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C.

Un ADN riche en paires de bases A-T est ainsi plus facile à ouvrir, et les régions d’ADN
INITIATION ET TERMINAISON riches en paires A-T sont typiquement trouvées aux origines de réplication.
DE LA REPLICATION DE L’ADN

Bien que le processus basique de l’initiation de la fourche de réplication (voir Figure


REP-1) soit le même chez les bactéries et les eucaryotes, la voie détaillée selon laquelle ce
processus est réalisé et régulé diffère entre ces deux groupes d’organismes. Nous
Nous avons pu voir comment un ensemble de protéines de réplication générait considèrerons tout d’abord le plus simple et le plus connu de ces cas, les bactéries, puis nous
rapidement et fidèlement deux double hélices filles d’ADN au travers d’un déplacement de aborderons la situation plus complexe trouvée chez les levures, les mammifères et d’autres
fourche de réplication. Comment cette machinerie de réplication est-elle d’abord assemblée ? eucaryotes.
Comment sont générées les fourches de réplication sur une molécule d’ADN double brin ?
Dans ce chapitre, nous allons voir comment est initiée la réplication de l’ADN et comment les 2. Les chromosomes bactériens ont une seule origine de réplication de l’ADN
cellules régulent ce processus pour s’assurer qu’il aura lieu en des positions adéquates sur le
chromosome mais également au moment approprié lors du cycle cellulaire. Nous allons aussi Le génome d’E. coli est porté par une molécule d’ADN circulaire unique de paires de
voir quelques uns des problèmes particuliers que la machinerie transcriptionnelle doit 4.6 x 106 nucléotides. La réplication d’ADN débute en une origine de réplication unique, et
surmonter, notamment la nécessité de répliquer les énormes molécules d’ADN des les deux fourches de réplication créées se déplacent (à environ 500-1.000 nucléotides par
chromosomes eucaryotes ou la difficulté de copier des molécules d’ADN qui sont étroitement seconde) dans des directions opposées jusqu’à ce qu’elles se rencontrent, grossièrement à mi-
liées avec les histones dans les nucléosomes. chemin sur le chromosome (Figure REP-2). Le seul point où E. coli puisse contrôler la
réplication de l’ADN est l’initiation : une fois que les fourches ont été créées à l’origine, elles
1. La synthèse d’ADN débute en des origines de réplication se déplacent à une vitesse relativement constante jusqu’à ce que la réplication soit achevée. Il
n’est donc pas surprenant que l’initiation de la réplication de l’ADN soit un processus
Comme nous l’avons déjà vu, la double hélice d’ADN est normalement très stable : les hautement régulé. Elle débute lorsque des protéines initiatrices se lient en de multiples copies
deux brins d’ADN sont fermement maintenues ensemble par un grand nombre de ponts à des sites spécifiques de l’origine de réplication, enveloppant l’ADN autour des protéines
hydrogène formés entre les bases de chaque brin. Pour être utilisée comme matrice, la double pour former un grand complexe protéines-ADN. Ce complexe se lie ensuite à une DNA
hélice doit d’abord être ouverte et les deux brins séparés pour exposer les bases non appariées. hélicase et la charge sur un ADN simple brin adjacent dont les bases auraient été exposées par
Comme nous le verrons, le processus de la réplication d’ADN est enclenché par des protéines le fait de l’assemblage du complexe initiateur protéines-ADN. La DNA primase rejoint
initiatrices particulières qui se lient à l’ADN double brin et découvrent les brins l’un de l’hélicase, formant le primosome, qui s’éloigne de l’origine de réplication et synthétise une
l’autre, cassant les ponts hydrogène entre les bases. amorce d’ARN qui débute la première chaîne d’ADN (Figure REP-3). Cela entraîne
rapidement l’assemblage des autres protéines pour créer deux fourches de réplication, les
Les positions où la double hélice d’ADN est en premier ouverte s’appellent origines complexes protéiques s’éloignant de l’origine dans des directions opposées. Ces machineries
de réplication (Figure REP-1). Dans des cellules simples, comme celles des bactéries ou des protéiques continuent de synthétiser de l’ADN jusqu’à ce que la matrice d’ADN en arrière de
levures, les origines sont déterminées par des séquences d’ADN qui ont plusieurs centaines de chaque fourche ait été répliqué.
paires de nucléotides. Cet ADN renferme de courtes séquences qui attirent les protéines
initiatrices, mais aussi des stretchs d’ADN particulièrement faciles à ouvrir. Nous avons ainsi Chez E. coli, l’interaction de la protéine initiatrice avec l’origine de réplication est
pu voir qu’une paire de base A-T contient moins de ponts hydrogène qu’une paire de base G- soigneusement régulée, l’initiation ne survenant que lorsque suffisamment de composants

