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DFGSP2

Module SB2 Année 2018/2019


UE11 : Biologie Moléculaire et Cellulaire

CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES


HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET
APPROCHES THERAPEUTIQUES

- CHAPITRE IV -

APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES


MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)

A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR

Bernard CARCY
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Faculté de Pharmacie, Université
Montpellier
I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)

II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES

III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)

IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES


MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation
- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)
- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)
- Transformation bactérienne
- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)
- Banque d’ADN

B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE


1/ Production de protéines thérapeutiques recombinantes
- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)
- par des animaux ou végétaux transgéniques
2/ Production de protéines thérapeutiques in situ
les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)
- les vecteurs viraux
- les vecteurs non viraux

2.1/ Thérapie génique (ADN médicament)


2.2/ Injection ADN nu
3/ Le clonage reproductif et thérapeutique
4/ Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II
(Appliquées à l’extraction, la manipulation et le clonage moléculaire
d’un gène ou d’un génome; transfert de gène ou transgénèse)

2- Fragmentation du
génome entier (n
1- Sélection d’un
fragments d’ADN)
gène d’intérêt (1
fragment d’ADN)
ADN

Amplification d’un Ligature


gène (ou de n
gènes) après pUC Vecteur
fragmentation du AmpR
génome
Transformation
Sous-clonage
(changement de vecteur)
Cellule hôte
Sélection

2- Clonage de n fragments d’ADN 1- Clonage d’un seul fragment d’ADN (gène)


(banque d’ADN d’un génome)
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II
(Appliquées à l’extraction, la manipulation et le clonage moléculaire
d’un gène ou d’un génome; transfert de gène ou transgénèse)

• Extraction des Acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)


• Séparation électrophorétique (classique ou PFGE) des acides nucléiques
et visualisation
• Fragmentation de l’ADN (enzymatique par ER ou mécanique par
shotgun)
• Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN sur un
vecteur)
• Vecteurs de clonage (plasmide, BAC, rétrovirus)
• Transformation bactérienne
• Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant
(-complémentation)
• Banques d’ADN
1- Extraction des Acides nucléiques

*Quelques généralités (ADNg ou ADNc, ARNm)

ADNg (gène dans un génome eucaryote: intron + exon +5’ NC et 3’NC)


introns
5’ exon1 exon2 exon3 3’ Brin codant
3’ exon1 exon2 exon3 5’ Brin non codant

Transcription/maturation
AUG Stop
ARNm mature : 5’ CAP exon1 exon2 exon3 Poly(A) 3’
-1 seul cadre de
lecture ouvert
(Open Reading Traduction Rétrotranscription
ATG Stop
Frame=ORF)
exon1 exon2 exon3
exon1 exon2 exon3
Traduction
Nter Cter ADNc (ADN complémentaire)
protéine copie ADN double brin issue
d’un ARNm mature)
1- Extraction des Acides nucléiques
* Principe général d'extraction des acides nucléiques (ADN et ARN)

N
Cellule nucléée
ARN totaux (µg)
ADN (µg) Tampon de dissociation des protéines
(détergents) 1 + Inhibiteurs RNases
endogènes

Extraction des AN (Ex: phénol) 2

Précipitation des AN (Ex: Alcool + sel) 3

1 DO260nm 1 DO260nm
= 50µg/ml Dosage/Pureté/intégrité des AN (spectro.) 4 = 40µg/ml
ADNdb ARNsb

1,8 < DO260nm <2 Pureté


DO280nm
1- Extraction des Acides nucléiques

*Extraction/Purification des ARNm

Purification des ARNm sur colonne d’affinité (via une séquence oligodT)

ARN totaux purifiés


2 Elution des ARNm
ARNt 1
(A)n3’ Hybridation des ARNm
Par séquences poly(A)n 3
ARNr 5’ ARNm
(dT)n
(A)n
(dT)n Tampon de
(A)n force ionique
Colonne de billes FAIBLE
couplées à
Tampon de (dT)n
force ionique
séquences ELEVEE (A)n
polydT = (dT)n

(dT)n (A)n3’
5’ ARNm

ARNm purifiés
1- Extraction des Acides nucléiques

*Synthèse d'ADNc

Ex: Synthèse d’ADN par la technique de cassure à la Rnase H

5’ AAAA-3’

1 polyT(18) Hybridation
(A)n3’
5’ AAAA-3’ 5’
TTTT-5’ ARNm purifié
Transcriptase dNTP
2 Rétrotranscription
reverse
5’ AAAA-3’
3’ TTTT-5’

ARNm/ADNc
RNase H 3 Cassure ARNm

5’ AAAA-3’
3’ TTTT-5’

ADN dNTP 4 Polymérisation ADN


Polymerase
5’ AAAA-3’
ADNc
3’ TTTT-5’
copie entière
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation

*Quelques généralités:

-- Migration dans un champ électrique du pôle – vers le pôle +


(l’ADN est chargé – en raison des groupements phosphates)
- dans un seul champ électrique si fragments < 20kpb (migration dans une seule
direction)
- dans plusieurs champs électriques d’orientation variable (champs pulsé)
si fragments >20kbp (ex: migration bidirectionnelle en zig-zag)

- Séparation des fragments en fonction de leur taille:


- le plus souvent dans un gel d’agarose (gel horizontal de 0,6 à 2%) selon la taille des
fragments à séparer ou à visualiser (Ex: Southern blot, analyse de fragments PCR)
- dans l’acrylamide si petits fragments (<100pb) ou si besoin d’être très résolutif
dans la séparation de fragments (Ex: séquençage de l’ADN; détection de mutation par méthodes
dérivées de la PCR)

- La coloration des AN s’effectue par ajout d’un intercalant de l’ADN


(ATTENTION: si bromure d’éthidium (BET) comme intercalant de l’ADN; toxique) et leur
visualisation sous les U.V.
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation

*Electrophorèses classique (ADN ou ARN) ou en champ pulsé (ADN)

1 orientation
de migration
Electrophorèse classique
Electrophorèse en Champ pulsé

puits de dépôt de
l’échantillon d’ADN
à analyser
2 orientations
de migration
Fragment d’ADN

Gel 1% d’agarose
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation

*Séparation électrophorétique d’ARN totaux

Contrôle de la
qualité de
l’extraction des
ARN totaux d’un
tissu (en vue
d’une purification
ARNm des ARNm) par
visualisation de
l’intégrité des
ARN 28S et 18S.
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation

*Séparation électrophorétique de fragments d'ADN issus d'une


fragmentation du génome par une enzyme de restriction (ER)

Étalons de Génome digéré par


différentes ER
- PM
Digestion par une ER E E
E
E E
E E E
ADN
génomique
purifié
Le gel d’agarose permet d’analyser la
fragmentation de génomes entiers
par des enzymes de restriction (ER)
dans la perspective:
-d’identifier un gène dans un génome
et d’étudier son organisation
+
génomique (simple copie, multicopie)
Fragmentation d’un génome par hybridation moléculaire
par des enzymes de restriction (Southern blot)
(Ex: Southern blot)
3- Fragmentation de l’ADN

*Méthodes de fragmentation de l'ADN

ADN génomique purifié

La plupart des génomes sont beaucoup trop grands (>109pb)


pour être analysés en un seul morceau. Il faut les fragmenter

COUPURE MECANIQUE COUPURE ENZYMATIQUE PAR LES


(coupure aléatoire = shotgun) ENZYMES DE RESTRICTION
(coupure à des sites définis)

E E
E
E E
E E E
3- Fragmentation de l’ADN

*Les enzymes de restriction de type II

=> Quelques généralités sur les ER:

définition : Endonucléases d’origine procaryotique coupant de manière définie


et reproductible l’ADN double brin quelle que soit son origine.

Action: Réduisent de manière reproductible un génome entier à une série de


fragments caractéristiques d’un ADN donné.

ER de type II : une fois la séquence reconnue, l’enzyme coupe l’ADN double brin au niveau
du site de reconnaissance. Il en existe des centaines (commercialisées).

nomenclature des ER de type II:


Genre Souche
EcoRI (première découverte)
Escherichia coli Ry13
Espèce
EcoRV (cinquième)
3- Fragmentation de l’ADN

*Les enzymes de restriction de type II

=> les sites de reconnaissance des ER de type II:

- séquences courtes (entre 4 et 8 pb)


- séquences palindromiques:

5’-GAATTC-3’ 5’-GGCC-3’
EcoRI HaeIII
3’-CTTAAG-5’ 3’-CCGG-5’

- les flèches indiquent le site de coupure sur les 2 brins

- la spécificité de reconnaissance des séquences est le plus souvent absolue


mais pas toujours:
5’-GGNCC-3’
NspIV 3’-CCNGG-5’

N signifie A,C,G ou T
3- Fragmentation de l’ADN

*Les enzymes de restriction de type II

=> Analyse de la méthylation de l'ADN par des isoschizomères :

quand une base peut être méthylée par une méthylase bactérienne,
elle est repérée par une astérisque:

5’-CC GG-3’
HpaII
3’-GG CC-5’

-des isoschizomères sont 2 enzymes de restrictions qui reconnaissent


une même séquence mais une des enzyme est sensible à la méthylation
(ne coupe pas si méthylée). L’autre enzyme coupe l’ADN qu’il soit méthylé ou pas.

5’-CCGG-3’
HpaII et MspI
3’-GGCC-5’
3- Fragmentation de l’ADN

*Les enzymes de restriction de type II

=> Les différents types de coupure des ER de type II:


- Libération d’extrémités franches (blunt or flush ends):

5’-GGCC-3’ 5’-GG CC-3’


HaeIII 3’-CCGG-5’ 3’-CC + GG-5’

- Libération d’extrémités cohésives (décalées ou protrusives):

- 3’ cohésives: - 5’ cohésives:

5’-GAATTC-3’ 5’-CGATCG-3’
EcoRI PvuII
3’-CTTAAG-5’ 3’-GCTAGC-5’

5’-G
+ AATTC-3’ 5’-CGAT
3’-CTTAA G-5’
3’-GC + CG-3’
TAGC-5’
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)

*les 2 ADN sont coupés par une même ER


1

2
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)

*les 2 ADN sont coupés par une même ER

ADN LIGASE: enzyme qui


assure la formation d’une
liaison phosphodiester entre
une extrémité 3’OH et 5’P
de 2 désoxyribonucléotides

=> Après ligature, l’ADN1


se retrouve entre 2 sites
de restriction reconstitués
par complémentarité des
extrémités
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)
*L’efficacité de ligature d’un ADN sur un vecteur n’est jamais de 100%

ori
SCM= Site de clonage de l’ADNc
pUC

AmpR

-Digestion du plasmide par ER


- Déphosphorylation des extrémités (phosphatase alcaline)
-ligature de l’ADNc au vecteur par ADN ligase
ER

ori ER
ori
Vecteur Vecteur non
recombinant pUC ET
pUC recombinant
(R) (NR)
AmpR AmpR

=> tout clonage nécessitera un système de discrimination (= sélection)


4--Ligature
Ligaturede
de22ADNs
ADNsdifférents
différents(dans
(dans une
une stratégie de clonage
stratégie de
d’un ADN d’un
clonage sur un
ADNvecteur)
sur un vecteur)

1- ligature de 2 ADN coupés par 2- ligature de 2 ADN coupés


la même ER : par des ER différentes:

- que les extémités libérées soient => si coupures franches:


franches ou cohésives, on pourra - on pourra toujours ligaturer les 2
toujours ligaturer ces 2 ADN ADN
(avantage). - Cependant on ne reconstitue pas
les sites de restriction initiaux sur la
- on reconstitue le site de restriction molécule chimère (inconvénient).
initial sur la molécule chimère
(avantage) :
=> donc possibilité de le ressortir du
vecteur1 pour le ligaturer sur un autre
vecteur (sous-clonage) => Si coupures cohésives :
- on ne pourra ligaturer ces 2 ADN que si 1
- L’ADN cloné sur le vecteur se des 2 sites est contenu dans l’autre, par
retrouve entre 2 sites de restriction complémentarité des
identiques : désoxyribonucléotides
=> l'ADN peut être cloné dans 2 dans la région simple brin.
orientations (inconvénient si objectif (inconvénient).
est de produire une protéine
recombinante)
5- Vecteurs de clonage

*Généralités

Définition : c’est un système qui permet le transfert, l’expression et la réplication d’un ADN
étranger dans des cellules-hôtes (en vue d’un clonage d’ADN, d’une transgénèse, d’une
thérapie génique, d’un séquençage, etc…).

Choix du vecteur de clonage: Le choix d’un vecteur pour une opération de clonage dépendra
de l’ADN étranger à insérer (compatibilité de taille et d’extrémités) et de l’application
(cartograghie et séquençage de génome, expression de protéine thérapeutique dans une
bactérie, thérapie génique,…)

Quelques
vecteurs de
clonage:

(*) Les vecteurs dont on parlera en DFGSP2, notamment les plasmides


5- Vecteurs de clonage

*Généralités

Propriétés générales des vecteurs de clonage

-Réplication autonome (ori), le plus stable possible et sa présence ne doit pas perturber la
cellule hôte

-présence de marqueurs de sélection (gène de résistance aux antibiotique, gène lacZ,…)


qui permettront de différencier des bactéries porteuses d’un vecteur recombinant ou non
recombinant (par colorimétrie ou sur antibiotique).

-doit posséder un SCM (site de clonage multiple) constitué d’une succession de site unique
de coupure par des enzymes de restriction. Ce SCM est l’endroit où l’ADN à cloner sera
inséré. Le SCM est localisé dans un marqueur de sélection.

-doit être facilement isolable sous forme pure et en quantité illimitée

- le plus petit possible (favorise insertion d’ADN plus grands, manipulation plus facile,
augmente le nombre de copie par cellule car plus facile à répliquer)
5- Vecteurs de clonage

*Les plasmides

Caracéristiques générales
- ADN double brin extrachromosomique

-d’origine procaryotique

- existe naturellement dans les bactéries (=


1ère génération)

- il en existe maintenant de nombreux artifiels


(2ème et 3ème génération)

Couramment utilisés dans les stratégies de


clonage simple (en vue de production de
protéine recombinantes, pour le séquençage
d'un gène , pour la sélection d'un gène dans
une banque d'ADN, etc)
Cliché D. Dressier
5- Vecteurs de clonage
Caractéristiques
*Les plasmides
majeuresdu plasmide
pBluescript:
Exemple d’un plasmide artificiel
de 3ème génération 1-1- Présence d’un site de
clonage multiple (SCM =
MCS ou polylinker)

lacZa 2-2- Présence de


promoteurs (T3 ou T7
2 ou SP6,…) de part et
d’autre du SCM
3 4
1 - Présence de marqueurs
de sélection:
-Présence d’un gène
2 3 de résistance à un
antibiotique
-Présence du gène
lacZa (peptide de
4 lagalactosidase)

=> couramment utilisé pour la sélection colorimétrique


de vecteurs recombinants (Cf TP BioMol1)
5- Vecteurs de clonage
*Les plasmides
Le SCM: 1

- Succession de site de
restriction unique

- nombre et séquence des


sites de restriction variable
1 d’un plasmide à l’autre
SCM
- plus il contient de site de
restriction et plus il sera
lacZa facile de cloner n’importe
quel ADN

-Le SMC est inséré dans


un marqueur de sélection

C’est l’endroit où on ouvre le vecteur par une enzyme de restriction


pour y cloner 1 ADN étranger (d’extrémités et de taille compatibles)
5- Vecteurs de clonage

*Les plasmides Les séquences promotrices 2

=> localisation des séquences


promotrices de part et d’autre du SCM
(donc de l'insert) Faciliteront l’analyse des vecteurs
recombinants et de l'ADN cloné
=> serviront de régions d'hybridation (insert)
d'amorces (PCR, séquençage, production
d'ARNm à grande échelle)
5- Vecteurs de clonage

*Les plasmides Les marqueurs de sélection:


(Ex: pBluescript ; Cf TP1 BioMol)

3 4

gène de résistance 4 -gène lacZa (peptide 


à un antibiotique 3 de la -galactosidase)

Elimination des Discrimination colorimétrique des


bactéries non bactéries transformées (via
transformées mécanisme d’-complémentation)
contenant soit :
- un plasmide recombinant (blanche)
- Un plasmide non recombinant (bleue)

Serviront à la sélection des bactéries recombinantes d’intérêt (avec vecteur recombinant


portant le gène d’intérêt cloné)
6- La transformation bactérienne

*Généralités

Objectif : Consiste à faire entrer le plasmide recombinant (porteur du gène


d’intérêt) dans une cellule hôte (bactérie le plus souvent car simple d'utilisation) où
il pourra se répliquer (en grande quantité et sera clonal)

=> Ce n'est pas un phénomène naturel donc :


- on devra fragiliser la paroi bactérienne pour faciliter l'entrée du plasmide (=
bactéries compétentes)
- on utilisera des méthodes physico-chimiques (choc thermique de 0->42°C, choc
électrique=électroporation) pour faire entrer l'ADN plasmidique

=> L' efficacité de la ligature ADN/plasmide n'étant pas de 100 %, on n'aura


également pas d'efficacité de transformation de vecteur recombinant de 100 % (des
bactéries ne seront pas transformées et parmi les bactéries transformées on aura
des bactéries transformées par un vecteur non recombinant et d'autres par un
vecteur recombinant).

=> Il faudra donc un système de sélection double capable de discriminer à la fois :


- les bactéries transformées des bactéries non transformées (via gène de résistance à
un antibiotique)
- les bactéries transformées par un vecteur recombinant ou non recombinant (via
du gène lacZa)
6- La transformation bactérienne
* Préparation de Bactéries compétentes

Bactéries
(Escherichia coli) Paroi bactérienne
intacte

ADN bactérien

paroi fragilisée
(par CaCl2 par exemple)
pour faciliter l’entrée du
vecteur

Bactéries compétentes

Paroi bactérienne
=> Bactéries aptes à recevoir de fragilisée
l’ADN étranger
6- La transformation bactérienne
* Transformation des bactéries compétentes
Résultat de la ligature
Bactéries compétentes ADN/vecteur
(Escherichia coli)

Méthodes physico-chimiques:
Choc thermique (0=>42°C) ou
électrique (électroporation) (L’efficacité de ligature d’un ADN
sur un vecteur n’est jamais de
100%)

 Bactéries
transformées
Recombinantes
à sélectionner

Bactéries non
Bactéries transformées transformées

=> L’efficacité de la transformation n’est jamais de 100%


7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

* L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)

Biologie et Multimédia -
Université
Pierre et Marie Curie
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

* L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)


7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

*Le mécanisme d' -complémentation

- dans OPERON LACTOSE BACTERIEN :

gène lacZ -galactosidase Enzy+(substrat: lactose)

- LORS OPERATION CLONAGE MOLECULAIRE:




-Gène lacZ présent -Gène lacZ présent
sur un vecteur sur le génome
bactérien lac- des bactéries
à transformer:

Peptide  Enzy- Peptide Enzy-

-complémentation Enzy+ (substrat: X-gal)


 On restaure l’activité enzymatique lors d’une association 
(-> par contre l’activité enzymatique ne sera pas restaurée si  modifié par
insertion d’un gène dans lacZ (=> plus d’association 
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

*Le mécanisme d' -complémentation


=> par contre l’activité enzymatique n’est pas restaurée si  modifié par
insertion d’un gène (plus d’association 

PAS de -galactosidase
(Enzy-)

Transformation association 


bactérienne
=>-galactosidase
AVEC activité
enzymatique (Enzy+)
(en présence
X-gal/IPTG/Ampicilline)

PAS d'association Rec


A sélectionner
=> PAS de -galactosidase donc
=> PAS d'activité
enzymatique (Enzy-)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

*Phénotypes bactériens en présence d'X-gal/IPTG/Ampicilline

Blanche (Enzy-), AmpS

3 phénotypes
Bleue (Enzy+), AmpR distincts
DONC REC
différentiable
des deux
autres types

Blanche (Enzy-), AmpR


A sélectionner
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

*Rôle de l'X-gal (en présence d'IPTG)


=> C'est le SUBSTRAT (incolore) de la -galactosidase dans ce système de sélection

X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl bD galactopyranoside)


(SUBSTRAT incolore)

Association  PAS d'association Rec

 Protéine codée 
-galactosidase par l’ADNc
 
NORMALE Peptide Rec Peptide 

Bromo-chloro-indol
(BLEU)
Colonies bactériennes
BLANCHES
Colonies bactériennes
(PAS d’-complémentation)
BLEUES
(-complémentation)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
*Rôle de l'IPTG (Isopropyl D thyogalactopyranoside)
=> analogue non métabolisable du lactose qui induiera la synthèse du peptide  ou Rec

Cas 1: Absence d’IPTG Cas 2: présence d’IPTG

TRANSCRIPTION/TRADUCTION TRANSCRIPTION/TRADUCTION
BLOQUEE OUVERTE
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

*Sélection d’un clone à analyser:


Culture sur boite de
pétri LB+Ampicilline
Colonie bactérienne + IPTG et X-gal
blanche : n bactéries 1
transformées par le même Analyse de l’insert
vecteur recombinant 2
3

Prélèvement et 7 5
Multiplication en 4
culture liquide + Ampi
6

Extraction du plasmide
(miniprep)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)

*Succès du clonage (nombre de clones à obtenir):

1- Clonage d’un fragment d’ADN unique 2- Banque (clonage de n fragments d’ADN)

1
2 1
3 2
3
7 5
4 7 5
4
6
6
Tous les clones blancs
Les clones blancs 1, 2, 4, 6 et 7
contiennent le même insert
peuvent contenir des inserts différents

1 CLONE BLANC SUFFIT > 95% BLANCS


8- Banques d’ADN
*Généralités

Une banque d’ADN (library) : correspond à un ensemble


de clones cellulaires (bactéries, levures,…) où chaque
cellule renferme un exemplaire différent d’ADN
recombiné à un vecteur.

La construction d’une banque : dépendra de ce que l’on recherche


- ADN génomique
- exons, introns, séquences régulatrices des gènes
- tout type cellulaire (exception : cellules de l’immunité)
- ADNc (complémentaire)
- exons des gènes
- il existe une spécificité tissulaire

=> Une banque d’ADN contiendra donc, sous forme morcelée,


l’ensemble de l’information génétique (ADNg ou ARNm matures via
ADNc) d’un individu telle qu’elle existe dans son génome.
8- Banques d’ADN
*Exemple de construction d'une banque d'expression plasmidique
Ex:

ADNc1 ADNc2 ADNc3 ADNc4 ADNc5 ADNcn

Clonage dans vecteur plasmidique au niveau de lacZ

pUC pUC pUC pUC pUC pUC


AmpR
Transformation bactérienne

n BACTERIES RECOMBINANTES CONTENANT


UN SEUL PLASMIDE RECOMBINANT
8- Banques d’ADN Exemple : Banque de 1536
*Stockage des clones d'une banque clones bactériens (16
plaques de 96 puits
(ou 4 plaques de 384 puits)
Clones bactériens
Sur boite de pétri

Clones bactériens
Sur plaques 96puits
(ou 384 puits)

ADN plasmidiques
extraits des Clones
bactériens
sur plaques 96puits
(ou 384 puits)

Exemple : Stockage des


1536 ADN plasmidiques
extraits des 1536 clones
bactériens d'une banque
sur un filtre de Nylon
(chaque clone est déposé
en duplica)
8- Banques d’ADN

*Criblage des clones d'une banque


=> Consiste en la sélection
d'un clone parmi un ensemble
de clones que constitue la banque

Criblage par PCR à l'aide d'un couple

ABCDEFGH
D'amorces spécifiques d'un gène:

20
réactions 12 Réactions
PCR sur des 8 Réactions
PCR PCR sur
permettent mélanges de des mélanges
l’analyse colonnes (8 de lignes (12
de clones/colonne) clones/ligne)
96 clones

=> Clone positif en position F4 sur la plaque 96 puits


8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque

Criblage par PCR:


8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque

Criblage par PCR (localisation de 2 gènes dans la banque):


8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque

Criblage par hybridation moléculaire


À l'aide d'une sonde

Exemple : Banque de
1536 ADN plasmidiques
extraits des 1536 clones
bactériens d'une banque
sur un filtre de Nylon
(chaque clone est déposé
en duplica)

hybridation avec une


sonde

Résultat : donne la
localisation du gène étudié
dans la banque d'ADN
8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque

Criblage par hybridation moléculaire


À l'aide de plusieurs sondes distinctes

Exemple : Banque de
Sonde 1 1536 ADN plasmidiques
extraits des 1536 clones
bactériens d'une banque
sur un filtre de Nylon
(chaque clone est déposé
en duplica)

Sonde 2

Résultats : Les gènes 1 et 2 sont localisés dans les


mêmes régions génomiques (organisation génomique en
tandem)
8- Banques d’ADN
* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage

=> les fragments d'ADN séquencés constituent des banques d'ADN (de grands
(vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)
8- Banques d’ADN
* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage

=> les fragments d'ADN séquencés constituent des banques d'ADN (de grands
(vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)
8- Banques d’ADN
* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage

Quelques objectifs d'analyse de


Diversité chez les individus
d'une même espèce

- identifier les mutations


impliquées dans maladies
(entre autre)

- étudier la relation facteurs


environnementaux, gènes
et maladies
- mise au point de kits génétiques pour le grand public
(« médecine » prédictive ou personnalisée)
I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)

II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES

III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)

IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES


MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation
- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)
- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)
- Transformation bactérienne
- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)
- Banque d’ADN

B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE


1/ Production de protéines thérapeutiques recombinantes
- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)
- par des animaux ou végétaux transgéniques
2/ Production de protéines thérapeutiques in situ
les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)
- les vecteurs viraux
- les vecteurs non viraux
2.1/ Thérapie génique (ADN médicament)
2.2/ Injection ADN nu
3/ Le clonage reproductif et thérapeutique
4/ Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9
I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)

II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES

III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)

IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES


MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation
- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)
- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)
- Transformation bactérienne
- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)
- Banque d’ADN

B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE


- Production de protéines thérapeutiques recombinantes
- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)
- par des animaux ou végétaux transgéniques
- Thérapie génique (ADN médicament)
- les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)
- les vecteurs viraux
- les vecteurs non viraux
-Clonage reproductif et thérapeutique
- Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9

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