CINÉTICA REACCIONAL DA GLUCOSE OXIDASE

INTRODUÇÃO
A glucose oxidase [E.C. 1.1.3.4] é uma enzima que catalisa a oxidação da ß-D-glucose
com formação de d-gluconolactona. A enzima contém um grupo prostético, a flavina adenina
dinucleótido (FAD), que confere à proteína a capacidade para catalisar reacções de oxidação-
redução.
A reacção dá-se em dois passos, no primeiro dos quais a coenzima oxidada sofre uma
redução a FADH2, que é acompanhada pela oxidação da ß-D-glucose a d-gluconolactona. No
segundo passo a flavina reoxida-se por acção do dioxigénio, que, por sua vez, se converte em
peróxido de hidrogénio.

O acompanhamento visual desta reacção de oxidação não pode ser feito directamente
pelo facto dos reagentes (ß-D-glucose e dioxigénio) e produtos (d-gluconolactona e peróxido
de hidrogénio) serem incolores em solução aquosa. É no entanto possível seguir a reacção
indirectamente, recorrendo a uma outra reacção de oxidação-redução, catalisada por outra
enzima, em que se faz reagir o peróxido de hidrogénio com um substrato cromogénico que o
reduz. Se o redutor for o ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), que
é uma substância praticamente incolor na sua forma reduzida mas fortemente corada de verde
azulado quando oxidada, é possível relacionar directamente a velocidade de formação da cor
com a velocidade de formação do peróxido de hidrogénio, desde que o ABTS e a enzima que
catalisa esta outra reacção (peroxidase – E.C. 1.11.1.7) se encontrem em excesso na mistura
reaccional.
OBJECTIVO DO TRABALHO
O objectivo do trabalho consiste no estudo da influência da concentração da enzima, da
concentração do substrato, da natureza do substrato e da temperatura na velocidade da
reacção de oxidação da ß-D-glucose catalisada pela glucose oxidase.
REAGENTES
• Solução tampão 0,1 M de fosfato de potássio, pH 7,0
• Solução de glucose oxidase em tampão de fosfato (pH 7,0) 2 U/mL
• Solução 50 mM em ABTS e 25 U/mL em peroxidase em tampão de fosfato (pH 7,0)
• Solução aquosa 1 M de glucose
• Solução aquosa 1 M de galactose
• Solução aquosa 1 M de maltose
• Solução aquosa 1 M de frutose
• Solução aquosa 1 M de 2-desoxiglucose
MATERIAL
14 tubos de ensaio 18 x 160 mm
1 tubo de ensaio 16 x 160 mm
10 tubos de Eppendorf
banho de água a 80 ºC
banho de água e gelo (4º C)
cronómetro
espectrofotómetro
TÉCNICA
1) Preparação de soluções
Preparar as seguintes soluções nos seguintes recipientes:
Nº de tubos 18 × 160 mm Tampão de fosfato 0,1 M pH 7,0
12 10 mL + 50 µL ABTS/peroxidase à temperatura ambiente
1 Idem a 80 ºC
1 Idem a 4 ºC

Nº de tubos de Eppendorf Glucose oxidase

1 1 mL 2 U/mL a 4º C
1 100 µL 2 U/mL a 80º C
1 100 µL 0,2 U/mL a 4º C
1 100 µL 0,02 U/mL a 4º C

Nº de tubos Substrato
1 tubo 16 × 160 mm 10 mL glucose 1 M
1 tubo de Eppendorf 1 mL glucose 0,5 M
1 tubo de Eppendorf 1 mL glucose 0,05 M
1 tubo de Eppendorf 1 mL de galactose 1 M
1 tubo de Eppendorf 1 mL maltose 1 M
1 tubo de Eppendorf 1 mL frutose 1 M
1 tubo de Eppendorf 1 mL 2-desoxiglucose 1 M
As diluições das soluções de glucose oxidase e de glucose deverão ser feitas com solução
tampão 0,1 M de fosfato de potássio, pH 7,0.

