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Mesure de la croissance microbienne


Il existe plusieurs moyens de mesurer la croissance microbienne pour déterminer le temps de
génération et la vitesse de croissance. Le nombre ou la masse cellulaire de la population peut être
suivie, puisqu’ils augmentent tous deux au cours de la croissance. Les techniques les plus courantes
sont la mesure du nombre de cellule et la mesure de la masse cellulaire.

I. Mesure du nombre de cellule

La façon la plus évidente de déterminer le nombre de cellule est de les compter. L’utilisation
d’une chambre de comptage est facile, peu couteuse et relativement rapide. Elle donne des
informations quant à la taille et à la morphologie des microorganismes. Les chambres de comptage
de Petroff – Hausser permette de compter le nombre de bactéries.
Les hémocytomètres sont employés pour les microorganismes eucaryotes plus grand. Les lames
spécialement conçues ont des chambres de profondeurs dont le fond est muni d’une grille. Le
nombre de microorganisme dans un échantillon est calculé en tenant compte du volume de la
chambre et de la dilution de l’échantillon.
Cette technique présente quelques désavantages : la population microbienne doit être suffisamment
dense puisque les échantillons sont dans un petit volume. Il est difficile de distinguer les cellules
viables de celles mortes.
Les microorganismes plus grands comme les protozoaires, les algues et les levures non filamenteuse
sont comptées directement à l’aide des compteurs électroniques tel que compteur de Coulter. La
substance microbienne doit passer au travers de l’édifice. Un courant électrique circule au travers de
cet orifice. Et les électrodes doivent passer de part et d’autre de l’entrée mesure la résistance
électrique chaque fois qu’une cellule microbienne passe au travers du système. La résistance
électrique augmente (ou la conductivité diminue), ce qui permet de compter les cellules. Les
compteurs de Coulter donnent des résultats précis avec des grandes cellules et il est couramment
utilisé dans les hôpitaux pour compter le nombre de globules rouges ou blancs. Ce compteur n’est
pas adapté pour l’énumération des bactéries à cause d’interférence due à des débits particulaires, à
la formations de filaments et à d’autres problèmes
Les chambres de comptage et les compteurs électroniques permettent de compter toutes les cellules
viables ou mortes.
Il existe aussi quelques techniques pour dénombrer les cellules viables capable de se développer.
Dans la plupart des techniques un échantillon dilué de bactéries est étalé sur une surface solide et
chaque microorganisme ou bactérie se développe en une colonie distincte.
Le nombre de microorganismes viables dans l’échantillon de départ peut être calculé à partir du
nombre de colonies formées et de la dilution d’un échantillon.

Exemple : 1mL de solution diluée à un facteur 1*10^6  étalement  150 colonies. Le nombres de
colonies de départ = 150 * 1*10^6.

Remarque : le comptage est plus précis avec un compteur spécial de colonie.

Les techniques d’isolement par étalement en surface ou en profondeur permettent de déterminer le


nombre de microorganismes dans un échantillon. Elles sont simples, sensibles et largement utilisées
pour compter les bactéries ainsi que d’autre microorganisme dans la nourriture, l’eau et le sol.
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Quelques problèmes peuvent conduire à des comptages inexacts, si les amas de cellules ne sont pas
dissociés et les microorganismes bien dispersés, les comptages seront sous-évalués. Comme on n’est
pas absolument certain que chaque colonie provienne d’une cellule isolée les résultats sont souvent
exprimés en termes d’unité formatrice de colonie appeler UFC plutôt qu’en nombre de
microorganismes. Pour obtenir de meilleures résultats les échantillons doivent contenir entre 25 et
250 colonies. Le nombre de microorganisme est souvent déterminé à partir de colonies se
développant sur des filtres spéciaux à pores suffisamment petit pour ne pas laisser passer les cellules.
Dans ces techniques un échantillon est filtré sur une membrane filtrante spéciale.
Le nombre de colonie compté donne le nombre de microorganisme dans l’échantillon filtré. Un
milieu spécial permet de sélectionner un microorganisme donné. Les membranes filtrantes sont
parfois utilisées pour compter directement les bactéries. L’échantillon bactérien est mélangé à un
colorant fluorescent comme l’orange d’acridine, sont orange ou vert brillant et sont facilement
comptés au microscope à épis fluorescence. Le comptage obtenu par cette technique est plus élevé
qu’après culture.

II. Mesure de la masse cellulaire

La croissance de la population est accompagnée d’une augmentation de la masse cellulaire totale


aussi bien que du nombre de cellule. Par conséquence les techniques mesurant l’augmentation de la
masse cellulaire permettent de suivre la croissance. L’approche la plus directe est la détermination
du poids sec des microorganismes. Les cellules se développant dans un milieu liquide sont récoltées
par centrifugation, lavées, séchées et pesées.
Cette technique est surtout utilisée pour mesurer la croissance des mycètes, elle est cependant très
longue et peu sensible. A cause de leur faible poids il faut centrifuger quelques centaines de
millilitres de culture pour recueillir une quantité suffisante de bactérie. Des techniques plus sensibles
et plus rapides sont basées sur le fait que les cellules bactériennes dispersent la lumière incidente
comme dans une population bactérienne. Les cellules sont approximativement de même taille. La
quantité de lumière difracté est proportionnelle à la concentration de cellule.
Lorsque que la concentration en bactérie atteint 10 million/mL le milieu apparait légèrement trouble
et une augmentation supplémentaire de concentration, donne une plus grande troubleté. Il y a
moins de lumière transmise à travers le milieu, on utilise un spectrophotomètre à 600nm.
Un échantillon de cellule lavée est collecté à partir de d’un volume de milieu connue peut être
analyser pour son contenu en azote ou en protéine totale.

