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N° d’ordre : 106-2005 Année 2005

THESE

présentée

devant l’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

pour l’obtention

du DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 25 avril 2002)

présentée et soutenue publiquement le 30 juin 2005

par

Melle Sandrine BAYLE

7UDLWHPHQWG¶HIIOXHQWVJD]HX[FKDUJpVHQFRPSRVpVRUJDQLTXHVYRODWLOVSDU
R[\GDWLRQELRORJLTXHDSSURFKHpFRORJLTXHGHVFRPPXQDXWpVPLFURELHQQHV

Directeur de thèse :
M. J.-L. Fanlo,
Professeur des Ecoles des Mines

JURY :

M. R. Auria Directeur de recherche, IRD


M. P. Lemanceau Directeur de recherche, INRA
M. J.-L. Fanlo Professeur des Ecoles des Mines
M. P. Potier Professeur, Université Claude Bernard Lyon I
M. J.-J. Godon Directeur de recherche, INRA
M. L. Malhautier Enseignant-Chercheur Ecole des Mines
Mme V. Degrange Maître de conférence, Université Lyon I
N° d’ ordre : 106-2005 Année 2005

THESE

présentée

devant l’ UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

pour l’ obtention

du DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 25 avril 2002)

présentée et soutenue publiquement le 30 juin 2005

par

Melle Sandrine BAYLE

7UDLWHPHQWG¶HIIOXHQWVJD]HX[FKDUJpVHQFRPSRVpVRUJDQLTXHVYRODWLOVSDU
R[\GDWLRQELRORJLTXHDSSURFKHpFRORJLTXHGHVFRPPXQDXWpVPLFURELHQQHV

Directeur de thèse :
M. J.-L. Fanlo,
Professeur des Ecoles des Mines

JURY :

M. R. Auria Directeur de recherche, IRD


M. P. Lemanceau Directeur de recherche, INRA
M. J.-L. Fanlo Professeur des Ecoles des Mines
M. P. Potier Professeur, Université Claude Bernard Lyon I
M. J.-J. Godon Directeur de recherche, INRA
M. L. Malhautier Enseignant-Chercheur Ecole des Mines
Mme V. Degrange Maître de conférence, Université Lyon I
81,9(56,7(&/$8'(%(51$5'/<21,

3UpVLGHQWGHO¶8QLYHUVLWp 0OH3URIHVVHXU''(%28=,(
Vice-Président du Conseil Scientifique M. le Professeur J.F. MORNEX
Vice-Président du Conseil d’ Administration M. le Professeur R. GARRONE
Vice-Présidente du Conseil des Etudes et de la M. le Professeur G. ANNAT
Vie Universitaire
Secrétaire Général M. J.P. BONHOTAL

SECTEUR SANTE

&RPSRVDQWHV

UFR de Médecine Lyon R.T.H. Laënnec Directeur : M. le Professeur D. VITAL-DURAND


UFR de Médecine Lyon Grange-Blanche Directeur : M. le Professeur X. MARTIN
UFR de Médecine Lyon-Nord Directeur : M. le Professeur F. MAUGUIERE
UFR de Médecine Lyon-Sud Directeur : M. le Professeur F.N. GILLY
UFR d’ Odontologie Directeur : M. O. ROBIN Maître de Conférences
Institut des Sciences Pharmaceutiques et Directeur : M. le Professeur F. LOCHER
Biologiques
Institut Techniques de Réadaptation Directeur : M. le Professeur L. COLLET
Département de Formation et Centre de Directeur : M. le Professeur P. FARGE
Recherche en Biologie Humaine
Département de Formation à la Recherche et à Directeur : M. le Professeur M. LAVILLE
l’ Evaluation Pédagogiques

SECTEUR SCIENCES

&RPSRVDQWHV

UFR de Physique Directeur : M. le Professeur J.L. VIALLE


UFR de Biologie Directeur : M. le Professeur H. PINON
UFR de Mécanique Directeur : M. le Professeur H. BEN HADID
UFR de Génie Electrique et des Procédés Directeur : M. le Professeur A. BRIGUET
UFR Sciences de la Terre Directeur : M. le Professeur P. HANTZPERGUE
UFR de Mathématiques Directeur : M. le Professeur M. CHAMARIE
UFR d’ Informatique Directeur : M. le Professeur M. EGEA
UFR de Chimie Biochimie Directeur : M. le Professeur J.P. SCHARFF
UFR STAPS Directeur : M. le Professeur R. MASSARELLI
Observatoire de Lyon Directeur : M. le Professeur R. BACON
Institut des Sciences et des Techniques de
l’ Ingénieur de Lyon Directeur : M. le Professeur J.P. PUAUX
Département de 1er cycle Sciences Directeur : M. J.C. DUPLAN Maître de Conférences
IUT A Directeur : M. le Professeur M. ODIN
IUT B Directeur : M. le Professeur G. MAREST
Institut de Science Financière et d'
Assurances Directeur : M. le Professeur J.C. AUGROS
28/04/04

4
L’ homme cherche à percer les secrets de l’ univers comme s’ il l’ observait de l’ extérieur,
comme s’ il en dominait la perspective. Il pense recenser les mécanismes de la vie alors qu’ il
est un agent, une manifestation de cette vie. Il est limité. Il n’ a pas toutes les données du
problème en main. On n’ explique pas un phénomène lorsqu’ on est soi-même une expression
de ce phénomène ! C’ est absurde. En tout cas, sa vue est condamnée à demeurer fragmentaire,
incomplète.
Romain Sardou, /¶(FODWGH'LHX

1
Remerciements
Je tiens à remercier les membres du jury pour m’ avoir fait l’ honneur de juger et de corriger ce
travail. Que messieurs Richard Auria et Philippe Lemanceau trouvent ici toute ma
reconnaissance pour en avoir été les rapporteurs. Toute ma gratitude va à Monsieur le
Professeur Patrick Potier qui a accepté de présider ce jury.

Que Monsieur Jean- Jacques Godon, Directeur de recherche et Mlle Valérie Degrange, Maître
de Conférence, trouve ici toute ma reconnaissance. Je vous remercie pour votre précieuse aide
scientifique, et votre sympathie au long de ces années.

Je remercie une nouvelle fois Jean- Jacques Godon pour m’ avoir accueilli plusieurs mois au
sein de son équipe au laboratoire Biotechnologie de l’ environnement de l’ INRA et pour sa
grande disponibilité.

