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Université Abderrahmane Mira de Bejaia

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Troncs Communs Sciences de la Nature

Biologie cellulaire

Cours 2 : Techniques d’étude des cellules

L’enseignante : S. Meziani
Le biologiste

Dispose actuellement
d’un grand nombre de techniques et d’instruments

Adaptés à l’étude de la cellule


Méthodes d’analyse microscopique

Pour connaitre la composition et la forme d’une cellule


l’œil nu

Difficile de déceler la morphologie d'une cellule

D’utiliser

des appareils
MICROSCOPES

Microscope (Grec: micro = petit; scopein = voir)


&¶HVW quoi un microscope?
MICROSCOPE

9 GRQQHXQHLPDJHJURVVLHG¶XQSHWLWREMHW

(grossissement)

9 sépare les détails de celui-FLVXUO¶LPDJH


Instrument qui:
(résolution)

9 UHQGOHVGpWDLOVYLVLEOHVjO¶°LORXDYHFXQH

caméra
Définition
Ensemble de techniques permettant d’obtenir une image
des structures biologiques.
Histoire sur l’invention des microscopes
Il est difficile de dire qui a inventé le microscope

•  L'opticien Hans Janssen et son fils Zacharias fabriquèrent le


premier microscope en 1590 ;
•  Galilée a développé un microscope (composé d’une lentille
convexe et d'une autre concave) en 1609 ;
•  Christiaan Huygens a développé à la fin du XVIIe siècle un
oculaire simple à deux lentilles ;
•  Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), attiré l'attention des
biologistes sur l’utilisation du microscope (loupes ordinaires).
LA MICROSCOPIE EST DIVISÉE EN DEUX
GRANDS GROUPES

•  La microscopie optique (photonique) ;

•  La microscopie électronique.
1. MICROSCOPIE OPTIQUE

-  Source lumineuse est fournie par une


lampe.
-  L’onde (photons) envoyée sur
l’échantillon est concentrée par le
condensateur (lentille).
-  L’onde est captée par l’objectif
(lentille) qui grossit l’image.
-  L’image est visualisée par un
oculaire (lentille).
-  Peut être utilisé pour voir des
spécimens vivants.
Plusieurs microscopes optiques ont étaient
mis au point avec différents montages
optiques
d’électrons) qui permet des grossi
- "& Une onde (photons, électrons) est
Parmi les cellules envoyé
eucaryotes, il f
!"#$% '()&*#)*+"#
préparation. Cette onde est captée par un
végétal.

oculaire qui crée une image observable.


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microscope optique
<-:#6$:60"=>,#.=?"-$$=%&@%
Microscope Carl Zeiss 1891

1.1 - structure de la
Le microscope optique
1. MICROSCOPIE OPTIQUE
Objectif
9 C ¶HVW une lentille de courte focale (quelques mm)
9 Un objet placé à proximité de son foyer donne une image
intermédiaire agrandie et renversée
9 Le grandissement de l ¶REMHFWLI est noté g1
9 Un dispositif de rotation permet de changer l ¶REMHFWLI
1. MICROSCOPIE
Le microscopeOPTIQUE
optique
Oculaire

9 C ¶HVW une lentille de plus grande focale (quelques cm)


9 Il sert de loupe en grossissant O¶LPDJH intermédiaire
donnée par l ¶REMHFWLI
9 Le grossissement de l ¶REMHFWLI est noté G2
1. MICROSCOPIE
Le microscope OPTIQUE
optique
Le grossissement standard G

C ¶HVWXQQRPEUHTXLGpSHQG
9 Du grandissement g1 de l ¶REMHFWLI
9 Du grossissement G2 de l ¶RFXODLUH
Il se calcule par la relation : G = g1' * G2

On note par exemple: G=10x40 ou (x400)


/¶LPDJHHVWIRLVSOXVJUDQGHTXHO¶REMHWDFWXHO

Un grossissement de 40X à 1000X


Les différents types du microscope optique

² Le microscope à fond clair


² Le microscope à fond noir
² Le microscope polarisant
² Le microscope à contraste de phase
² Le Microscope à fluorescence
² Le microscope confocale a balayage
1.  MICROSCOPE OPTIQUE COURANT À FOND CLAIR

Les diffèrentstypesdu microscope optique


•  Source lumineuse : lumière
1. Microscope à fond clair
visible (400 à 760 nm).

•  Pouvoir séparateur (0.2 µm).

'
2. MICROSCOPE OPTIQUE À FOND NOIR
s diffèrentstypesdu microscope optique
•  L’éclairage est latéral.
2. Le microscope à fond noir

'

3XFHG¶HDXGRXFH
•  L’observation d’objets à l’état frais sans coloration.
3. MICROSCOPE POLARISANT

•  Microscope photonique pourvu de


deux polaroïds (deux filtres
polarisant).
•  Utilisé en cristallographie.
•  Résolution inférieure à celle du
microscope optique ordinaire.