2) Estudo do efeito da concentração da enzima na velocidade da reacção

a) Adicionar 500 µL da solução de glucose 1 M a cada um de três tubos de ensaio contendo
ABTS/peroxidase à temperatura ambiente.
b) Adicionar 25 µL de cada uma das três soluções de glucose oxidase com concentrações,
respectivamente, 2 U/mL, 0,2 U/mL e 0,02 U/mL a cada um dos três tubos de ensaio
preparados em a).
c) Agitar imediatamente após cada adição, observar a velocidade de aparecimento da cor e
medir a absorvância de cada solução a 414 nm, 1 minuto (use um cronómetro) após a
adição e início da agitação.

3) Estudo do efeito da concentração do substrato na velocidade da reacção

a) Adicionar 25 µL da solução de glucose oxidase 2 U/mL a cada um de três tubos de ensaio
contendo ABTS/peroxidase à temperatura ambiente.
b) Adicionar 500 µL da solução de glucose 1 M ao primeiro tubo, 500 µL da solução de
glucose 0,5 M ao segundo tubo e 500 µL da solução de glucose 0,05 M ao terceiro tubo.
c) Agitar imediatamente após cada adição, observar a velocidade de aparecimento da cor e
medir a absorvância de cada solução a 414 nm, 1 minuto (use um cronómetro) após a
adição e início da agitação.

4) Estudo do efeito da natureza do substrato na velocidade da reacção

a) Adicionar 25 µL da solução de glucose oxidase 2 U/mL a cada um de cinco tubos de
ensaio contendo ABTS/peroxidase à temperatura ambiente.
b) A cada um dos cinco tubos de ensaio preparados em a) adicionar 500 µL de cada uma das
soluções de glucose 1 M, galactose 1 M, maltose 1 M, frutose 1 M e 2-desoxiglucose 1
M, respectivamente.
c) Agitar imediatamente após cada adição, observar a velocidade de aparecimento da cor e
medir a absorvância de cada solução a 414 nm, 1 minuto (use um cronómetro) após a
adição e início da agitação.

5) Estudo do efeito da temperatura na velocidade da reacção

a) Adicionar 500 µL da solução de glucose 1 M a cada um de três tubos de ensaio contendo
ABTS/peroxidase. Um dos tubos deverá estar a 4 ºC, outro à temperatura ambiente e o
terceiro a 80 ºC.
b) Adicionar 25 µL da solução de glucose oxidase 2 U/mL a 4 ºC, à temperatura ambiente e
a 80 ºC a cada um dos três tubos à corresponedente temperatura.
c) Agitar imediatamente após cada adição, observar a velocidade de aparecimento da cor e
medir a absorvância de cada solução a 414 nm, 1 minuto (use um cronómetro) após a
adição e início da agitação.

BIBLIOGRAFIA
K. A. Johnson, J. Chem. Ed., 79, 74-76 (2002)
 CINÉTICA REACCIONAL DA GLUCOSE OXIDASE

FOLHA DE RESULTADOS

GRUPO TURMA:

DATA:

Resultados:

Preencher as seguintes tabelas respeitantes a cada série de experiências efectuadas e

tirar conclusões sobre os resultados obtidos.

u Efeito da concentração da enzima na velocidade da reacção

[GO] (U/mL) Tempo t (s) Absorvância A Vel. rA/rt(s -1)

0,02

0,2

Conclusões:
u Efeito da concentração do substrato na velocidade da reacção

[Glc] (M) Tempo t (s) Absorvância A Vel. rA/rt(s -1)

0,05

0,1

0,25

Conclusões:
u Efeito da natureza do substrato na velocidade da reacção

Substrato Tempo t (s) Absorvância A Vel. rA/rt(s -1)

Galactose

Maltose

Glucose

Frutose

Conclusões:

Assinaturas: