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Referências
Birnboim, H.C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmud DNA. Nucleic Acids Research 7:1513-1523.
Sambrook, J., E.F. Fitsch, e T.M. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd ed. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
PROTOCOLO DE MINI-PREPARAÇÃO DE DE DNA DE PLASMÍDEO USANDO LISE-ALCALINA
4. Adicionar 200 µ l da Solução II. Preparar solução fresca antes do uso Misturar
por inversão. Incubar no gelo por 5 minutos.
5. Adicionar 150 µ l da Solução III. Misturar por inversão. Incubar no gêlo por 5
minutos.
11. Adicionar 1 ml de etanol absoluto (100%), misturar por inversão, e incubar a -20 oC
por pelo menos ½ hora.(Esse é um bom ponto de parada, pois DNA é estável sob etanol.)
Solução I:
Componente Quantidade Concentração Final
Glucose 0,9 g 50 mM glucose
Tris-HCl 1 M, pH 8,0 2,5ml 25 mM Tris-HCl, pH 8,0
EDTA, 0,5 M, pH 8,0 2,0 ml 10 mM Na2.EDTA
Água mQ destilada para 100 ml
Autoclavar por 20 minutos a 121oC
Armazenar na geladeira
Opcional: Adicionar 2 mg ml-1 de Lisozima imediatamente antes do uso.
Solução II:
Componente Quantidade Concentração Final
NaOH 1N 2 ml 0,2 M NaOH
SDS 10% p/v 1 ml 1,0% SDS
Água mQ destilada para 10 ml
Solução III:
3 M KOAc, pH 5,5 (Ver Apostila 1).
TE:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM Na2.EDTA, pH 8,0
Autoclavar
Adicionar RNAse A na concentração final de 50 µ g/ml logo antes do uso.
RNAse:
Tradicional (Sambrook et al., 1989)
Meios
Transfo Buffer
Para 10 ml:
1 ml 10X KCM, 1.5 ml 10% PEG, 7.5 ml água mili Q autoclavada
2 Usar 5 ml dessa cultura para inocular 500 ml de meio LB, e cultivar sob alta
agitação até atingir Abs600 = 0,5 (cerca de 3 horas). O número de células não deve
ultrapassar 108 ml-1;
6. Transferir as células para um tubo e incubar a 37o.C por 1 hora com agitação.
1. Logo após o uso lavar as cubetas com água para remover as bactérias;
2. Adicionar 1 M NaOH até cobrir a parte metálica interna;
3. Complete com etanol e deixe por 10 min;
4. Enxaguar bem com água corrente, e depois com água MilliQ;
5. Secar em estufa a 37oC;
6. Imediatamente antes do uso, esterilizar por 10 minutos em luz UV (ou irradiar com
raios γ por 20 min);
Obs.: Se a parte externa da cubeta estiver oxidada, deixar de molho em solução de 1M
NaOH e etanol.
PREPARAÇÃO E CONGELAMENTO DE CÉLULAS
COMPETENTES DE ESCHERICHIA COLI
2. Colocar um tubo plástico estéril com parede fina no gelo. Dentro dele, colocar 100
µ l de células de bactéria competente e 1 µ l da preparação de plasmídio. Incubar no
gelo por 1 hora;
L Broth:
10 g Bactotriptona
5 g extrato de levedura)
10 g NaCl
Completar o volume para 1 litro com água, e pH para 7,0; autoclavar.
Meio SOB
Bacto triptona 20 g
Extrato de levedura 5g
NaCl 0,5 g
Adicionar água até 950 ml. Agitar até dissolver. Adicionar 10 ml de uma solução de
250 mM de KCl (dissolver 1,86 g KCl em 100 ml de água destilada). Ajustar o pH
para 7,0 com NaOH, e acertar o volume para 1 litro. Autoclavar. Pouco antes de
usar, acrescentar 5 ml de uma solução estéril de 2 M MgCl2 (dissolver 19 g de MgCl2
em 90 ml de água destilada, ajustar o volume para 100 ml com água estéril e
autoclavar por 20 minutos).
