mitose, les contrôles du nombre de chromosomes liés aux mécanismes
d'endoduplication sont affaiblis. Il apparaît alors des copies non conformes
(morphologiquement ou physiologiquement) qu'on désigne sous le terme de phénovariants ou
vitrovariants. Cette découverte française a été diffusée par les Anglo-Saxons sous l'appellation
«variation somaclonale», mais le terme vitrovariations est plus correct.

IV.2.3.1. Variation somaclonale et sélection in vitro

Chez de nombreuses espèces, des modifications temporaires ou stables ont été décrites dans
les lignées de cellules en culture, ainsi que dans les plantes régénérées à partir de ces cellules.
L'ampleur de cette variation somaclonale diffère beaucoup suivant les espèces : elle est
remarquable chez le riz. L'utilité des mutations induites par la culture in vitro peut être accrue

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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si une sélection est exercée au niveau des cellules, de manière à réduire le nombre de plantes à
tester en laboratoire et au champ après régénération.

IV.2.4. Embryogenèse somatique

La formation d’embryon à partir de cellules somatiques normales a été obtenue en culture in


vitro chez la carotte par REINERT (1958) et STEWARD et coll. (1958) puis chez un certain
nombre d’espèces appartenant à des familles très diverses.

La formation d’un embryon ne peut donc plus être considérée comme l’apanage du zygote
issu de la fécondation. Elle ne nécessite pas non plus l’environnement particulier que
constitue l’albumen. Les embryons peuvent se développer à partir de cellules apparemment
banales, diploïdes ou même haploïdes dans le cas de (l’androgenèse).

Cependant, il arrive souvent, qu’on ne sache pas très bien si les plantules régénérées
proviennent de véritables embryons somatiques (ou embryoïdes) ou du développement
successif d’un bourgeon et de racines.

En effet, après quelques temps, les deux types de productions ne peuvent plus être distingués.
Mais l’embryoide suit le même développement qu’un embryon normal en passant par les
étapes décrite par l’embryogenèse

Le fait qu’un embryon ne soit pas nécessairement le produit de la fécondation a une portée
biologique et fondamentale considérable. L’embryogenèse somatique a illustré le concept de
la « totipotence cellulaire ». Toute cellule possède en effet dans son génome l’information
nécessaire pour reconstituer une plante entière. Mais il semble bien qu’elle ne puisse le faire
effectivement qu’à condition de n’être pas engagée trop loin dans le mécanisme de la
différenciation et d’être placée dans un environnement approprié.

L’embryogenèse somatique parait être la méthode théorique « idéale » de multiplication


végétative. Elle devrait en particulier permettre d’utiliser, dans l’avenir, les résultats éventuels
de manipulation au niveau cellulaire (mutagenèse, fusion de protoplastes….).

Deux types d’embryogenèse somatique :

Directe : s’effectue directement à partir de cellules très jeunes embryogènes.

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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Indirecte : On obtient un amas de cellules indifférenciées. De nombreuses divisions


cellulaires sont rapidement provoquées à partir des tissus cultivés grace à l’apport d’une forte
dose d’auxine : un cal.

Figure 10 : Représentation schématique de la méthode de l’obtention des plantules par


embryogenèse somatique.

IV.2.5. Sauvetage d’embryon

Sauvetage d’embryons par culture in vitro qui autrement avorteraient sur la plante mère, en
particulier dans le cas de croisements entre espèces. Ceci a permis par exemple l'obtention des
triticales, obtenus par croi- sement du blé et du seigle, largement cultivés aujour- d’hui
notamment en agriculture biologique, ou encore l’introduction de résistances à des maladies
chez la to- mate à partir d’espèces sauvages.

IV.2.6. Transfert de gènes

Les développements des connaissances sur le code génétique et la régulation de son


expression par les zones voisines du gène sur le chromosome et surtout la découverte
d'enzymes, les endonucléases de restriction, qui découpent avec précision la molécule d'ADN
ont ouvert des perspectives incommensurables au génie génétique. On peut dès maintenant
extraire, après repérage, un gène de l'ensemble du domaine vivant (du virus, de la bactérie,
jusqu'à l'homme) et le transférer sur les chromosomes de la plante qui, à partir de là, le
transmettra à ses descendants au même titre que ses propres gènes. Nous en sommes aux

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Chapitre IV. Technologie de la culture in vitro
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toutes premières réussites de l'expérimentation par les sélectionneurs de telles plantes dites
transgéniques, mais on peut prédire que les prochaines décennies exploiteront, en routine,
cette très puissante technologie. Pour l'instant, l'utilisation de résistances monofactorielles à
des molécules insecticides ou herbicides représente le champ d'application de ces transferts
moléculaires.

Mais déjà on se préoccupe de la manipulation non seulement de l'ADN codant, mais aussi des
produits de transcription (ARN messagers) ou de traduction (polypeptides) du gène. Ici
encore, des attaques post-transcriptionnelles, par voie moléculaire, vont révolutionner les
champs d'application du génie génétique.

Comme on le constate, le sélectionneur peut, par de nombreuses voies, introduire une


diversité génétique dans les génotypes qu'il a extraits des populations sources ou des
collections variétales disponibles. Dans tous les cas, cette diversité constitue, par les
ségrégations et les remaniements d'expression qu'elle entraîne, un champ de sélection dans
lequel il faut individualiser et modeler le futur prototype d'une variété nouvelle.

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