Mes remerciements s’ adressent également à messieurs Pugnère et Dorison pour m’ avoir


accueilli à l’ Ecole des Mines d’ Alès. Ainsi que monsieur le Professeur Olivier Thomas pour
son accueil au sein du laboratoire Génie de l’ Environnement Industriel.

Je remercie Monsieur le Professeur Jean-Louis Fanlo pour la confiance qu’ il m’ a accordée. Je


tiens également à remercier Monsieur Luc Malhautier, pour sa disponibilité et pour avoir suivi
ce travail avec intérêt.

Je ne serais oublier Monsieur Patrick Dabert, chargé de recherche, pour sa gentillesse, sa


disponibilité et ses conseils pour ARB, ainsi que Hugues Sylvain pour la réalisation des
macros, Pierre Alain Ayral et Rosario Spinelli (Alias Roro) pour leur aide lors du domptage
du Pingouin, malheureusement il n’ obéit pas toujours. Que Mesdames Valérie Bru et Muriel
Avezac soit également remercier pour disponibilité et de leur aide.

Merci aux membres du LGEI pour avoir su crée un espace de travail agréable. Merci aux
thésards Stéphane, François, Fred, Chloé, Romain, Sandrine, Franck, Pierre Alain, Delphine,
Benoît, Philippe, Daas, Estelle et Pierre-Antoine, Nadia, et aux Spi pour les moments de
détente, leur soutien. Merci Steph pour la relecture du manuscrit.
Une pensée particulière pour Charlotte, et Cathou merci à vous pour votre soutien et votre
présence dans les moments difficiles.

Finalement, il y a des gens sans qui, même s’ ils n’ ont pas joué un rôle direct dans le
travail, je n’ y serais jamais arrivée. Avant tout, ma famille qui m’ a toujours encouragée à aller
au bout de moi même…mais aussi mes amis (plusieurs ont déjà été cités). Sans vous, il est
clair que je n’ aurais jamais pu achever ce travail. Merci.

Sandrine Bayle

1
7DEOHGHVPDWLqUHV
Table des matières
Liste des abréviations

,QWURGXFWLRQJpQpUDOH  

&KDSLWUH,6\QWKqVHELEOLRJUDSKLTXH/DGLYHUVLWpPLFURELHQQHDXVHLQGH
SURFpGpVELRORJLTXHVGHWUDLWHPHQWGHV&RPSRVpV2UJDQLTXHV9RODWLOV  

I.1. Introduction ..................................................................................................................... 10


I.2. COV ................................................................................................................................ 10
I.2.1. Nature, source et impact des COV.......................................................................... 10
I.2.1.1. Définition..................................................................................................... 10
I.2.1.2. Sources......................................................................................................... 12
I.2.1.3. Impacts des COV ......................................................................................... 13
I.2.2. Réduction des émissions......................................................................................... 15
I.2.2.1. Législation ................................................................................................... 15
I.2.2.2. Procédés de traitement.................................................................................. 16
I.3. Procédés biologiques ....................................................................................................... 19
I.3.1. Introduction............................................................................................................ 19
I.3.2. Configurations des procédés biologiques................................................................ 20
I.3.2.1. Biofiltres ...................................................................................................... 20
I.3.2.2. Filtres percolateurs ....................................................................................... 20
I.3.2.3. Laveurs biologiques ..................................................................................... 20
I.3.2.4. Bilan ............................................................................................................ 21
I.3.3. Evolution de l’ efficacité d’ un procédé biologique................................................... 22
I.3.4. Paramètres opératoires ........................................................................................... 24
I.3.4.1. Concentration des polluants de l’ effluent à traiter ......................................... 24
I.3.4.2. Paramètres physico-chimiques...................................................................... 24
I.3.5. Etude de la microflore ............................................................................................ 26
I.4. Techniques d’ étude de la microbiologie des procédés ...................................................... 28
I.4.1. Techniques d’ étude de la diversité classiques, biochimiques et moléculaires .......... 28
I.4.1.1. Mise en place (Atlas et Bartha, 1997a) ......................................................... 28
I.4.1.2. Développement des méthodes moléculaires .................................................. 28
I.4.2. Méthode Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) ................................ 31
I.4.3. Quantification de la diversité.................................................................................. 32
I.4.3.1. Caractérisation classique de la diversité........................................................ 32
I.4.3.2. Autres méthodes de caractérisation de la diversité ........................................ 35
I.4.4. Classification de la diversité................................................................................... 36
I.4.5. Etude du fonctionnement des écosystèmes ............................................................. 37
I.5. Ecologie microbienne des procédés de traitement de l’ air................................................. 41
I.5.1. Structure de la communauté bactérienne dans les boues activées ............................ 41
I.5.2. Dégradation des COV ............................................................................................ 45
I.5.2.1. Interaction entre les substrats........................................................................ 45
I.5.2.2. Diversité bactérienne dégradant les COV ..................................................... 47
I.5.3. Evolution des communautés microbiennes ............................................................. 48
I.6. Conclusion....................................................................................................................... 50

1
&KDSLWUH,,(IIHWGHODFKDUJHYROXPLTXHVXUOHIRQFWLRQQHPHQWGHOD
PLFURIORUHDXVHLQGHUpDFWHXUVDpURELHV  

II.1. Introduction .................................................................................................................... 54


II.2. Matériels et méthodes ..................................................................................................... 56
II.2.1. Dispositif expérimental ......................................................................................... 56
II.2.2. Alimentation du réacteur....................................................................................... 57
II.2.2.1. Polluants ..................................................................................................... 57
II.2.2.2. Composition de l’ effluent............................................................................ 58
II.2.3. Caractérisation de la microflore............................................................................. 59
II.2.3.1. Activité de biodégradation .......................................................................... 59
II.2.3.2. Dénombrements .......................................................................................... 61
II.2.3.3. Structure de la communauté microbienne .................................................... 62
II.3. Résultats ......................................................................................................................... 67
II.3.1. Activité de biodégradation globale des réacteurs ................................................... 68
II.3.2. Période 1 : fonctionnement de la microflore en conditions stables ......................... 69
II.3.2.1. Activité de biodégradation .......................................................................... 69
II.3.2.2. Densités bactériennes .................................................................................. 73
II.3.2.2. Structure des communautés microbiennes ................................................... 74
II.3.3. Période 2 : effet de fluctuations de la composition de l’ effluent gazeux sur le
fonctionnement de la microflore : suppression des esters...................................... 78
II.3.3.1. Activité de biodégradation .......................................................................... 78
II.3.3.2. Densités bactériennes .................................................................................. 81
II.3.3.3. Structure des communautés microbiennes ................................................... 82
II.3.4. Période 3 : effet de fluctuations de la composition de l’ effluent gazeux sur le
fonctionnement de la microflore : diminution de la concentration des composés
oxygénés.............................................................................................................. 84
II.3.4.1. Activité de biodégradation .......................................................................... 84
II.3.4.2. Densités bactériennes .................................................................................. 86
II.3.4.3. Structure des communautés microbiennes ................................................... 87
II.3.5. Période 4 : effet de fluctuations de la composition de l’ effluent gazeux sur le
fonctionnement de la microflore : augmentation de la concentration des composés
oxygénés.............................................................................................................. 90
II.3.5.1. Activité de biodégradation .......................................................................... 90
II.3.5.2. Densités bactériennes .................................................................................. 94
II.3.5.3. Structure des communautés microbiennes ................................................... 94
II.3.6. Caractérisation de la communauté bactérienne présente dans un réacteur dégradant
un mélange de onze COV .................................................................................... 97
II.4. Discussion .................................................................................................................... 100
II.4.1. Préliminaires méthodologiques ........................................................................... 100
II.4.1.1. Densités bactériennes ................................................................................ 100
II.4.1.2. Concentration des COV dans les boues ..................................................... 101
II.4.2. Comparaison des réacteurs pour une même période ............................................ 103
II.4.2.1. Période 1 : fonctionnement de la microflore en conditions stables ............. 103
II.4.2.2. Influence des fluctuations de composition de l’ effluent sur le fonctionnement
de la microflore : diminution de la charge volumique appliquée ............................. 107
II.4.2.3. Influence des fluctuations de composition de l’ effluent sur le fonctionnement
de la microflore : augmentation de la charge volumique appliquée ......................... 110
II.4.3. Cas particulier de la flore eucaryote .................................................................... 114
II.4.4. Flore dégradant un mélange de onze COV .......................................................... 115

2
II.4.5. Application industrielle....................................................................................... 116
II.4.5.1. Efficacité d’ élimination............................................................................. 116
II.4.5.2. Atteinte des performances maximales ....................................................... 117
II.4.5.3. Conséquences sur l’ étape d’ acclimatation ................................................. 117
II.5. Conclusion ................................................................................................................... 118

&KDSLWUH,,,,PSDFWGHSHUWXUEDWLRQVVXUOHIRQFWLRQQHPHQWGHODPLFURIORUH
)OH[LELOLWpGHVUpDFWHXUVHQUHODWLRQDYHFODVWUXFWXUHGHODPLFURIORUH  

III.1. Introduction................................................................................................................. 120


A. Etude de l’ impact de perturbations par introduction séquentielle des composés sur le
fonctionnement de la microflore ........................................................................................ 122

III.2. Matériels et méthodes.................................................................................................. 122


III.2.1. Dispositif expérimental...................................................................................... 122
III.2.2. Composition de l’ effluent .................................................................................. 123
III.2.3. Caractérisation de la microflore ......................................................................... 124
III.2.3.1. Paramètres du suivi.................................................................................. 124
III.2.3.2. Assignation des pics SSCP...................................................................... 125
III.3. Résultats...................................................................................................................... 127
III.3.1. Période 1 : Elimination des composés chlorés .................................................... 127
III.3.1.1. Activité de biodégradation ....................................................................... 127
III.3.1.2. Densités bactériennes............................................................................... 128
III.3.1.3. Structure des communautés microbiennes ................................................ 129
III.3.2. Période 2 : Addition des composés aromatiques dans le réacteur S..................... 131
III.3.2.1. Activité de biodégradation ....................................................................... 131
III.3.2.2. Densités bactériennes............................................................................... 134
III.3.2.3. Structure des communautés microbiennes ................................................ 134
III.3.3. Période 3 : Addition des composés oxygénés dans le réacteur S......................... 137
III.3.3.1. Activité de biodégradation ....................................................................... 138
III.3.3.2. Densités bactériennes............................................................................... 142
III.3.3.3. Structure des communautés microbiennes ................................................ 142
III.4. Discussion................................................................................................................... 147
III.4.1. Préliminaire méthodologique : choix du référent................................................ 147
III.4.2. Comparaison de l’ évolution des réacteurs .......................................................... 148
III.4.2.1. Impact des composés chlorés ................................................................... 148
III.4.2.2. Ajout des composés aromatiques ............................................................. 149
III.4.2.3. Ajout des composés oxygénés.................................................................. 151
III.4.3. Cas particuliers de la communauté eucaryote..................................................... 153
III.4.4. Réactivité du système ........................................................................................ 154
III.4.5. Application Industrielle : dégradation des composés récalcitrants ............... 154

3
B. Rôle de l’ histoire de la microflore dans le fonctionnement............................................... 157

III.5. Démarche expérimentale ............................................................................................. 157


III.6. Résultats...................................................................................................................... 159
III.6.1. Activités de biodégradation................................................................................ 159
III.6.1.1. T = 0 à t = 66 jours .................................................................................. 159
III.6.1.2. A partir de t = 66 jours............................................................................. 159
III.6.2. Densités bactériennes......................................................................................... 161
III.6.2.1. T = 0 à t = 66 jours .................................................................................. 161
III.6.2.2. A partir de t = 66 jours............................................................................. 162
III.6.3. Structure du domaine bactérien.......................................................................... 162
III.6.4. Structure du domaine eucaryote ......................................................................... 165
III.7. Discussion................................................................................................................... 167
III.7.1. Deux histoires différentes .................................................................................. 167
III.7.2. Impact de l’ histoire d’ un écosystème ................................................................. 167
III.7.3. Application industrielle...................................................................................... 169
III.8. Conclusion .................................................................................................................. 170

&RQFOXVLRQ*pQpUDOH  

5pIpUHQFHV%LEOLRJUDSKLTXHV  

$QQH[HV 

Table des figures


Table des tableaux

4
$EUpYLDWLRQVXWLOLVpHV

AB : Acétate de n-Butyle
ACP : Analyse en Composante Principale
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNr : Acide DésoxyriboNucléique ribosomal
AE : Acétate d’ Ethyle
ARISA : Automated rRNA Intergenic spacer Analysis
ARN : Acide RiboNucléique
BTEX : Benzène, toluène, éthyl-benzène et xylène
C : Pourcentage de recouvrement (Coverage)
CE : Capacité d’ Elimination
CFB : &\WRSKDJD)OH[LEDFWHU%DFWHURLGHV
entrée du réacteur (g.m-3)
Ci : Concentration des COV à l'
CITEPA : Centre Interprofessionnel Technique d’ Etude sur la Pollution Atmosphérique
Co : Concentration des COV à la sortie du réacteur (g.m-3)
COV : Composés Organiques Volatils
COVNM : Composés Organiques Volatils Non Méthaniques
CTC : 5-cyano 2, 3-ditolyl tetrazolium
d : Richesse de l’ écosystème
DAPI : 4'
,6-diaminido-2-phenylindole
DCE : 1,2- DiChloroEthane
DCM : DiChloroMéthane
Débit H2 : Débit d’ hydrogène
Débit He : Débit d’ hélium
DGGE : Denaturating Gradient Gel Electrophoreses,
dNTP : Désoxynucléotide Tri-Phosphate
EB : Ethylbenzène
EPA : Environmental Protection Agency
FAME : Fatty Acid Methyl Ester
FISH : Fluorescence ,Q6LWX Hybridation
GNS : Green no Sulfur
H : Indice de Shannon-Weaver
HGCGPB : Bactéries Gram Positif avec un pourcentage de bases G et C élevé
INRS : Institut National de Recherche et de Sécurité
J : Equitabilité

5
LGCGPB : Bactéries Gram Positif avec un pourcentage de bases G et C faible
MEC : MéthylEthylCétone
MIBC : MéthylIsoButylCétone
N : Nombre d’ individus
ni : Nombre d’ individus de la ième espèce
PCR : Polymerase Chain Reaction
PFLA : PhosphoLipids Fatty Acids
p-xylène : para-Xylène
Q : Débit du gaz dans le réacteur (m3.h-1)
RADP : Random Amplified DNA Polymorphic
RFLP : Restriction Fragment Lenght Polymorphism
S : Nombre d’ espèces
sec : Seconde
SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism
TGGE : Thermal Gradient Gel Electrophoreses
T-RFLP : Terminal RFLP
Vr : Volume du réacteur (m3 de boues)

6
,QWURGXFWLRQJpQpUDOH
La pollution atmosphérique est l’ une des inquiétudes majeures en termes d’ environnement et de
protection de la planète. La Convention de Rio de Janeiro, signée en 1992, a mobilisé un grand
nombre de pays pour lutter contre l’ augmentation des émissions anthropiques contenant de molécules
naturellement présentes à l’ état de traces dans l’ atmosphère, parmi lesquelles les Composés
Organiques Volatils (COV).

Ces derniers proviennent effectivement d'


émissions naturelles. Cependant, l'
industrialisation a
entraîné une production importante de ces composés, induisant un dérèglement des équilibres
atmosphériques, et notamment la formation d’ ozone troposphérique. Ainsi, afin de faire face à ce
problème et respecter les engagements pris à Rio, une législation de plus en plus stricte est mise en
place afin de limiter leurs émissions. Les industriels s’ orientent vers la mise en œuvre d’ unité de
traitement des effluents gazeux pollués afin de satisfaire aux nouvelles normes de rejet.

Parmi les techniques de traitement disponibles, les procédés biologiques constituent une
alternative intéressante, car respectueuse de l’ environnement et présentant des coûts de
fonctionnement réduits. Cependant, si les réactions microbiennes sont exploitées depuis le début du
siècle dernier dans le cadre de l’ épuration des effluents liquides, l’ utilisation des micro-organismes
pour traiter des effluents gazeux date des années cinquante.

Ainsi l’ Homme a sélectionné des écosystèmes artificiels exploitant la diversité fonctionnelle des
micro-organismes. Le principe de fonctionnement de ces procédés est effectivement basé sur la
capacité de certains micro-organismes à utiliser les COV comme source d’ énergie et de carbone.

Ces procédés biologiques présentent néanmoins des limites d’ application liées essentiellement au
démarrage et au maintien des performances dans le temps. En plus des paramètres physico-chimiques,
la compréhension de la composante microbiologique est nécessaire pour améliorer la gestion de ces
procédés. Aussi, importe-t-il d’ explorer l’ écosystème dans son ensemble en tenant compte des
populations microbiennes présentes, de leur densité, et de la résultante fonctionnelle.

Dans ce cadre, il apparaît particulièrement important de mieux connaître la mise en place de la


communauté microbienne impliquée dans la dégradation des polluants. Cette étape, ou phase de pré-
acclimatation, est généralement réalisée de manière empirique et consiste à alimenter les boues
activées provenant d’ une station de traitement d’ eaux usées avec un effluent gazeux contenant les
polluants à traiter. Néanmoins cette étape soulève des questions :

7
Comment évolue la microflore durant cette phase ? Cette phase d’ enrichissement entraîne-t-elle
une diminution de la diversité microbienne ? Dans la seconde hypothèse, cette diminution est-elle
fonction de la concentration des composés introduits ? Quel est l’ impact de perturbation sur le
fonctionnement de la microflore à l’ issue de cette phase de pré-acclimatation ? Quelle est l’ incidence
du mode d’ introduction des polluants sur l’ évolution de la microflore ?

Par conséquent, les travaux de cette étude sont axés sur le fonctionnement de la microflore au sein
de réacteurs de pré-acclimatation alimentés par un mélange complexe de COV.

Cette étude est scindée en trois chapitres :

Le premier chapitre est consacré à une approche bibliographique. La problématique des émissions
de COV dans l’ atmosphère est présentée, ainsi que les procédés de traitement disponibles. Parmi ces
derniers, les procédés biologiques sont exposés. Ensuite, les méthodes d’ études microbiologiques des
écosystèmes complexes sont recensées. Les principaux résultats se rapportant à l’ étude des
écosystèmes traitant des COV sont alors présentés : la diversité bactérienne colonisant les boues
activées, celle dégradant les COV, ainsi que l’ évolution de la structure des communautés dans les
dispositifs de dépollution de l’ air.

Après la description des unités pilotes mises en oeuvre à l’ échelle du laboratoire et des méthodes
utilisées, le deuxième chapitre étudie l’ impact de la charge polluante, ainsi que des fluctuations de la
composition de l’ effluent à traiter, sur le fonctionnement de l’ écosystème. Ces travaux permettront
également de caractériser un FRQVRUWLXP bactérien présent dans un écosystème dégradant un mélange
complexe de COV.