Meio SOC
Esse meio é idêntico ao meio SOB, exceto que contém 20 mM de glucose. Após o
meio SOB ter sido autoclavado, esperar esfriar abaixo de 60oC, e acrescentar 20 ml de
uma solução estéril de 1 M glucose (preparar essa solução dissolvendo 18 g de
glucose em 90 ml de água destilada, dissolver, ajustar o volume para 100 ml com
água destilada, e esterelizar por filtração através de filtro de 0,22 µ m).
Célula Competente com Cloreto de Rubídio
(Protocolo fornecido pela Dra. Dirce Carraro - CEBTEC, ESALQ, USP)
1) Inocular uma colônia isolada em 10 ml de SOB a 37ºC sob agitação (250 rpm);
2) Inocular 1 ml de pré cultura em 100 ml de meio SOB (Erlenmeyer de 500 ml). O meio
deve ser pré aquecido a 37ºC. Incubar a 37ºC sob agitação (250 rpm) até atingir
OD=0.45 a 0.55. Esse valor é muito importante.
3) Transferir a cultura para 2 tubos falcon de 50 ml estéreis, resfriar a cultura por 10 min
em gelo e centrifugar 3000 rpm por 10 min a 4ºC. Descartar o sobrenadante e manter os
tubos invertidos por alguns seg.
4) Ressuspender as células em 1/3 do volume inicial (33 ml) em solução RF1. Transferir
as suspensões para único tubo Falcon. Incubar em gelo por 15 min.
12) Adicionar 800 µ l de SOC e incubar por 1 hora a 37ºC sob agitação moderada (180
rpm)
13) Espalhar uma 150 ml de células em placa LB contendo o antibiótico (Ampicilina 100
µ g/ ml).
SOB
Bacto triptona - 2%
Extrato de levedura - 0.5%
NaCl - 10 mM
KCl - 2.5 mM
autoclavar
acrescentar: Mg Cl2 10 mM
MgSO4 10 mM
RF1
RbCl (100mM)
MnCl2 (50mM)
CaCl2 (10 mM)
glicerol (15%)
Acetato de K 1M pH 7.5 (30mM)
RF2
MOPS 10mM
RbCl 10mM
CaCl2 75 mM
glicerol 15%
Ajustar o ph para 6,8 com NaOH
1. Riscar uma placa, com meio novo contendo os antibióticos com a cepa, e crescer por
2-3 dias;
2. Inocular a bactéria em meio YEP e crescer sob agitação (100 a 150 rpm) a 28oC por
12 a 16 horas;
3. Transferir 2 ml da cultura para 50 ml de meio YEP em Erlenmeyer de 250 ml.
Incubar sob agitação (100 a 150 rpm) a 28oC por 12 a 16 horas. A eficiência da
transformação é maior com absorbância Abs600 = 0,5 a 1,0;
4. Incubar no gelo por 15 minutos;
5. Centrifugar as células por 5 minutos a 5000 rpm a 4 oC. Lavar o pellet com 10 mM de
Tris-HCl pH 7,5, e repeletizar por centifugação por 5 minutos a 5000 rpm
6. Ressuspender o pelet com cuidado em 1ml de 20 mM CaCl2 gelado;
7. Caso for preparar estoque congelado, incorporar glicerol com concentração final de
10%. Congelar alíquotas de 100 µ l em microtubos tubos em banho de alcóol com
gêlo seco. Armazenar os tubos no ultra-freezer –80 oC.
Meios
YEP líquido
10 g Bactotriptona
5 g NaCl
5 g extrato de levedura
completar o volume para 1 litro com água destilada. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH.
YEB
5 g extrato de carne
1 g de extrato de levedura
5 g de peptona
5 g de sacarose
240 mg de MgSO4
Completar volume para 1 litro e ajustar o pH para 6,8 com gotas de NaOH 0,1 N.
Esterelizar em autoclave por 20 minutos a 121oC.