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soient disponibles pour permettre à la bactérie de réaliser un cycle entier de réplication. Le une telle molécule d’ADN d’un bout à l’autre en utilisant une fourche de réplication unique se
contrôle ne se fait pas uniquement au niveau de l’activité de la protéine initiatrice, mais une déplaçant à une vitesse de 50 nucléotides par seconde, serait d’environ 800 heures. De plus,
origine de réplication qui aura tout juste été utilisée passe aussi par une “période réfractaire” les expériences d’autoradiographie décrites ci-dessus ont révélé que plusieurs fourches se
causée par un retard dans la méthylation des nucléotides A nouvellement synthétisés. déplacent simultanément sur chaque chromosome eucaryote. Egalement, plusieurs fourches
L’initiation ultérieure de réplication est bloquée jusqu’à ce que ces A soient méthylés (Figure sont trouvées ensemble dans une même région d’ADN, alors que d’autres régions du même
REP-4). chromosome n’en ont aucune.

3. Les chromosomes eucaryotes renferment de multiples origines de réplication D’autres expériences de ce type ont montré que : (1) les origines de réplication tendent
à être activées sous forme de clusters, appelés unités de réplication, d’environ 20-80 origines
Nous avons pu voir comment deux fourches de réplication débutent en une origine de (2) de nouvelles unités de réplication semblent être activées à différents temps durant le cycle
réplication unique chez les bactéries et se déplacent dans des directions opposées, s’éloignant cellulaire jusqu’à ce que l’ADN soit entièrement répliqué (3) au sein d’une unité de
de l’origine jusqu’à ce que l’ADN contenu dans le chromosome circulaire unique ait été en réplication, les origines individuelles sont espacées les unes des autres de 30.000-300.000
totalité répliqué. Le génome bactérien est suffisamment petit pour que ces deux fourches de paires nucléotidiques (4) comme chez les bactéries, les fourches de réplication sont formées
réplication dupliquent le génome en environ 40 minutes. Cependant, en raison de la taille par paires, et créent une bulle de réplication lorsqu’elles s’éloignent dans des directions
beaucoup plus grande de la plupart des chromosomes eucaryotes, une stratégie différente est opposées à partir d’un point commun à l’origine, ne s’arrêtant que lorsqu’elles rencontrent
nécessaire pour permettre leur réplication dans le même ordre de temps. une fourche de réplication se déplaçant dans la direction opposée (ou lorsqu’elles atteignent
l’extrémité du chromosome). De cette façon, plusieurs fourches de réplication peuvent agir
Une approche a été développée dans les années 60 pour déterminer le modèle général indépendamment sur chaque chromosome et ainsi former deux hélices filles complètes
de la réplication des chromosomes eucaryotes. En effet, des cellules humaines en culture sont d’ADN.
marquées pendant une courte période avec de la 3H-thymidine de telle façon que l’ADN
synthétisé pendant cette période devienne hautement radioactif. Les cellules sont ensuite 4. La réplication de l’ADN ne survient que lors d’une seule phase du cycle cellulaire
délicatement lysées et l’ADN étalé sur la surface d’une lame recouverte d’une émulsion chez les eucaryotes
photographique. Le développement de l’émulsion révèle alors le profil d’ADN marqué. Le
temps imparti pour le marquage radioactif est choisi pour permettre à chaque fourche de En raison de leur croissance rapide, les bactéries répliquent leur ADN
réplication de se déplacer de plusieurs micromètres le long de l’ADN, de manière à ce que continuellement, et elles peuvent ainsi entamer un nouveau cycle avant que le précédent ne
l’ADN répliqué puisse être détecté sous microscope sous forme de grains. De cette façon, le soit achevé. De manière contrastée, la réplication d’ADN pour la plupart des cellules
taux et la direction du déplacement de la fourche de réplication peuvent être déterminé eucaryotes ne survient que durant une phase spécifique du cycle de division cellulaire,
(Figure REP-5). Ainsi, il a pu être estimé que les fourches de réplication se déplacent à appelée phase de synthèse d’ADN ou phase S (Figure REP-6). Pour une cellule de
environ 50 nucléotides par seconde, ce qui est approximativement le 10 fois moins rapide que mammifère, la phase S dure généralement à peu près 8 heures; pour les cellules eucaryotes
ce qui est observé lors de la réplication bactérienne, reflétant probablement l’importante plus simples, telles que les levures, la phase S peut durer aussi peu que 40 minutes. A la fin de
difficulté de répliquer de l’ADN qui est étroitement empaquetté en chromatine. la phase S, chaque chromosome a été répliqué pour produire deux copies complètes, qui
demeurent jointes ensemble au niveau de leurs centromères jusqu’à la phase M (M pour
Un chromosome humain de taille moyenne contient une molécule d’ADN linéaire mitose) qui suit juste après.
unique d’environ 150 millions de paires nucléotidiques. Le temps nécessaire pour répliquer

