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Tp: microbiologie appliquée à l’agro-

alimentaire

Tp 1: Introduction à l’analyse
microbiologique des produits
alimentaires
Microbiologie
alimentaire

étude des micro-


organismes habitants,
formants ou contaminants
les aliments

Pour des raisons économiques

Pour des raisons de santé


publique

Pour respecter la législation

Pour le suivi ou la sélection de


« bons microbes »
 Qualité organoleptique
 la valeur nutritive
 la digestibilité
bénéfique  Conservation
 Effet pro biotiques
(bactériocines « nisine »
et bactériophage)
Rôle et
signification  modifications
des Altération/ défavorables des qualités
microorganism détérioration et organoleptiques
es dans les décomposition
aliments des aliments (Pseudomonas,
Acinetobacter, Aspergillus,
Rhizopus, Flavobacterium)

 Pas d’effet sur les


propriétés organoleptiques
Nuisible/néfaste
ou pathogène  intoxications alimentaires
 toxi-infections
alimentaires
 infections d’origine
Intoxination Toxi-infection Infection
Production
de toxine
dans l’aliment
Ingestion Ingestion Ingestion
de l’aliment de l’aliment de l’aliment
+ toxine + bactéries + bactéries
Action de la Action Actionbactéries
toxine sur la des bactéries dans autres organes
muqueuse dans TD poumon, méninge
digestive sang
Production
de toxine active
sur la muqueuse
digestive
plusieurs
2à6h de 9 à 48h jours ou semaines
après’ingestion
l après ingestion après l’ingestion
Composition
La température chimique de
l’aliment

pH les caractères de l’aliment Structure

Activité de l’eau Potentiel


d’oxydo-
réduction

Agents antimicrobiens
naturellement présents
Présence d’enveloppe naturelle
(coques, peaux )

Structure Emballage

état des aliments (liquide ou


solide, entier ou hachés et frais
ou séché).
Lacténines du lait frais
(facteurs anti-
coliformes)

. La lysozyme dans l’œuf


Agents est actif sur des germes à
antimicrobiens Gram positif
naturellement
présents
Composés à activités
antimicrobiennes:
comme le thymol (thym),
l’eugénol (clou de girofle)
Composition chimique
de l’aliment

Plus la diversité de composition


d’un aliment est grande (produits
animaux tels que les viandes et
dérivés, le lait ...) et plus sa
susceptibilité à servir de milieu
de culture est grande.
pH :
pH :
Activité de l’eau
Les microorganismes ont besoin, pour se
multiplier, d’eau disponible.
Xérophiles capables de se développer
dans des produits à faible aeau
Osmophiles capables de se développer en
milieux fortement sucrés
Halophiles capables de se développer en
milieux fortement salé
Les moyens d’abaisser l’activité de l’eau
sont nombreux :
- physiques (congélation, déshydratation)
- additifs (salage, sucrage..)
Activité de l’eau
Activité de l’eau
Potentiel d’oxydo-réduction/type respiratoire

Selon leur mode de respiration, les


microorganismes sont soit aérobies stricts, soit
anaérobies stricts, soit aéro-anaérobies, soit
micro-aérophiles ...

Ces propriétés expliquent la diversité des


altérations que l’on peut rencontrer:
Potentiel d’oxydo-réduction/type respiratoire
- les moisissures et les levures aérobies strictes
se développent en surface en formant des
voiles plus ou moins épais
- les levures se multiplient en profondeur avec
production de gaz
- les Clostridium ne se développent qu’en
absence d’oxygène (masse, conserve..)
- les Pseudomonas ne se développent qu’en
présence d’oxygène (surface)
- les Lactobacillus microaérophiles ne se
développent qu’à une teneur réduite en
oxygène.
La température :
La température la plus basse à laquelle un microorganisme a pu être observé
en croissance est de -24°C et la plus haute de 90°C.
T°C opt

Vitesse de
croissance
Ralentissement et arrêt Dénaturation des
de la croissance avec protéines et mort
possibilité de reprise cellulaire
0 10 15 45°C

germes dangereux Listeria mésophiles thermophiles


monocytogenes, Clostridium
botulinum, Bacillus cereus,
Yersinia enterocolytica, Vibrio
parahaemolyticus, Aeromonas cryophiles
hydrophila, Plesiomonas
shigelloïdes et même E. coli
entéropathogène.
La température :
Conservation des aliments

la réfrigération, dite "froid positif" qui ralentit


la multiplication des micro-organismes.
la congélation ou surgélation -18°C
(congélation ultra rapide) qui arrête la
multiplication.
Saumurage (une forte concentration
en NaCl ) stoppe aussi la multiplication des
flores pathogènes
une forte concentration
en saccharose stoppe la multiplication
(confiture)
Conservation des aliments

L’acidification crée des conditions


défavorables pour les micro-organismes
(vinaigre)
l'ajout de conservateurs a les mêmes effets
séchage des aliments.
la pasteurisation (température + 70°C,
détruit les flores)
la stérilisation (température +120°C, détruit
toute la flore et les formes)
Qualité microbiologique des aliments

