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Bioréacteurs et enzymes immobilisés

A) Hydrolyse du saccharose en réacteur tubulaire par de l'invertase immobilisée par

adsorption

Il est possible d'immobiliser l'invertase (β-fructosidase) de Saccharomyces cerevisiae par

adsorption sur résine échangeuse d'anions. L'adsorption est forte et la désorption très faible même après
de nombreuses heures d'utilisation en réacteur tubulaire (Packed Bed Reactor, PBR).
Travail à réaliser :
Immobiliser de l'invertase sur billes poreuses à matrice styrène-divinylbenzène macroréticulé et
groupement actif échangeur d'anions. Mesurer le rendement de l'immobilisation. Les modes opératoires
sont présentés en annexe 1.
Construire un petit réacteur tubulaire à invertase immobilisée selon les instructions fournies dans le
document annexe 2. Faire fonctionner le réacteur jusqu'à obtention d'un régime stationnaire qui sera
précisément décrit grâce à l'analyse de l'effluent de sortie. (voir aussi le document annexe 2).
Dans le compte-rendu, prendre soin de justifier tous les calculs réalisés.

B) Traitement d’un lactosérum par de la b-galactosidase coréticulée avec de l'ovalbumine et

co-incluse en billes d'alginate avec des levures Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae ne catabolise pas le lactose. Cependant le lactosérum peut être traité par
des levures incluses dans des billes d'alginate en présence d'une préparation de b-galactosidase coréticulée
avec de l'ovalbumine. La coréticulation de la b-galactosidase avec l'ovalbumine permet d'obtenir des
dimensions évitant la fuite de l'enzyme hors du gel et la stabilisation de l'enzyme.
Réaliser la coréticulation de la ß-galactosidase et de l'ovalbumine puis la co-inclusion avec des
levures (annexe 1).
Réaliser le montage présenté dans l'annexe 2. Suivre l'activité fermentaire pendant 5 heures par
mesure du volume du dioxyde de carbone produit.

Compte-rendu :
Présenter et discuter les résultats.
Présenter la chimie de la réaction de coréticulation.

Document annexe 1
Immobilisation d'invertase sur résines amberlite™ échangeuse d'anions

Deux résines sont proposées.

IRA 96 IRA410

limit 100 °C max. temp. 40°C - 70°C max. temp

(selon l'environnement ionique ??)

moisture ~60% ~42%

matrix styrene-divinylbenzene styrene-divinylbenzene (gel)

(macroreticular)

matrix active group polyamine functional group benzyldimethyl(2-hydroxyethyl)ammonium

functional group quaternary ammonium

operating pH 0-7 0 - 14

capacity 1.25 meq/mL by wetted bed volume 1.4 meq/mL by wetted bed volume

4.7 meq/g by dry weight 3.4 meq/g by dry weight
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particle size 16-50 mesh (Wet mesh) 20-50 mesh (Wet mesh)

Mode opératoire d'immobilisation

– 2,5 g de résine équilibrée en tampon acétate de sodium 0,01 mol/L pH 4,5. Reprise et séchage doux
(24 heures à température du laboratoire).
– 5 mL de solution d'invertase à 1000 U/mL en tampon acétate de sodium 0,01 mol/L pH 4,5.
Invertase Unit Definition : One unit will hydrolyze 1.0 μmole of sucrose to invert sugar per min at pH 4.5 at 55°C.
– Remettre en suspension les 2,5 g de résine dans la solution enzymatique et laisser sous agitation
douce pendant 30 minutes.
– Recueillir la résine, mesurer l'absorbance de la phase aqueuse à 280 nm avant de rejeter, laver avec
10 mL de tampon tampon acétate de sodium 0,01 mol/L pH 4,5 et 5 minutes d'agitation douce.
Répéter 2 fois le lavage. L'absorbance à 280 nm des phases aqueuses rejetées doit tendre vers 0
(toutes les protéines non adsorbées sont éliminées ...)

Mesure de rendement d'immobilisation

Réaliser une immobilisation témoin avec 0,2 g de résine et 0,4 mL d'invertase à 1000 u/mL en
microtube à centrifugation. 30 minutes d'agitation douce sur table vibrante. 5 Lavages de 5 minutes sous
agitation douce avec 1 mL de tampon (décantation de la résine par centrifigation douce).
Dans un Erlen contenant 100 mL de saccharose à 80 g/L tampon acétate de sodium 0,01 mol/L pH
4,5 à 55°C et sous agitation, introduire l'enzyme immobilisée. Prélever 20µL aux temps 1, 4 minutes
exactement et doser extemporanément le glucose formé selon le mode opratoire du tableau ci-dessous
(adaptation d'un kit de dosage du glucose GOD/PAP pour biologie médicale. Voir aussi les documents de
cours et de TP de première année concernant ce kit.)

Témoin réactifs Etalon 1g/L Essai 1 ou 4 minutes

Eau E = 20 µL

solution étalon E = 20µL

Échantillon à mesurer E = 20 µL

solution de travail 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL

Homogénéiser puis lire l’absorbance de l’étalon (Aétalon) et de l’essai (Aessai) contre le témoin réactif à 505 nm
quand la réaction est terminée. Il faut 10 minutes à 37°C et 20 minutes à 20°C. Linéarité jusqu'à 5g/L dans
l'échantillon dans les conditions proposées.

L'activité est calculée entre les temps 1 et 3 minutes.

Document annexe 2
Petit réacteur tubulaire à invertase immobilisée
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Mettre en suspension la résine à invertase

immobilisée en tampon acétate de sodium 0,01
mol/L pH 4,5.
Construire un petit réacteur tubulaire selon le
schéma ci-dessous.

Alimenter en saccharose à 80 g/L (glucose non

détecté).

Débits proposés à tester : 0,2 à 2 mL/min.

Analyse de l'effluent : dosage du glucose avec le kit

GOD/PAP, cf. mode opératoire du document annexe
1. Attention à la limite de praticabilité.

Document annexe 3
3.1 Coréticulation b-galactosidase d'Aspergillus oryzae / ovalbumine
Dans un tube à centrifuger maintenu à 4°C, introduire :
• 100 mg de β-galactosidase d'Aspergillus oryzae (poudre commerciale à environ 10 U/mg ; espèce choisie car sa
β-galactosidase supporte le traitement de coréticulation avec le glutaraldéhyde)
• 20 mg d'ovalbumine,
• 2 mL d'eau distillée.
Ajouter lentement et sous agitation continue :
• 3,75 mL d'acétone à 4°C (voir aussi la fiche sécurité),
• puis 0,25 mL de glutaraldéhyde à 25 % (m/v) (voir aussi absolument la fiche sécurité).
Placer sous agitation à 30°C pendant 60 minutes.
Centrifuger 2 minutes à 2000 x g, éliminer le surnageant, ajouter 5 mL d'eau distillée. Homogénéiser à l'aide d'un Ultra-
turrax. Laver deux fois le culot avec 5 mL d'eau distillée, rejeter le dernier surnageant.

3.2 Co-inclusion de l'enzyme réticulée avec des levures

L'alginate est un polyoside porteur . En présence de cations divalents comme le calcium Ca 2+, il forme
un gel (Voir aussi le fichier de TP « tp-betagal-alginat-prestat.odt ». Il est possible d'inclure des cellules ou
des « édifices macromoléculaires » dans le réseau tridimensionnel d'un gel d'alginate. L'inclusion d'enzymes
dans des billes d'alginate exige en principe des enzymes coréticulées et des gels d'alginate assez
concentrés (concentration vers 3% m/v) pour éviter les fuites. En effet, il faut généralement éviter   que les
enzymes inclues fuient hors du gel par simple phénomène de diffusion.
Dans le corps d'une seringue préalablement obturée, introduire :
• 2,5 g de levure,
• la préparation enzymatique réticulée,
• 10 mL d'alginate à 2,6 % (m/v). 
Homogénéiser à l'aide d'un agitateur plastique sans introduire d'air. 
Déboucher la seringue et laisser couler goutte-à-goutte dans 50 mL d'une solution de chlorure de calcium à
2 % (m/v) sous agitation lente.
 
Les billes sont maintenues dans la solution durant 15 minutes puis conservées à 4°C dans une solution à 0,5  %
de CaCl2. Les billes d'alginate sont récupérées à l'aide d'un tamis de Nylon.

Document annexe 4
Traitement d’un lactosérum : le dispositif de culture
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Introduire les billes (de co-inclusion d'enzyme réticulée et de levures) et 30 mL de lactosérum

(contenant 0,5 % m/v de CaCl2) dans une fiole d'Erlenmeyer de 50 mL. Réaliser le montage de fermentation
présenté ci-dessous.

Bibliographie :
- J. Boudrant, C. Cheftel : Continuous hydrolysis of sucrose by invertase adsorbed in a tubular reactor, Biotech. And Bioengineering (1975)
17:827-844
- Immobilized biocatalysts : an introduction / by Winfried Hartmeier; tr. by Joy Wieser , Berlin : Springer-Verlag, 1988 .
- Sujet de travaux pratiques de l'agrégation interne de biochimie génie-biologique, session 2001