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5. Des régions différentes sur le même chromosome se répliquent à des temps la synthèse d’ARN. L’hétérochromatine tend à être répliquée très tard durant la phase S,
distincts durant la phase S suggérant que le timing de la réplication est relié à l’empaquettage de l’ADN en chromatine.
Cette hypothèse est appuyé par l’observation des deux chromosomes X présents dans les
Dans les cellules de mammifères, la réplication de l’ADN dans la région séparant une cellules de mammifère femelles. En effet, bien que ces deux chromosomes renferment
origine de réplication et la suivante nécessiterait en principe seulement une heure pour se essentiellement les mêmes séquences d’ADN, l’un est actif du point de vue transcriptionnel
faire, sur la base de la vitesse à laquelle se déplace une fourche de réplication et compte tenu alors que l’autre ne l’est pas. Presque la totalité du chromosome X inactif est condensé en
des plus grands écarts mesurés entre deux origines de réplication au sein d’une unité de hétérochromatine, et son ADN se réplique tard dans la phase S. Son homologue actif est
réplication. La phase S durant à peu près 8 heures dans les cellules de mammifères, cela moins condensé et se réplique tout au long de la phase S.
implique que les origines de réplication ne sont pas toutes activées simultanément et que, au
sein de chaque unité de réplication, l’ADN n’est répliqué que pendant un petit intervalle de Ces découvertes suggèrent que ces régions du génome où la chromatine est moins
temps au cours de la phase S. condensée, et ainsi plus accessibles à la machinerie de réplication, sont répliquées en premier.

6. Est-ce que les différentes unités de réplication sont activées aléatoirement, ou Le taux de condensation du chromosome semblerait également influer sur le moment
alors est-ce que les différentes régions du génome sont répliquées selon un ordre d’initiation des fourches de réplication, plutôt que sur leur vitesse.
spécifique ?
La relation entre structure de la chromatine et timing de la réplication de l’ADN est
Un moyen de répondre à cette question est d’utiliser un analogue de la thymidine, le également appuyé par des études dans lesquelles les temps de réplication de gènes spécifiques
bromodéoxyuridine (BrdU), pour marquer l’ADN nouvellement synthétisé dans des ont été mesurés. Les résultats montrent que, par exemple, les “housekeeping” gènes
populations cellulaires synchrones, en le rajoutant pendant de courtes périodes différentes tout (littéralement “gènes de ménage” ou “gènes domestiques”), qui sont les gènes actifs dans
au long de la phase S. Plus tard, pendant la phase M, ces régions des chromosomes mitotiques toutes les cellules, se répliquent très précocement durant la phase S, et ce dans toutes les
qui ont incorporé du BrdU dans leur ADN pourraient être reconnues grâce à leurs propriétés cellules testées. Par contraste, les gènes qui ne sont actifs que dans quelques types cellulaires
de coloration altérées ou par le biais d’anticorps anti-BrdU. Les résultats montrent que se répliquent généralement précocement dans les cellules où ces gènes sont actifs, mais plus
différentes régions de chaque chromosome sont répliquées selon un ordre reproductible tard dans les autres types de cellules.
durant la phase S (Figure REP-7). De plus, le timing de réplication est coordonné sur de
grandes régions du chromosome. La relation entre structure de la chromatine et timing de la réplication a été testée
directement chez la levure S. cerevisiae. Dans un cas, une origine qui fonctionnait
7. La chromatine hautement condensée se réplique tardivement, alors que les gènes tardivement durant la phase S, et qui se situait dans une région transcriptionnellement
se trouvant dans la chromatine moins condensée ont tendance à être répliqués silencieuse du chromosome de levure, a été expérimentalement re-localisé dans une région
précocement transcriptionnellement active. Après re-localisation, l’origine fonctionnait précocement durant
la phase S, montrant que le moment où cette origine était activée est déterminé par sa
Il semblerait que l’ordre d’activation des origines de réplication dépend, en partie, de localisation sur le chromosome. Cependant, des études sur des origines de réplication
la structure de la chromatine dans laquelle ces origines se trouvent. L’hétérochromatine est un additionnelles chez la levure ont également montré l’existence d’autres origines à initiation de
état condensé particulier de la chromatine, tandis que la chromatine transcriptionnellement réplication tardive, même lorsqu’elles sont présentes dans de la chromatine normale. Le
active a une conformation moins condensée, qui est apparemment nécessaire pour permettre

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moment d’utilisation d’une origine peut ainsi être déterminé par la structure de la chromatine, 9. Un grand complexe multi-sous-unitaire se lie aux origines de réplication
mais aussi par sa séquence nucléotidique. eucaryotes

8. Des séquences d’ADN bien définies servent d’origines de réplication chez Chacune des origines de réplication de la levure S. cerevisiae contient un site de
l’eucaryote simple qu’est la levure liaison pour une grosse protéine initiatrice multi-sous-unitaire appelée ORC (pour Origin
Recognition Complex), ainsi que plusieurs sites de liaison auxiliaires pour des protéines qui
Après avoir vu qu’un chromosome eucaryote est répliqué en utilisant plusieurs contribuent à attirer ORC en ce site d’origine (Figure REP-9).
origines de réplication, chacune d’elles “s’allumant” à un moment caractéristique durant la
phase S du cycle cellulaire, se pose alors la question de savoir la nature de ces origines de La réplication d’ADN chez les eucaryotes ne survenant que durant la phase S,
réplication. Nous avons ainsi déjà pu voir que les origines de réplication avaient été comment est-elle déclenché ? et comment le mécanisme garantit-il qu’une origine de
précisément définies chez les bactéries comme des séquences d’ADN spécifiques qui réplication n’est utilisée qu’une seule fois durant le cycle cellulaire ?
permettent à la machinerie de réplication de l’ADN de se lier à la double hélice d’ADN, de
former une bulle de réplication, et de se déplacer dans des directions opposées pour créer des L’interaction d’ORC à l’origine de réplication est stable et sert à marquer une origine
fourches de réplication. Par analogie, on s’attendrait alors à ce que les origines de réplication de réplication tout au long du cycle cellulaire en entier. Un complexe protéique pré-réplicatif
dans les chromosomes eucaryotes soient aussi des séquences d’ADN spécifiques. est assemblé sur chaque ORC pendant la phase G1, renfermant une DNA hélicase
hexamérique et un “facteur qui charge l’hélicase” (les protéines Mcm et Cdc6,
La recherche d’origines de réplication dans les chromosomes des cellules eucaryotes respectivement). La phase S est déclenchée lorsqu’une protéine kinase est activée, permettant
ont été les plus fructueuses chez la levure S. cerevisiae. La localisation de chaque origine de l’assemblage du reste de la machinerie de réplication et laissant l’hélicase Mcm commencer
réplication sur chaque chromosome a pu être déterminée (Figure REP-8). Le chromosome son déplacement avec chacune des deux fourches de réplication générées à l’origine.
illustré dans cette figure, chromosome III, est plus de 100 fois plus petit qu’un chromosome Simultanément, la protéine kinase qui déclenche la phase S empêche tout assemblage
humain typique. Ses origines sont espacées en moyenne d’environ 30.000 nucléotides. Cette ultérieur de la protéine Mcm en complexes pré-réplicatifs, jusqu’à ce que cette kinase soit
densité d’origines permettrait à ce chromosome de levure d’être répliqué en environ 8 inactivée à la prochaine phase M pour re-initialiser le cycle entier.
minutes.
10. Les séquences d’ADN qui spécifient l’initiation de la réplication chez les
Des délétions de sets différents d’origines de réplication sur le chromosome III de S. mammifères
cerevisiae ont été réalisées. Les résultats ont montré que la délétion de quelques origines avait
peu d’effet, car les fourches de réplication qui débutent en des origines de réplication voisines Comparativement à la levure, les séquences d’ADN qui spécifient les origines de
peuvent continuer à se déplacer dans les régions délétées de leurs propres origines. réplication chez d’autres eucaryotes ont été plus difficiles à définir. Chez l’homme, par
Cependant, comme plusieurs origines de réplication sont délétées de ce chromosome, il est exemple, les séquences d’ADN nécessaires pour la fonction d’origine adéquate peuvent
graduellement perdu lorsque les cellules se divisent, probablement car il est trop lentement s’étendre sur de très grandes distances.
répliqué.
Cependant, récemment, il a pu être possible d’identifier des séquences d’ADN
humaines spécifiques, chacune de plusieurs milliers de paires de nucléotides, qui servent
d’origines de réplication. Ces origines continuent à fonctionner en temps que telles

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lorsqu’elles sont expérimentalement déplacées vers une région chromosomique différente, le taux d’ARNm codant les histones augmente de cinquante fois, suite à une augmentation du
pour autant qu’elles soient placées dans une région où la chromatine est relativement non taux de transcription et aussi à une diminution du taux de dégradation des ARNm. Par un
condensée. L’une de ces origines est la séquence du cluster du gène de la béta-globine. En sa mécanisme qui dépend des propriétés particulières de leurs extrémités 3’, la majorité des
position normale dans le génome, la fonction de cette origine dépend de séquences distantes ARNm codant les histones deviennent hautement instables et sont dégradés en quelques
d’ADN (Figure REP-10) qui auraient un effet décondensant sur la structure de la chromatine minutes lorsque la synthèse d’ADN s’arrête en fin de phase S. Par contre, les protéines
qui entoure l’origine et qui inclut le gène de la béta-globine; la conformation de chromatine la histones elles-mêmes sont remarquablement stables et peuvent demeurer pendant toute la
plus ouverte qui en résulte est apparemment nécessaire pour que l’origine fonctionne, mais durée de la vie d’une cellule. L’étroite liaison entre la synthèse d’ADN et la synthèse
également pour que le gène de la béta-globine s’exprime. d’histones dépend probablement d’un mécanisme réactionnel qui contrôle le taux d’histones
libres pour s’assurer que la quantité d’histones fabriquées corresponde excactement à la
Un complexe ORC humain homologue à celui des cellules de levure est nécessaire pour quantité d’ADN nouvellement synthétisé.
l’initiation de la réplication et les protéines humaines Cdc6 et Mcm ont aussi un rôle central
dans le processus d’initiation. Il semble ainsi probable que les mécanismes d’initiation chez la Lorsque la fourche de réplication avance, elle doit d’une façon ou d’une autre passer
levure et l’homme soient très similaires. Cependant, les sites de liaison pour la protéine ORC au travers des nucléosomes parentaux. Des études in vitro ont montré que l’appareillage de
semblent être moins spécifiques chez l’homme que chez la levure, ce qui pourrait expliquer le réplication a une capacité intrinsèque de passer à travers les nucléosomes parentaux sans les
fait que les origines de réplication chez l’homme soient plus longues et moins nettement déplacer de l’ADN. Les protéines re-organisatrices de la chromatine, qui déstabilisent
définies que celles chez la levure. l’interface ADN-histones, facilitent probablement ce processus dans la cellule.

11. Les nouveaux nucléosomes sont assemblés au niveau de la fourche de réplication Chacune des deux hélices d’ADN néo-synthétisées au niveau d’une fourche de
réplication hérite d’anciennes histones (Figure REP-11). Mais étant donné que la quantité
Les chromosomes eucaryotes sont composés d’un mélange d’ADN et de protéines, d’ADN a doublé, une quantité égale de nouvelles histones est aussi nécessaire pour assurer
appelé chromatine. Par conséquent, la duplication des chromosomes ne nécessite pas l’empaquettage de l’ADN en chromatine. L’addition de nouvelles histones à l’ADN néo-
seulement que l’ADN soit répliqué, mais également que de nouvelles protéines synthétisé est facilitée par des “chromatin assembly factors” (CAFs) (ou facteurs
chromosomiques soient assemblées autour de l’ADN, et ce après le passage de chaque d’assemblage en chromatine), qui sont des protéines s’associant aux fourches de réplication et
fourche de réplication. Bien que l’on soit loin de comprendre ce processus en détails, on empaquettant l’ADN nouvellement synthétisé dès qu’il émerge de la machinerie de
commence à savoir comment le nucléosome, unité fondamentale de l’empaquettage de la réplication. Les histones H3 et H4 nouvellement synthétisées sont rapidement acétylées au
chromatine, est dupliqué. Une grande quantité de nouvelles protéines histones, de masse niveau de leurs extrémités N-terminales. Après qu’elles aient été incorporées dans la
approximativement égale à celle l’ADN nouvellement synthétisé, est nécessaire pour chromatine, ces groupes acétyls sont retirés des histones par réaction enzymatique (Figure
assembler les nouveaux nucléosomes à chaque cycle cellulaire. Pour cette raison, la plupart REP-12).
des organismes eucaryotes possèdent de multiples copies du gène de chaque histone. Les
cellules des vertébrés, par exemple, possèdent environ 20 sets répétés des gènes, la plupart de 12. La telomérase réplique les extrémités des chromosomes
ces sets contenant les gènes codant toutes les cinq histones (H1, H2A, H2B, H3, et H4).
Comme nous l’avons déjà vu, sachant que les DNA polymérases ne polymérisent
Contrairement à la plupart des protéines, qui sont fabriquées continuellement tout au l’ADN que dans le sens 5’ > 3’, la fabrication du brin à synthèse discontinue au niveau d’une
long de l’interphase, les histones sont principalement synthétisées durant la phase S, lorsque fourche de réplication doit se dérouler de manière discontinue par le biais d’un mécanisme qui

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produit de courts fragments d’ADN. Ce mécanisme rencontre un problème particulier lorsque 13. La longueur des telomères est sous la régulation des cellules et des organismes
la fourche de réplication atteint l’extrémité d’un chromosome linéaire : il n’y a plus de place
pour produire l’amorce ARN nécessaire pour débuter le dernier fragment d’Okazaki à la Etant donné que les processus qui allongent et rétrécissent chaque séquence
pointe d’une molécule d’ADN linéaire. telomérique sont seulement équilibrés de manière approximative, une extrémité de
chromosome contient un nombre variable de répétitions telomériques. Des expériences ont
Les bactéries résolvent ce problème de “fin de réplication” en possédant des molécules montré que les cellules qui prolifèrent indéfiniment (telles que les cellules de levure)
d’ADN circulaires (voir Figure REP-2). Les eucaryotes y trouvent une solution par une voie possèdent des mécanismes homéostatiques qui maintiennent le nombre de ces répétitions dans
ingénieuse : ils possèdent des séquences nucléotidiques particulières aux extrémités de leurs une limite de variations.
chromosomes, constituées en telomères et attirant une enzyme appelé telomérase. Les
séquences d’ADN telomériques sont similaires chez des organismes aussi divers que les Dans les cellules somatiques humaines, on pense que les répétitions telomériques
protozoaires, les fungi, les plantes, que les mammifères. Elles consistent en plusieurs fournissent à chaque cellule un sorte de mécanisme de comptage qui aiderait à éviter la
répétitions en tandem d’une courte séquence renfermant un bloc de nucléotides G adjacents. prolifération illimitée de cellules anarchiques dans les tissus adultes. Partant de cette
Chez l’homme, cette séquence est GGGTTA et s’étend sur environ 10.000 nucléotides. hypothèse, nos cellules somatiques auraient à l’origine un complément entier de répétitions
telomériques. Cependant, l’enzyme telomérase n’est pas active dans un tissu tel que la peau,
La telomérase reconnaît la pointe d’un brin riche en G d’une séquence telomérique de telle façon que chaque fois qu’une cellule se divise, elle perd 50-100 nucléotides de chacun
existante et assure son élongation dans le sens 5’ > 3’. Elle synthétise une nouvelle copie de la de ses telomères. Après plusieurs générations cellulaires, les cellules descendantes hériteraient
répétition, en utilisant une matrice ARN qui est un composant de l’enzyme elle-même. La de chromosomes défectifs (puisque leurs pointes ne pourront pas être entièrement répliquées)
telomérase ressemble aux autres reverse transcriptases, ces enzymes qui synthétisent de et se retireraient ainsi de manière permanente du cycle cellulaire et cesseraient de se diviser
l’ADN en utilisant une matrice d’ARN (Figure REP-13). L’enzyme contient ainsi toute (processus appelé “sénescence cellulaire réplicative”). En théorie, un tel mécanisme
l’information nécessaire pour maintenir les séquences télomériques caractéristiques. Après apporterait une sauvegarde contre la prolifération désorganisée des cellules anormales dans
plusieurs cycles d’extension du brin parental d’ADN par la telomérase, la réplication du brin à les tissus somatiques, nous protégeant ainsi des cancers.
synthèse discontinue à l’extrémité du chromosome peut être terminée en utilisant ces
extensions comme matrices pour la synthèse du brin complémentaire par une molécule de L’idée que la longueur des telomères agisse comme un compteur des divisions
DNA polymérase (Figure REP-14). cellulaires, contrôlant ainsi la durée de vie de la cellule, a été testée de plusieurs manières.
Pour certaines types de cellules humaines en culture, les résultats expérimentaux appuient une
Ce mécanisme fait que l’extrémité 3’ de l’ADN à chaque telomère est toujours telle théorie. Les fibroblastes humains prolifèrent normalement pendant environ 60 divisions
légèrement plus longue que l’extrémité 5’ qui lui est appariée, laissant une extrémité simple cellulaires en culture, avant de subir une sénescence réplicative. Comme la plupart des autres
brin saillante (voir Figure REP-14). Assistée par des protéines particulières, cette extrémité cellules somatiques humaines, les fibroblastes ne produisent pas de telomérase et leurs
saillante formerait une boucle pour se replier à l’intérieur de l’ADN duplex de la séquence telomères se raccourcissent graduellement à chaque fois qu’ils se divisent. Lorsque la
répétée telomérique (Figure REP-15). Ainsi, l’extrémité normale d’un chromosome possède telomérase est rajoutée aux fibroblastes en insérant un gène actif codant pour la telomérase, la
une structure unique qui le protège d’enzymes de dégradation et le différencie nettement des longueur des telomères est conservée et plusieurs des cellules continuent à proliférer
extrémités de molécules d’ADNs cassées que la cellule répare rapidement. indéfiniment. Il semble ainsi que le raccourcissement des telomères peut compter les divisions
cellulaires et provoquer la sénescence réplicative dans les cellules humaines.