Cristaux d'oxalate de calcium


(microscope polarisant X 100)
!  4. MICROSCOPE OPTIQUE ÀLesCONTRASTE
Exemples d’observation DEoptique
diffèrentstypesdu microscope PHASE
Cellules de l’épiderme d’oignon Cellule de la muqueuse buccale
3. Le microscope à contraste de phase

'

o Permet l’observation des cellules vivantes (non colorées).


5. MICROSCOPE A FLUORESCENCE

•  Pouvoir séparateur supérieur à celui du


Microscope optique ordinaire.
•  Utilise les rayons UV (390 à 200 nm)
•  Consiste à utiliser une coloration
fluorescente (la rhodamine : émet une
lumière rouge et la fluorescéine : lumière
verte).

-  Noyau ou ADN (en bleu)


-  Filaments (en rouge)
-  Protéines (en vert)
rescence) :
6. Métaphase
MICROSCOPE
Anaphase
Prophase CONFOCALE AMétaphase
BALAYAGE
Télophase
es en rouge Anaphase

que en vert
•  Observation d’objets épais.
en•  Fonctionne le plus souvent en fluorescence.
taphasique
•  L’objet est éclairé par en
un faisceau laser.
•  Analyses en 3D. -  Chromosomes en rouge
-  Fuseau mitotique en vert

Anaphase Télophase Télophase


MICROSCOPIE ELECTRONIQUE

•  L’objet est bombardé par un faisceau d’électrons.


•  Ne permet pas d'observer les cellules vivantes.
•  Lentilles sont des champs magnétiques.
•  Permet de révéler les plus fines structures internes
(X 1000 à X 500 000).

Deux techniques d'observation (méthodes complémentaires)


en microscopie électronique :

•  L'une permet de voir à l'intérieur de la cellule.


•  L'autre donne une image de la surface extérieure.
1. MICROSCOPE ELECTRONIQUE A
TRANSMISSION (MET)

•  Capable de révéler les détails


intracellulaires.
•  Limite de résolution (0.1 à 1 nm).

X 15400
Le microscope électronique
Les chloroplastes

'

Microscope Optique Microscope électronique à transmission


1. MICROSCOPE ELECTRONIQUE A
BALAYAGE (MEB)
ope électronique
•  Résolution plus faible que celle du
cause la grippe
MET (1 àaviaire
7 nm).
•  Images de cellules en 3D

M icroscope électronique à
'

Le microscope électronique

Le microscope
M icroscope électronique à balayage
électronique
M icroscope optique
à balayage

'

2&/599518&=-42.1*4(&>&=-8&
I nsecte : dendroctone Acariens
& =-+2&D&
TECHNIQUES DE PREPARATION DES OBJETS
A OBSERVER EN MICROSCOPIE

•  Certaines techniques permettent de visualiser un


échantillon naturel.

•  Nécessaire de préparer les échantillons avant de les


observés.
Observation sur le vivant

•  Possible qu’en microscopie optique.


o  La microscopie électronique ne permet pas de réaliser des
observations vitales.

Observation de cellule morte

•  Observations de cellules (microscopie optique ou électronique).


•  Tuer les cellules revient à les fixer.
1. FIXATION

•  Immédiatement après le prélèvement (AUTOLYSE).


•  On arrête toute vie cellulaire, on fige et consolide l’objet.
•  Facilite la pénétration des colorants dans les cellules.
•  But : tuer les cellules et les conserver dans un état aussi proche de
l’état vivant.

La fixation peut être


v  Physique : azote liquide, gaz carbonique comprimé.
v  Chimique : fixateurs coagulants et fixateurs non coagulants.
2. DURCISSEMENT OU INCLUSION

•  Remplaçant l'eau des cellules par un liquide (paraffine chaude,


résines, substances non hydrosolubles)

On obtient ainsi des blocs d'une dureté suffisante pour


réaliser des coupes très fines
3. PREPARATION DES COUPES

•  Coupes de 5 à 10 µm observables au MO. (microtomes)

•  Coupes ultrafines 80 nm observables au MET. (ultra-microtomes).


4. COLORATION

•  Indispensable pour visualiser les structures cellulaires.

En M.O : on utilise des colorants naturels :


-  Le vert de méthyle qui colore en vert la chromatine.
-  La pyronine qui colore en rose les nucléoles.
5. CONTRASTE

•  Réalisé en plongeant pendant quelques minutes les


grilles supportant les coupes dans des solutions (sels de
plomb, tungstène, uranium).

•  NB: Quand les cellules ont été fixées, le fixateur agit également
comme colorant, mais le contraste est habituellement renforcé
par une coloration ultérieure des coupes.
6. PRÉPARATION DE FROTTIS
o  Des cellules isolées en suspension peuvent être étalées sur une
lame en verre
(fixées et colorées avant l’observation au M.O.)

•  Cette préparation est surtout utilisée :


ü  En microbiologie pour observer les bactéries
ü  Ou pour la préparation d’un frottis sanguin