14/9/2010

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECUPERAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

LISADO Purificação: métodos baseados nas diferentes a cada etapa da purificação e total
propriedades das proteínas + Recuperação: indica qual a porcentagem de atividade
enzimática é recuperada após o procedimento de purificação
mg/ml proteína +
proteínas são polieletrólitos de alto PM
(estrutura 3a e 4a/ interações/afinidade)
(>1000 proteínas
diferentes) +
purificar -glicosilase 96%

83%
1. Cromatogafia iônica
2. Diálise 75%
3. Eletroforese
75%
Acompanhar a purificação 45%
Mesmo que a recuperação seja razoável a cada etapa (95-75%)
a recuperação total cai bastante com o número de etapas.

Recuperação de 90% em cada etapa com 10 Enriquecimento: indica o aumento da

etapas estaremos recuperando 10% do total da atividade específica após o procedimento de
atividade enzimática. purificação.
1 Etapa de purificação
eração em relação ao início

100 mU/mg 200 mU/mg

0.8 Escolher métodos adequados
para minimizar número de etapas
0.6
Enriquecimento = 2 = 200/100
0.4

02
0.2
Recupe

0
Recuperação total cai mas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ocorre enriquecimento da
etapas
proteína de interesse

45% 1500 x

Atividade
específica 10 u/mg 25 u/mg 50 u/mg 100 u/mg

POLIELETRÓLITOS DE ALTO PM: CROMATOGRAFIAS

carga/ massa / especificidade -Papel/camada delgada
-”Filtração”- Solutos de baixo PM- (p/ concentrar proteinas) -Coluna (cromatografia líquida): pressão normal/alto desempenho
- precipitação com (NH4)2SO4 Filtração em gel -Princípio da separação- interação relativa dos componentes da
- redutores de Cys-S-S-Cys Solutos/Proteinas
(exclusão molecular)
mistura com uma matriz sólida (fase estacionária) e uma fase
móvel (solvente).
-sob pressão
....
..
Filtro/membrana Componentes que interagem mais com a matriz sólida
. vão ficando retidos (são eluídos mais lentamente).
.. (corte 5000/10000/20000)
..
..

-diálise Interações: tamanho (exclusão)

.... .... carga (troca iônica)
… ..
… . . ... . . . afinidade por ligante (afinidade)
. . . .. . . . hidrofobicidade
....
membrana . . .. .. .. .. . tampão
semipermeável
Alargamento
trocas das bandas
Pressão atmosférica

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HPLC-high performance liquid chromatography FILTRAÇÃO EM GEL (EXCLUSÃO MOLECULAR)

-Diferença de tamanho
10 kD
20 kD
100 kD
Fluxo de solução
amostra
tamponante
através da coluna
Coluna cromatográfica

5 m

Detector UV 280nm Coletor de frações volume

Seletividade
As dimensões dos poros da
matriz determinam a faixa de
peso molecular das proteínas
que podem ser separadas na
cromatografia

fluxo

volume
V de eluição (Ve) da
Seletividade
As dimensões dos poros da matriz determinam a faixa de peso
proteína é inversamente
molecular das proteínas que podem ser separadas na proporcional ao PM da
cromatografia proteína

Cálculo de peso molecular relativo utilizando

66.000
cromatografia de filtração em gel 12.000 PM relativo
Definições mesmo em misturas
ve = volume de eluição da amostra (proteína ve
de interesse)
vo = volume morto ou “void”. Volume no qual
vo volume
são eluídas proteínas totalmente excluídas
dos pporos das resinas. Corresponde
p ao
volume externo aos grãos da resina.
y (log PM)= a(Kav) + b
Pode ser medido usando macromoléculas
muito grandes, em geral “blue dextrana”
(ordem de milhões de D)
vt = volume total da coluna. Pode ser
calculado geometricamente a partir das
dimensões da coluna.

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MÉTODOS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Troca iônica +

(POLIELERÓLITOS DE ALTO PM) DEAE: M-OCH2-CH2-NH(CH2CH3)2
+
+ pH = 6,0 > pI
N+/C-/ cadeias laterais (+/-)
CM: M-CH2-COO-
-
- Carga liquída= -1
- Velocidade de eluição
- Depende da carga líquida no
o pH utilizado
+