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Il a également été proposé que ce type de contrôle de la prolifération cellulaire serait Figure REP-1. A replication bubble formed by replication fork initiation. This diagram
outlines the major steps involved in the initiation of replication forks at replication origins.
important pour la maintenance de l’architecture tissulaire et qu’il serait aussi d’une certaine
The structure formed at the last step, in which both strands of the parental DNA helix have
manière responsable du vieillissement des animaux, comme nous d’ailleurs. been separated from each other and serve as templates for DNA synthesis, is called a
replication bubble.

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Figure REP-2. DNA replication of a bacterial genome. It takes E. coli about 40 minutes to Figure REP-3. The proteins that initiate DNA replication in bacteria. The mechanism
duplicate its genome of 4.6 x 106 nucleotide pairs. For simplicity, no Okazaki fragments are shown was established by studies in vitro with a mixture of highly purified proteins. For E.
shown on the lagging strand. What happens as the two replication forks approach each other coli DNA replication, the major initiator protein is the dnaA protein; the primosome is
and collide at the end of the replication cycle is not well understood, although the primosome composed of the dnaB (DNA helicase) and dnaG (DNA primase) proteins. In solution, the
is disassembled as part of the process. helicase is bound by an inhibitor protein (the dnaC protein), which is activated by the initiator
proteins to load the helicase onto DNA at the replication origin and then released. This
inhibitor prevents the helicase from inappropriately entering other single-stranded stretches of
DNA in the bacterial genome. Subsequent steps result in the initiation of three more DNA
chains (see Figure REP-1) by a pathway whose details are incompletely specified.

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Figure REP-4. Methylation of the E. coli replication origin creates a refractory period Figure REP-5. The experiments that demonstrated the pattern in which replication
for DNA initiation. DNA methylation occurs at GATC sequences, 11 of which are found in forks are formed and move on eucaryotic chromosomes. The new DNA made in human
the origin of replication (spanning about 250 nucleotide pairs). About 10 minutes after cells in culture was labeled briefly with a pulse of highly radioactive thymidine (3H-
replication is initiated, the hemimethylated origins become fully methylated by a DNA thymidine). (A) In this experiment, the cells were lysed, and the DNA was stretched out on a
methylase enzyme. As discussed earlier, the lag in methylation after the replication of GATC glass slide that was subsequently covered with a photographic emulsion. After several months
sequences is also used by the E. coli mismatch proofreading system to distinguish the newly the emulsion was developed, revealing a line of silver grains over the radioactive DNA. The
synthesized DNA strand from the parental DNA strand; in that case, the relevant GATC brown DNA in this figure is shown only to help with the interpretation of the autoradiograph;
sequences are scattered throughout the chromosome. A single enzyme, the dam methylase, is the unlabeled DNA is invisible in such experiments. (B) This experiment was the same except
responsible for methylating E. coli GATC sequences. that a further incubation in unlabeled medium allowed additional DNA, with a lower level of
radioactivity, to be replicated. The pairs of dark tracks in (B) were found to have silver grains
tapering off in opposite directions, demonstrating bidirectional fork movement from a central
replication origin where a replication bubble forms (see Figure REP-1). A replication fork is
thought to stop only when it encounters a replication fork moving in the opposite direction or
when it reaches the end of the chromosome; in this way, all the DNA is eventually replicated.