Le troisième chapitre présente l’ impact de perturbations sur le fonctionnement de la microflore


par l’ introduction successive de polluants selon un ordre croissant de biodégradabilité. Le rôle du
passé de la microflore, et donc sa structure sur le fonctionnement du système, est également discuté.

Pour obtenir ces résultats, la caractérisation qualitative et quantitative de la microflore (bactéries


et eucaryotes), ainsi que l’ efficacité d’ élimination des COV, ont été déterminées au cours du temps au
sein de réacteurs.

8
&KDSLWUH,6\QWKqVHELEOLRJUDSKLTXH/DGLYHUVLWp
PLFURELHQQHDXVHLQGHSURFpGpVELRORJLTXHVGHWUDLWHPHQW
GHV&RPSRVpV2UJDQLTXHV9RODWLOV

9
,,QWURGXFWLRQ
En matière environnementale, la pollution atmosphérique est devenue une préoccupation majeure
des sociétés industrialisées. L’ approfondissement des connaissances sur les effets nocifs des polluants
gazeux, a conduit les législateurs à :
i) Créer des centres de surveillance des émissions. En France, le CITEPA (Centre
Interprofessionnel Technique d’ Etude sur la Pollution Atmosphérique) a été créé en 1961.
Il réalise chaque année des inventaires d’ émissions des polluants atmosphériques.
ii) Mettre en place une réglementation de plus en plus stricte.
Parmi les polluants atmosphériques contrôlés, le groupe des COV fait l’ objet d’ une attention
particulière.

Pour traiter les effluents gazeux chargés en COV d’ origine industrielle, l’ utilisation de procédés
biologiques constitue une alternative intéressante aux procédés physico-chimiques dans le cas de rejets
à fort débit contenant de faibles teneurs en polluants. Les COV sont détruits par l’ action des micro-
organismes et cette technique présente des coûts de fonctionnement intéressants. Néanmoins,
l’ apparition de dysfonctionnements, ainsi que l’ élimination limitée de certains groupes de COV
induisent la nécessité d’ optimiser la gestion de ces procédés. Afin d’ atteindre cet objectif, l’ étude du
fonctionnement de ces procédés du point de vue microbiologique est primordiale.

Ce chapitre fait la synthèse des connaissances actuelles sur les COV, ainsi que sur les techniques
d’ épuration mises en œuvre pour traiter les émissions de COV d’ origine manufacturière, en se
focalisant plus particulièrement sur les procédés biologiques. Ensuite, la démarche adoptée pour
réaliser l’ étude du fonctionnement des communautés microbiennes impliquées dans l’ élimination de
COV est expliquée.

,&29

I.2.1. Nature, source et impact des COV

I.2.1.1. Définition
Suivant les pays et les réglementations, la définition du terme COV diffère.
Dans les pays de l’ Union européenne, la définition qui prévaut est celle décrite par la directive
européenne, directive 1999/13/CE, du 11 mars 1999. Elle définit un COV comme un composé
organique ayant une pression de vapeur saturante de 0,01 kPa ou plus à une température de 293,15 K
ou ayant une volatilité correspondante dans les conditions d'
utilisation particulières.

10
La législation française exclut, par l'
arrêté du 29 mai 2000, le méthane de cette définition. Les
raisons de cette exclusion sont données ci-dessous :
- il est présent en quantité importante dans l’ atmosphère. En 1998, sa concentration a été évaluée
à 1142 µg.m-3. La concentration des autres COV est estimée entre le ng.m-3 et quelques dizaines de
µg.m-3,
- il n’ induit pas de pollution photochimique, mais il joue un rôle prépondérant dans le phénomène
d’ effet de serre,
- il est peu réactif et atoxique,
- ses principales sources d’ émissions anthropiques sont l’ agriculture et la sylviculture qui
représentent 70 % du total des émissions anthropiques,
Les autres composés sont donc nommés COVNM (Composés Organiques Volatils Non
Méthaniques).

L’ agence américaine de l’ environnement (EPA) définit les COV comme des composés carbonés
qui participent à des réactions photochimiques à l’ exception du monoxyde de carbone, du dioxyde de
carbone, de l’ acide carbonique, des carbures métalliques et des carbonates. Cette définition exclut les
composés dont la réactivité photochimique a été estimée comme négligeable comme l’ acétone, le
dichlorométhane (DCM)….

L’ existence de plusieurs définitions peut générer des problèmes lors de la comparaison des
inventaires d’ émissions entre les pays, et occasionner des difficultés dans le cadre de la mise en place
d’ une stratégie mondiale de réduction de COV.
Dans notre étude, la définition utilisée est celle en vigueur en France, considérant un COV
comme un composé organique présent à l’ état de vapeur à température ambiante.

Parmi les composés répondant à cette définition, qui n’ est pas restrictive du point de vue de la
nature chimique, les groupes chimiques suivants peuvent être recensés :
1. les composés oxygénés dont les alcools (éthanol, isopropanol, méthanol), les cétones (acétone,
méthyléthylcétone (MEC), méthylisobutylcétone (MIBC)…), les esters (acétate d’ éthyle (AE) et
acétate de butyle (AB)...) les ethers et les glycols éthers,
2. les composés hydrocarbonés : aliphatiques (butane, propène) et aromatiques (toluène, xylène,
éthyl-benzène (EB)….),
3. les composés halogénés dont les chlorés (Dichloroéthane (DCE), DCM …),
4. les composés soufrés : mercaptans (méthanethiol), et sulfures (diméthylsulfure),
5. les composés azotés : amines (triméthylamine).

11
I.2.1.2. Sources
Les émissions de COVNM ont deux origines :
- naturelle (forêts, prairies),
- anthropique.
A l’ échelle planétaire, les sources naturelles de COV représentent 90 % des rejets, cependant dans
les régions industrialisées, la prépondérance de ces sources diminue. En France, les résultats de
l’ inventaire des émissions atmosphériques pour l’ année 2001 montrent que les émissions d’ origine
anthropique représentaient 1674 kT, contre 1413 kT pour les sources naturelles CITEPA, 2003.

Les émissions d’ origine anthropique peuvent être divisées en deux catégories :


- les sources ponctuelles (industries manufacturières) dont les émissions sont connues et
contrôlées.
- les sources diffuses qui regroupent « toute émission de COV dans l’ air, le sol ou l’ eau qui n’ a
pas lieu sous la forme d’ émissions canalisées » arrêté du 29 mai 2000, : transport routier, chauffages
… L’ importance de cette source a été également mise en avant grâce à la réalisation d’ inventaires à
l’ intérieur des habitations. Lee HW DO, 2002b, ont mesuré la concentration de onze COV dont le
benzène, le toluène, et le DCM dans les habitats situés en zone urbaine. Ces travaux ont montré que la
concentration des composés est plus élevée à l’ intérieur des habitats qu’ à l’ extérieur à cause
notamment des systèmes de chauffage et la consommation de tabac. Ainsi, plus de 300 molécules
organiques volatiles ont été identifiées dans l’ air intérieur (DusserreHWDO, 1998).

En France, les émissions d’ origine anthropique de COVNM ont diminué de 38 % entre 1990 et
2002 (CITEPA, 2004, Figure I-1). Les secteurs "transformation d’ énergie" et "transport routier" sont
les secteurs les plus impliqués dans ce recul (Figure I-1). Les progrès obtenus dans le stockage et la
distribution des hydrocarbures ainsi que l’ équipement des véhicules routiers en pots catalytiques
depuis 1993 sont à l’ origine de cette amélioration. Par conséquent, l’ industrie manufacturière est
devenue la première émettrice depuis l’ an 2000 CITEPA, 2004.

12
)LJXUH,(YROXWLRQGHVpPLVVLRQVGH&2910HQ)UDQFHGHj G¶DSUqVOH
&,7(3$ $(YROXWLRQJOREDOH%(YROXWLRQSDUVHFWHXUG¶DFWLYLWp

I.2.1.3. Impacts des COV

¾ (QYLURQQHPHQW
L’ effet direct des COV sur les végétaux reste méconnu, leur impact est surtout indirect et
étroitement lié à leurs propriétés de réactivité chimique. Dans la troposphère, c’ est à dire entre sept et
dix kilomètres du sol, et sous l’ effet des rayonnements solaires, les COV et les oxydes d’ azote
réagissent pour former des polluants secondaires tels que l’ ozone. C’ est pourquoi les COV sont
qualifiés de précurseurs photochimiques (MonodHWDO, 1998).
L’ ozone est un polluant toxique, qui entraîne une baisse de la production des plantes. L’ ozone
provoque des perturbations des fonctions vitales de la plante : modification de la perméabilité des
membranes, troubles physiologiques de la photosynthèse et de la respiration, changements de la
pigmentation, pertes des aiguilles chez les conifères (DusserreHWDO, 1998).

13
¾ 6DQWp
Les COV affectent la santé selon deux voies : indirectement du fait de leur réactivité dans la
troposphère (formation d’ ozone) et directement sur l’ organisme.
L’ ozone généré affecte les capacités respiratoires et irrite les muqueuses (yeux, gorge). Les
personnes les plus sensibles sont les enfants, et les personnes malades ou allergiques.
Les COV sont responsables d’ un large panel d’ affections décrites par les Fiches Toxicologiques
de l'
Institut National de Recherche et de Sécurité (INRS). L’ importance des symptômes dépend du
polluant, du type de contact (inhalation, voies percutanées, ingestion), de la concentration, de la durée
de l’ exposition ainsi que de la sensibilité du sujet. Les troubles identifiés sont classés sur une gamme
allant de l’ irritation de la peau ou des muqueuses, à des troubles cardiaques, psychomoteurs ou
neurologiques. Certains COV sont soupçonnés d’ effets tératogènes et cancérigènes (Dusserre HW DO,
1998).

¾ &HOOXOHVEDFWpULHQQHV
'pILQLWLRQGHODWR[LFLWpG¶XQFRPSRVp
Généralement, le caractère toxique d’ un solvant est relié au coefficient de partage octanol-eau
(Aizpuru, 2001, Sardessai et Bhosle, 2002). Ce coefficient est le rapport entre la concentration, à
l’ équilibre, d’ une substance chimique dans l’ octanol et la concentration de cette même substance dans
l’ eau. Il est exprimé par son logarithme pKow. Cette valeur permet d’ estimer le caractère liposoluble
ou hydrophobe d’ un composé. Les composés qui passent le plus facilement dans la phase organique
sont effectivement plus aptes à traverser les membranes.
Ainsi, plus un composé a une valeur de pKow faible, plus il est apolaire donc hydrophobe ; par
conséquent son pouvoir toxique sera élevé. Généralement, les solvants dont les valeurs de pKow sont
inférieures à quatre sont considérés comme extrêmement toxiques.
Le tableau I-1 indique les valeurs de pKow pour les composés utilisés au cours de cette étude.

7DEOHDX,([HPSOHGHYDOHXUVGHS.RZ

pKow
Méthanol -0,764
Acétone -0,268
MéthylEthylCétone (MEC) 0,261
AE 0,671
MéthylIsoButylCétone (MIBC) 1,189
DCM 1,249
DCE 1,458
AB 1,729
Toluène 2,791
EB 3,32
Para-xylène (p-xylène) 3,44

14
Cependant, l’ évaluation de la toxicité d’ un composé dans un écosystème ne peut se limiter à ce
seul paramètre. Rajagopal, 1996, montre en effet que la souche 3VHXGRPRQDV SXWLGD IH 2000 est
capable de croître en ayant comme seule source de carbone du toluène. En revanche, elle n’ est pas
capable de croître avec du benzoate d’ éthyle ou du chlorobenzène alors que les valeurs de pKow sont
respectivement de 2,5 ; 2,6 et 2,8. La toxicité d’ un composé dépend de facteurs propres à la molécule
(structure chimique, polarité… ), mais aussi des conditions environnementales (biodisponibilité… ) et
des micro-organismes présents dans l’ écosystème (potentiel génétique, composition membranaire… ).

0RGHG¶DFWLRQ
Les solvants organiques, et plus particulièrement le toluène, peuvent entraîner la lyse des micro-
organismes car ils s’ accumulent dans le cytoplasme et détruisent la membrane cellulaire (Sardessai et
Bhosle, 2002). L’ importance de cette dernière dans les phénomènes de survie aux solvants a été mise
en évidence (Isken et Bont, 1996, Rajagopal, 1996).