Pour que le microbiologiste puisse définir le


plus rapidement possible la notion quantitative
et qualitative de flore normale d’un produit,
Trois types de microorganismes sont
conventionnellement recherchés, lors de
l’analyse microbiologique des denrées
alimentaires:
 microorganismes responsables de
l’altération,
microorganismes indicateurs de la
contamination fécale
Qualité microbiologique des aliments
microorganismes pathogènes
responsables de toxiinfections
alimentaires
Parmi les microorganismes responsables de
l’altération des aliments, se trouvent
• la Flore Mésophile Aérobie Totale
(FMAT)
• la Flore Fongique constituée par les
Levures et Moisissures.
Qualité microbiologique des aliments
Les microorganismes dits indicateurs de
contamination fécale sont
• les Coliformes Totaux et les Coliformes
Fécaux
• les streptocoques fécaux.
Les microorganismes pathogènes responsables
de toxiinfections alimentaires sont
 les Anaérobies Sulfito-Réducteurs (ASR),
Staphylococcus aureus,
Salmonella sp,
Listeria monocytogenes,
Vibrio cholerae et Vibrio
parahaemolyticus.
Prélèvement et échantillonnage

• les échantillons doivent être représentatifs


d’un lot ou d’une production si non les
résultats d’analyse n’auront aucune
signification car les germes pathogènes ou
de toxines peuvent etre distribués de façon
hétérogènes dans l’aliment
• La taille de l’échantillon d’un produit de
même nature réparti en portions unitaires doit
être au moins de 5 unités
Prélèvement et échantillonnage

• Le laboratoire doit disposer d’environ 500 g


de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g
pouvant être fournis par une ou plusieurs
pièces.
• Si le prélèvement de 5 échantillons s’avère
trop élevé par rapport à la production il est a
procédé à un étalement dans le temps des
prélèvements.
Prélèvement et échantillonnage

• les prélèvements doivent respecter des règles


d’asceptie et de représentativité.

• La prise d’essai destinée à la préparation de


la suspension mère et de ses dilutions doit
correspondre aux parties superficielles et
profondes notamment pour les produits en
tranche, hachés, divisés et les plats cuisinés
par exemple.
Prélèvement et échantillonnage
• Pour les produits liquides la prise d’essai est
effectuée sur le produit “homogénéisé” ou sur
les parties superficielles et profondes
• Dans le cas d’examens microbiologiques
faisant suite à une maladie de type TIA il faut
rechercher les germes dangereux
(pathogènes, toxinogènes) et leurs toxines
aussi bien dans les prélèvements de surface
que dans la masse.
Traitement des échantillons :

• Identifier immédiatement le produit avec une


étiquette ou une référence (ne pas utiliser de
crayons feutres sur des films plastiques (PVC))
• Noter la température initiale, l’heure du
prélèvement, la date et la température de
transport.
• Amener les échantillons le plus rapidement
possible au laboratoire en maintenant les
conditions initiales dans lesquelles se trouvait le
produit.
Traitement des échantillons :

• L’analyse devrait être réalisée dans l’heure qui


suit le prélèvement.
• Dès réception au laboratoire l’échantillon
accompagné de sa fiche signalétique est
enregistré (nature, date, heure, provenance
du prélèvement, nom du préleveur, analyses
demandées, autres indications utiles).
• Si l’échantillon doit être transporté il faut
réduire au maximum le délai avant l’analyse.
Traitement des échantillons :

• Il est souvent nécessaire de réfrigérer (mais


non congeler) le produit au cours de son
transport; certains germes fragiles peuvent
disparaître au cours de cette réfrigération.
• Si un produit est déshydraté ou en conserve il
ne doit pas être réfrigéré.
Traitement des échantillons :

• Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait


pas de décongélation pendant le transport. Il
faut veiller à ce que la température du
produit prélevé soit au moins égale à -18°C,
transporter le produit à cette température et
décongeler à l’air ambiant à température
voisine de 20°C pendant un temps inférieur à
3 heures, temps suffisant pour atteindre une
texture qui permette le prélèvement.
Préparation de l’échantillon
- Broyage et homogénéisation
• Quelle que soit la nature initiale du produit,
l’analyse microbiologique s’effectue toujours
à partir d’une suspension.
• Après ouverture aseptique, l’échantillon sera
“homogénéisé” (liquide) ou broyé dans un
volume connu de diluant stérile (solide) ce qui
constitue en fait la première dilution.
• Le broyage s’effectue en général avec 9
volumes de diluant pour 1 “volume” de
produit (par exemple 10 g de produit et 100
ml (ou 90) de diluant stérile).
Préparation de l’échantillon
- Broyage et homogénéisation
• Pour les produits liquides (ou semi-liquides)
une agitation manuelle vigoureuse en
présence de billes de verre permet d’obtenir
une homogénéité satisfaisante.
• Pour les produits solides diverses techniques
de “broyage” sont utilisables :
1) broyage manuel au Potter ou en en
présence de sable stérile ou de billes de verre
(mortier)
Préparation de l’échantillon
Broyage et homogénéisation
2) broyage mécanique
- avec un broyeur électrique à couteaux de
type VIRTIS (la température ne doit pas trop
s’élever le récipient peut être placé dans de la
glace).
• avec un broyeur du type STOMACHER.
L’appareil permet un broyage doux de
l’aliment dans le diluant. De plus il (digesteur)
utilise des sacs plastiques stériles à usage
unique.
Préparation de l’échantillon
Broyage et homogénéisation
La revivification
• Les micro-organismes sont souvent
“endommagés” au cours des traitements
technologiques appliqués aux produits
alimentaires ou par suite de leur vieillissement
et ceci peut entraîner des variations dans les
résultats.
• En général les altérations des cellules
microbiennes sont réversibles, la “réanimation”
ou encore la revivification de ces cellules
s’impose avant de les soumettre à des milieux
sélectifs ou lors de la recherche des micro-
organismes pathogènes ou indicateurs.
La revivification