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Figure REP-6. The four successive phases of a standard eucaryotic cell cycle. During the Figure REP-7. Different regions of a chromosome are replicated at different times in S
G1, S, and G2 phases, the cell grows continuously. During M phase growth stops, the nucleus phase. These light micrographs show stained mitotic chromosomes in which the replicating
divides, and the cell divides in two. DNA replication is confined to the part of interphase DNA has been differentially labeled during different defined intervals of the preceding S
known as S phase. G1 is the gap between M phase and S phase; G2 is the gap between S phase. In these experiments, cells were first grown in the presence of BrdU (a thymidine
phase and M phase. analog) and in the absence of thymidine to label the DNA uniformly. The cells were then
briefly pulsed with thymidine in the absence of BrdU during early, middle, or late S phase.
Because the DNA made during the thymidine pulse is a double helix with thymidine on one
strand and BrdU on the other, it stains more darkly than the remaining DNA (which has BrdU
on both strands) and shows up as a bright band (arrows) on these negatives. Broken lines
connect corresponding positions on the three identical copies of the chromosome shown.
(Courtesy of Elton Stubblefield.)

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Figure REP-8. The origins of DNA replication on chromosome III of the yeast S. Figure REP-9. An origin of replication in yeast. Comprising about 150 nucleotide pairs,
cerevisiae. This chromosome, one of the smallest eucaryotic chromosomes known, carries a this yeast origin has a binding site for ORC, a complex of proteins that binds to every origin
total of 180 genes. As indicated, it contains nine replication origins. of replication. The origin depicted also has binding sites (B1, B2, and B3) for other required
proteins, which can differ between various origins. Although best characterized in yeast, a
similar ORC is used to initiate DNA replication in more complex eucaryotes, including
humans.

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Figure REP-10. Deletions that inactivate an origin of replication in humans. These two Figure REP-11. A demonstration that histones remain associated with DNA after the
deletions are found separately in two individuals who suffer from thalassemia, a disorder replication fork passes. In this experiment, performed in vitro, a mixture of two different-
caused by the failure to express one or more of the genes in the béta-globin gene cluster sized circular molecules of DNA (only one of which is assembled into nucleosomes) are
shown. In both of these deletion mutants, the DNA in this region is replicated by forks that replicated with purified proteins. After a round of DNA replication, only the daughter DNA
begin at replication origins outside the béta-globin gene cluster. As explained in the text, the molecules that derived from the nucleosomal parent have inherited nucleosomes. This
deletion on the left removes DNA sequences that control the chromatin structure of the experiment also demonstrates that both newly synthesized DNA helices inherit old histones.
replication origin on the right.

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Figure REP-12. The addition of new histones to DNA behind a replication fork. The new Figure REP-13. The structure of telomerase. The telomerase is a protein–RNA complex
nucleosomes are those colored light yellow in this diagram; as indicated, some of the histones that carries an RNA template for synthesizing a repeating, G-rich telomere DNA sequence.
that form them initially have specifically acetylated lysine side chains, which are later Only the part of the telomerase protein homologous to reverse transcriptase is shown here
removed. (green). A reverse transcriptase is a special form of polymerase enzyme that uses an RNA
template to make a DNA strand; telomerase is unique in carrying its own RNA template with
it at all times. (Modified from J. Lingner and T.R. Cech, Curr. Opin. Genet. Dev. 8:226–232,
1998.)

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Figure REP-14. Telomere replication. Shown here are the reactions involved in Figure REP-15. The t-loops at the end of mammalian chromosomes. (A) Electron
synthesizing the repeating G-rich sequences that form the ends of the chromosomes micrograph of the DNA at the end of an interphase human chromosome. The chromosome
(telomeres) of diverse eucaryotic organisms. The 3’ end of the parental DNA strand is was fixed, deproteinated, and artificially thickened before viewing. The loop seen here is
extended by RNA-templated DNA synthesis; this allows the incomplete daughter DNA strand approximately 15,000 nucleotide pairs in length. (B) Model for telomere structure. The
that is paired with it to be extended in its 5’ direction. This incomplete, lagging strand is insertion of the single-stranded end into the duplex repeats to form a t-loop is carried out and
presumed to be completed by DNA polymerase, which carries a DNA primase as one of its maintained by specialized proteins, schematized in green. In addition it is possible, as shown,
subunits. The telomere sequence illustrated is that of the ciliate Tetrahymena, in which these that the chromosome end is looped once again on itself through the formation of
reactions were first discovered. The telomere repeats are GGGTTG in the ciliate heterochromatin adjacent to the t-loop. (A, from J.D. Griffith et al., Cell 97:503–514, 1999. ©
Tetrahymena, GGGTTA in humans, and G1–3A in the yeast S. cerevisiae. Elsevier.)

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