Aussi, pour lutter contre le stress provoqué par les polluants, les bactéries mettent en place
différents systèmes de protection (Sardessai et Bhosle, 2002) dont les principaux sont :
- la modification de l’ enveloppe cellulaire dans le but d’ augmenter la rigidité et de diminuer la
perméabilité,
- la mise en place de pompes d’ efflux (Isken et de Bont, 1996),
- l’ augmentation de la production d’ enzymes intervenant dans la réparation des membranes,
- la production d’ enzymes inactivant les solvants,
- l’ excrétion de vésicules contenant des solvants,
- la production de protéines de stress.

I.2.2. Réduction des émissions

I.2.2.1. Législation
Face à l’ impact environnemental et sanitaire des COV une législation de plus en plus stricte se
met en place. En France, la législation porte sur les émissions anthropiques ponctuelles et diffuses.
Elle fixe des valeurs seuils de rejets.

1) Les seuils d’ émissions des installations classées pour la Protection de l’ Environnement (ICPE)
sont régis par l'
arrêté du 29 mai 2000 qui transpose en droit français la directive européenne
1999/13/CE. Pour les COV, la valeur limite d’ émission, exprimée en carbone total, de la concentration
ensemble des composés est de 110 mg.Nm-3, si le flux horaire total dépasse 2 kg.h-1.
de l'

15
2) D’ autre part, la directive européenne du 23 octobre 2001, directive 2001/51/CE, fixe une
valeur limite d’ émission des COV sur le territoire français égale à 1050 kT à l’ horizon 2010. Au vu de
l’ inventaire d’ émissions réalisé en 2002, la France doit encore diminuer ses rejets de 32 % en huit ans
CITEPA, 2004.

L’ effet nocif induit par les émissions gazeuses chargées en COV, ainsi que la mise en place d’ une
réglementation de plus en plus sévère ont contraint les industriels à contrôler et réduire les émissions
de COV avant leur rejet dans l’ atmosphère. Si une limitation des rejets au niveau du procédé de
fabrication ne peut être mise en place, il est alors nécessaire de mettre en œuvre des unités de
traitement des effluents pollués générés.

I.2.2.2. Procédés de traitement

¾ Il existe différentes catégories de systèmes de dépollution des effluents gazeux chargés en


COV. Elles sont classiquement reparties en deux groupes selon que les COV sont conservés ou
détruits (figure I-2).

)LJXUH,/HVV\VWqPHVG
pSXUDWLRQGHV&29FRQWHQXVGDQVOHVHIIOXHQWVJD]HX[

16
¾ Le choix d’ une technique de traitement est lié à la connaissance de plusieurs facteurs dont
les principaux sont mentionnés ci-dessous :

- la nature chimique du composé à traiter (chlorés, aromatiques… .),


- la concentration en polluants (Figure I-3),
- le débit à traiter (Figure I-3),
- l’ abattement désiré,
- le type d’ émission (continue ou discontinue),
- les coûts d’ investissements et de fonctionnement,
- l’ encombrement au sol,
- la vulnérabilité du site concernant les risques d’ explosion, d’ incendie.

C’ est pourquoi la sélection d’ un procédé de traitement s’ effectue au cas par cas. Des études de
faisabilité économique ont été réalisées pour orienter les décideurs dans leur choix. Ces études
apportent des indications permettant de mieux cerner les coûts des différentes techniques. Un exemple
d’ étude est donné sur la figure I-3, elle cartographie les positions concurrentielles de chacune des
techniques en fonction du débit volumique d’ effluent à traiter et de sa concentration en COV (Herman
HWDO, 1998).


)LJXUH,)DLVDELOLWppFRQRPLTXHGHVGLIIpUHQWVSURFpGpVHQIRQFWLRQGXGpELWG¶DLUjWUDLWHUHWGHOD
FRQFHQWUDWLRQHQSROOXDQW +HUPDQHWDO 

17
Cette figure montre que les procédés de traitement sont plus complémentaires qu’ antagonistes.
L’ utilisation des procédés biologiques, représentés par le procédé de biofiltration, est plus
particulièrement appropriée pour traiter des émissions caractérisées par des débits supérieurs à
1 000 Nm3.h-1, et de faibles teneurs en polluants généralement inférieures à 1 g.Nm-3.

Le paragraphe suivant propose plus particulièrement une présentation de ces procédés


biologiques.

18
,3URFpGpVELRORJLTXHV

I.3.1. Introduction
L’ utilisation d’ unités biologiques pour le traitement d’ effluents gazeux est apparue entre 1920
et 1950. Cependant, leur utilisation de manière courante est plus récente. Elle est consécutive à une
meilleure connaissance des processus biologiques, qui a permis d’ améliorer la gestion des paramètres
opératoires (débit d’ air, taux d’ humidité, pH… ; FanloHWDO, 1998, StoffelsHWDO, 1998).

Les procédés biologiques industriels ont été initialement mis en oeuvre pour traiter des
effluents malodorants. La première application industrielle du traitement d’ émissions malodorantes a
été réalisée en 1953 en Californie (Le CloirecHWDO, 1991) ; alors que la prise de conscience des effets
nocifs des COV date des années 90 (Le Cloirec, 1998).

Aujourd’ hui encore la majorité des procédés biologiques, et plus particulièrement les
biofiltres, sont utilisés pour la désodorisation des gaz, mais la recherche vise à élargir leur champ
d’ application au traitement des COV (AcuñaHWDO, 1999, AizpuruHWDO, 2001, QuinlanHWDO, 1999,
ZilliHWDO, 2001).

Les avantages des bio-réacteurs sont les suivants :


- un coût de fonctionnement modéré,
- l’ absence de nocivité des produits de dégradation (biomasse, eau et dioxyde de carbonne),
- leur image positive auprès de l’ opinion publique qui les perçoit comme des technologies
respectueuses de l’ environnement.

Le principe de fonctionnement de ces systèmes peut être résumé comme suit :


1) les polluants sont transférés de la phase gazeuse dans la phase aqueuse,
2) ils diffusent dans le milieu aqueux,
3) ils sont oxydés par des micro-organismes. Parmi ces derniers, certains possèdent la capacité à
métaboliser les COV pour puiser l’ énergie et le carbone nécessaire à leur croissance Les produits
finaux de cette dégradation sont des produits simples et atoxiques tels que l’ eau et le dioxyde de
carbone.

19
I.3.2. Configurations des procédés biologiques
Il existe trois types de procédés biologiques : biofiltres, biolaveurs, et les filtres percolateurs. La
distinction entre ces procédés repose sur le caractère mobile ou statique de la phase aqueuse et de la
biomasse (Tableau I-2).