III. Le rendement de croissance et effet de l’élément nutritif limitant

Quand la croissance microbienne est limitée par la faible concentration de l’élément nutritif
essentielle. La croissance nette final ou rendement cellule, augmente avec la quantité initiale du
nutriment limitant (c’est les bases des dosages microbiologique de vitamine et d’autres facteurs de
croissance) La vitesse de croissance augment aussi avec la concentration en facteur nutritif de faon
hyperbolique. La forme de la courbe semble traduire la vitesse d’absorption des nutriments par les
protéines de transport microbienne. A un niveau de nutriment suffisamment élevé la vitesse de
croissance n’augmente pas plus d’avantage avec l’élévation de la concentration en nutriment. La
masse microbienne produite à partir de nutriment s’exprime quantitativement comme le rendement
de croissance que l’on représente par (Y), qui est la masse de microorganisme formé divisé par la
masse de substrat consommée. La valeur de Y est souvent donnée en gramme de cellule formé par
gramme de substrat ou comme le rendement de croissance molaire (Gramme de cellule par mol de
nutriment consommée.)
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C’est un indice de l’efficacité de conversion des éléments nutritif en matériel cellulaire. Les
microorganismes aérobies en milieu riche peuvent assimilées de 20-50% des sucres absorbées. En
milieu dilué quelques bactéries semblent capables d’augmenter leur efficacité jusqu’à 80% des sucres
absorbés. On a beaucoup étudié le rendement de la croissance des bactéries fermantes. Quand les
bactéries se développe dans un milieu très riche elles utilisent la fermentation des glucides
uniquement pour la production d’énergie. Alors que les autres substances tel que les AA, servent de
matière première pour la biosynthèse. L’efficacité de l’utilisation de l’ATP pendant la fermentation se
traduit par YATP = grammes de cellules formé/nombre de mol ATP produites. Bien que la valeur de Y ATP
puisse varier à la faible concentration en sucre elle est égale à environ 10,5g/mol chez la plupart des
bactéries au concentration en sucre élevé. Ainsi il apparait que les bactéries utilisent l’énergie pour
leur biosynthèse avec une efficacité relativement constante. Néanmoins la valeur mesuré Y ATP est
beaucoup plus faible que la valeur maximale théorique qui est de 32. Une grande partie de l’ATP est
consommée par le transport, le travail mécanique et probablement d’autres voies.

La culture continue des microorganismes

Jusqu’à présent des milieux fermés dans lesquelles les éléments nutritifs c=nécessaires ne sont pas
renouvelées ni les déchets éliminés. La croissance exponentielle à lieu seulement pendant quelques
générations et rapidement la phase stationnaire est atteinte. Cependant il est possible de cultivés les
microorganismes dans un système ouvert, où les conditions de cultures sont maintenues constante
par l’apport continu de nutriment et l’élimination des déchets.
C’est conditions sont réalisé en laboratoire où une population microbienne peut être maintenu
longtemps en phase exponentielle de croissance et a une concentration constante de la biomasse.
Deux types principaux de cultures continus sont généralement utilisé :
- Les chémostats :
Est construit de tel façon que le milieu stérile soit introduit dans la chambre de culture à la même
vitesse que le milieu contenant les microorganismes en est éliminé. Le milieu de culture contient un
élement nutritif essentiel en quantité limitante. Ce nutriment étant limité la vitesse de croissance est
déterminé par la vitesse à laquelle le milieu frais est ajouté dans la chambre de culture et la densité
final dépend de la concentration en nutriment limitant. La vitesse d’échange du nutriment est
exprimé sous forme de vitesse de dilution (D), c’est la vitesse à laquelle le milieu passe au travers de
la chambre de culture par rapport au volume de la cuve où f est la vitesse d’écoulement et V est le
volume du récipient. Dans ce cas D=f/V.

Exemple : Si f est de 30mL/heures et V=1000mL, D= 0,3heure -1


La densité de la population microbienne et le temps de génération sont tous deux liée à la vitesse de
dilution. Lorsque la vitesse de dilution augmente la densité de la population microbienne reste
inchangé pour une gamme large de vitesse de dilution. Le temps de génération devient plus cours
lorsque la vitesse de dilution s’élève. Le nutriment limitant sera presque toujours complément
consommée dans ces conditions d’équilibre. Un apport limité de nutriment est disponible à des
vitesses de dilution faible.
L’énergie disponible doit servir à l’entretien de la cellule et non à la croissance et à la division. Quand
le vitesse de dilution augmente la quantité de nutriment nutritif augment de même que la densité
cellulaire car l’énergie est disponible à la fois pour l’entretien de la cellule et la croissance.
La vitesse de croissance augmente quand l’énergie totale disponible dépasse l’énergie d’entretient
- Les turbidostats :
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Types de culture continu équipé d’une cellule photoélectrique afin de mesure l’absorbance ou la
turbidité dans la chambre de culture. La vitesse de culture est automatique réglé pour maintenir une
turbidité ou densité cellulaire prêt déterminer. Il diffère du chémostat de plusieurs façons. La vitesse
de dilution varie au lieu de rester constante. Il fonctionne mieux à des vitesses de dilution élevé
contrairement à l’autre.

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