• La revivification peut être réalisée dès la


première étape de l’analyse au cours de
laquelle le produit est additionné de diluant. Il
suffit alors de choisir un diluant de composition
favorable et d’incuber le tout à la
température optimale de croissance du
germe à rechercher pendant un temps qui est
le plus souvent voisin du temps de latence du
germe “normal”.
La revivification

• Une durée supérieure conduira à une


surévaluation du nombre de germes.
• Dans les épreuves du type présence ou
absence, la revivification est obtenue par un
pré-enrichissement dans un milieu favorable,
La durée d’incubation peut être relativement
longue car la multiplication des germes à
rechercher est dans ce cas très souhaitable.
Dilutions et diluants

• Le type de dilution utilisé est les dilutions


décimales.
• Le choix du diluant est déterminant car les
microorganismes peuvent être inhibés ou
même altérés par le changement du milieu
(changement de pH mais surtout de force
ionique). Ex: Staphylococcus aureus est “tué”
en quelques heures dans de l’eau distillée
Dilutions et diluants
• Il est souhaitable, sauf indication afférente à
un type donné d’aliment, de réaliser les
préparations et les dilutions des échantillons à
analyser dans une solution de tryptone sel.
• En absence d’information le choix se fera en
fonction de la composition du produit à
analyser: si le produit est riche en protéine et
en minéraux, Ringer ou eau physiologique
suffisent et même une solution de phosphate
à 2 % et pH 7,4 dans le cas des fromages frais,
crèmes fraîches et caséinates.
Dilutions et diluants
Composition des différents diluants
Dilutions et diluants
Composition des différents diluants
• Tous ces diluants sont stérilisés à 121°C
pendant 20 minutes.
• Il faut noter que les milieu tryptone-sel et eau
peptonée tamponnée permettent, dans des
conditions particulières (température, temps),
de réaliser une revivification.
• L’eau peptonée tamponnée est utilisée avec
certains produits acides au fort pouvoir
tampon comme les yaourts.
Interprétation des résultats

les résultats de l'analyse microbiologique d'un


aliment est interprété en fonction des critères
de l'aliment et selon le plan prévu, en effet,
pour chaque catégorie de produit alimentaire
et pour chaque catégorie de micro-
organisme, le journal officiel publie un critère,
Interprétation des résultats
1. Le plan à deux classes
Deux réponses seulement sont possibles :
- « présence dans » NON SATISFAISANT
- « absence dans » SATISFAISANT ; le produit est
déclaré impropre à la consommation. (ex:
Salmonella et Listeria)
Interprétation des résultats
2. Le plan à trois classes
Dans le cas de normes chiffrées, étant donné
que un résultat d'analyse bactériologique doit
toujours être considéré comme relativement
peu précis, l'interprétation des résultats tient
souvent compte de l’incertitude de la mesure
- Critère
- m : seuil limite pour qu'un produit soit d’une
qualité satisfaisante,
 m=10*critère fixé (milieu liquide)
 m=3* critère (milieu solide)
- M = seuil Maximum ou limite d'acceptabilité
 M = 10 critère (milieu solide)
 M : 30 critère (milieu liquide)
Interprétation des résultats
2. Le plan à trois classes
 Un résultat N est satisfaisant (acceptable
sans réserve) si N < m,
 Un résultat N est acceptable avec réserve s'il
est compris entre m et M
 Un résultat N est non satisfaisant si N > M
 Un résultat N est corrompu (COR) si N > 1000*
critère
Interprétation des résultats exemple
Bilan des résultats
L’ensemble des résultats des divers
dénombrement ou recherches effectués sur un
aliment doit permettre d’apporter une
mention globale à l’aliment, on estime que:

- Tous les résultats satisfaisant conduiront à la


mention satisfaisant;

- Un seule résultat corrompu conduira à la


mention corrompu;

- Un seul résultat non satisfaisant pourra


conduire à la mention corrompu.
Bilan des résultats

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