--
- Base (mL)
Carga   (pI-pH)
+ Volume vazio
+ +

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

Trocadora de cátion
Trocadora de cátion
pI = 9 Na+ Na+ -
Cl
Na+ Na+ Fluxo com solução
+ Cl-
+++ Na tamponante contendo NaCl
Cl-
Tampão de eluição Cl-
Na+ +++
pH = 6 Cl-
Cl-
Na+ Cl-
Na+ Cl- NaCl (0.5M) NaCl (1.5M)
+ pI = 7
Na+ + Cl-

pI = 5 Na+
- volume
Carga   (pI-pH) volume

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA CROMATOGRAFIA DE HIDROFOBICIDADE (HIC)

Hydrophobic interaction chromatography

H2O íons proteína

-O-CH2COO-
região hidrofóbica
pode interagir consigo (precipitação)

ou com resinas
com gpos hidrofóbicos (HIC)
Adição de sal

CM Sefarose alto fluxo -O-CH2COO-

Sais aumentam
possibilidade de interação
hidrofóbica por aumentar
entropia da água

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(NH4)2SO4 alta concentração [(NH4)2SO4] diminuição

[(NH4)2SO4]
[(NH4)2SO4]
Abs
280

Abs
280
volume volume

RESINAS PARA CROMATOGRAFIA DE

INTERAÇÃO HIDROFÓBICA

hidrofobicidade
[(NH4)2SO4]
Abs
280

volume

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR CAUDA DE HIS

Especificidade- antígeno x anticorpo
-His-His-His
-enzima x inibidor competitivo 1. - 3. Im
Im Im Im Im Im His-His complexation to Ni2+
-íons metálicos (Zn2+/Ni2+) x cauda His, etc Im Im Im
Im
Im Im
Para recuperar proteína Ni2+ Ni
2+ Ni2+Ni2+
Ni2+ Ni
2+ Ni2+Ni2+
fluxo (eluir) Ni2+
Ni2+ Ni2+Ni
2+
-His-His-His Ni 2+
Ni2+
-

2. 4.
2+ Ni2+Ni2+
Ni2+ Ni Ni2+
Ni2+ Ni2+Ni2+

Ni2+
-
-His-His-His
Ni2+ Ni2+
Ni2+ Ni2+ Ni
2+
Imidazole (Im) structure

Mudança de pH, N
força iônica ou
adição de N
competidor H

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PRÁTICA 5- PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PRÁTICA 5- CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
DEAE- A e B- técnicas do lab- C e D (dia 21/09) e E e F (dia 28/09)
Sephadex
Aplicar amostra
-1 ml do lisado - Centrifuga (10.000g/13 s)- Sobrenadante (S)
0,6 ml S congelado p/ próxima prática (no grupo)
- 0,4 ml S são diluidos pela adição de 0,6 ml de tampão sem
NaCl. Amostra agitada e aplicada (1,0 ml) na parede da
coluna (após drenar tampão da coluna).
Eluir proteínas não retidas
Colocar o tubo 1, abrir presilha e deixar escoar até ~3 mm
do topo)
-Colocar tubo 1 no gelo e colocar o tubo 2 para coleta
-Ir colocando tampão sem NaCl no topo da coluna e ir
eluindo proteínas não retidas em diferentes tubos (2-10)
sempre de 1 em 1 ml/tubo).
DEAE- ELUIÇÃO DAS PROTEÍNAS RETIDAS (tubos 11-20)
Sephadex Após coleta do tubo 10, o tampão eluente deve estar na
borda da fase sólida.
Adicionar tampão Pi contendo NaCl até o topo da coluna
e ir coletando em tubos numerados de 11-20 de 1 em 1 ml
como acima. Manter todos tubos no gelo.
DETERMINAR QUAIS FRAÇÕES TEM ATIVIDADE α-
GLICOSIDASE
-Pegar 20 tubos limpos, marcar 1 a 20, colocar no
gelo. Pipetar 0,2 ml NPαGL + 0,2 ml das frações 1-20
coletadas nos tubos numerados correspondent/.
-transferir para banho a 30 oC e incubar 10 min + 2 mL de
tampão carbonato-bicarbonato pH 11. ler Absorbãncias a 420
nm
-construir gráfico Abs x no do tubo.
-REUNIR AS FRAÇÕES COLETADAS que mostrarem maior
atividade, marcar como material DEAE colocando o No. do
grupo.

PRÁTICA 5- PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (dia 28/09)
E e F e G Determinar a atividade específica do material
DEAE e do lisado original
-CUIDADOS COM DILUIÇÃO DOS MATERIAIS
-Concentração de atividade enzimática/ concentração de
proteína total

TRATAMENTO DE DADOS:
-gráfico para determinar concentração de atividade enzimática
(mU/mL)
-determinar atividade específica da -glicosilase do material
DEAE
-Calcular a recuperação e o enriquecimento após a
cromatografia