7DEOHDX,&ODVVLILFDWLRQGHVSURFpGpVELRORJLTXHVGHWUDLWHPHQWG¶DLU

Phase Aqueuse
Biomasse
Mobile Stationnaire
En suspension Biolaveur -
Fixée Filtre percolateur Biofiltre

I.3.2.1. Biofiltres
Dans ces réacteurs, la biomasse est fixée sur un matériau support et le passage de l’ air pollué est
forcé au travers de ce dernier. Un système d’ alimentation du réacteur en eau permet de maintenir
l’ humidification optimale du support. Les étapes de transfert et de dégradation sont réalisées
simultanément (Figure I-4). Cette configuration a fait l’ objet du plus grand nombre d’ applications
industrielles, du fait notamment de sa relative simplicité de mise en oeuvre.

I.3.2.2. Filtres percolateurs


Dans ce dispositif, la phase aqueuse est mobile. La biomasse est immobilisée sur un matériau
inorganique ou synthétique (Figure I-4). Les étapes de transfert des polluants de la phase gazeuse dans
la phase aqueuse et de dégradation sont réalisées dans le même réacteur.

I.3.2.3. Laveurs biologiques


Dans ce système, la phase aqueuse est mobile et la biomasse libre. De plus, l’ étape d’ absorption
est séparée de l’ étape de dégradation, du fait de la structuration du procédé en deux compartiments.
D’ une part, le transfert des polluants dans la phase aqueuse est réalisé dans un contacteur gaz-liquide
(colonne d’ absorption). D’ autre part, les polluants sont dégradés dans un bassin d’ oxydation dans
lequel la biomasse est agitée et oxygénée (Figure I-4).

Cette configuration de réacteur fait que le temps de contact des polluants avec la biomasse,
déterminé par le volume du bassin d’ oxydation et le débit des fluides dans la colonne de lavage, peut
être plus long que dans les biofiltres. Ce système apparaît donc particulièrement approprié dans le
cadre du traitement de composés ayant des cinétiques de dégradation lentes.

20
)LJXUH,/HVSURFpGpVELRORJLTXHVGHWUDLWHPHQWGHO¶DLUSROOXp

I.3.2.4. Bilan
Les principaux avantages et inconvénients de chaque procédé sont résumés dans le tableau I-3.

21
7DEOHDX,$YDQWDJHVHWLQFRQYpQLHQWVGHVSURFpGpVELRORJLTXHVXWLOLVpVSRXUOHWUDLWHPHQWGHVJD]
'¶DSUqV'HYLQQ\HWDOD 

Avantages Inconvénients Référence


Biofiltres )DLEOHSHUWHGHFKDUJH 'pWpULRUDWLRQGXVXSSRUW AcuñaHWDO, 1999,
3DVG¶HIIOXHQWOLTXLGHà &RQWU{OHGLIILFLOHGXS+HW AizpuruHWDO, 2001,
traiter du taux d’ humidité LiuHWDO, 2002,
,QVWDOODWLRQVLPSOH 7HPSVGHFRQWDFW SROOXDQWV- QuinlanHWDO, 1999
&Rûts de fonctionnement flore)
&ROPDWDJH
(QFRPEUHPHQWDXVRO
Biolaveurs 7HPSVGHFRQWDFW Complexité installation et Nishimura et Yoda.,
(polluants-flore) fonctionnement 1997
(OLPLQDWLRQGHVVRXV &Rûts de fonctionnement
produits inhibiteurs &ROPDWDJHSRVVLEOH
)DLEOHSHUWHGHFKDUJH (QFRPEUHPHQWDXVRO
Filtres 7HPSVGHFRQWDFW Effluent liquide à traiter Bhattacharya et
percolateurs (polluants-flore) Complexité installation et Baltzis, 2000, Cox et
(OLPLQDWLRQGHVVRXV fonctionnement Deshusses, 1998,
produits inhibiteurs &Rûts de fonctionnement 2002
&ROPDWDJH

Dans le cas du traitement des COV par le procédé de biofiltration, des limites de fonctionnement
ont été observées : colmatage, faible dégradation de certains composés. Le biolaveur et le filtre
percolateur pourraient apporter des solutions pour le traitement de certains COV, du fait notamment
du temps de contact plus élevé entre les polluants et la flore bactérienne.

I.3.3. Evolution de l’ efficacité d’ un procédé biologique


La figure I-5 présente schématiquement l’ évolution type de l’ efficacité d’ élimination d’ un
procédé biologique en fonction du temps. Le point de départ correspond à l’ ensemencement du
réacteur. L’ inoculation peut être réalisée à partir d’ un consortium complexe comme les boues activées
prélevées dans des bassins d’ oxydation de stations d’ épuration traitant des eaux usées. Cependant,
l’ ensemencement peut être réalisé à partir de culture pure, et plus particulièrement d’ une espèce
fongique (Woertz et Kinney, 2000, ChristenHWDO, 2002, SpignoHWDO, 2003, Van HeiningenHWDO,
2000) dans certains cas particuliers (fortes concentrations en polluants).

22
)LJXUH,5HSUpVHQWDWLRQW\SHGXIRQFWLRQQHPHQWG¶XQSURFpGpELRORJLTXH

La figure I-5 montre trois phases :


- la phase d’ acclimatation regroupant les phases de latence et d’ optimisation,
- le régime stationnaire
- la phase de perturbations
Parmi ces dernières, deux régimes particuliers de fonctionnement du procédé font l’ objet d’ une
attention particulière :

¾ /DSKDVHG¶DFFOLPDWDWLRQ
Elle peut être définie comme le temps nécessaire à la sélection et la structuration spatiale d’ un
FRUVRUWLXP microbien efficace pour la dégradation des polluants (DevinnyHWDO, 1999c). Cette phase
correspond donc à la mise en place d’ un écosystème.

Cette étape fait l’ objet d’ une attention particulière car, elle conditionnerait le niveau d’ abattement
atteint en phase stationnaire, ainsi que la réactivité du système lorsqu’ il est soumis à des modifications
de l’ effluent à traiter (phases de perturbations). La durée de cette phase varie de quelques jours à
quelques semaines (DevinnyHWDO, 1999c).
Pour réduire la durée de cette phase, une étape de pré-acclimatation peut être mise en oeuvre.
L’ objectif de cette étape supplémentaire est de sélectionner un FRQVRUWLXP microbien efficace en terme
de dégradation des polluants en soumettant une microflore complexe à un effluent gazeux fortement
concentré (TellezHWDO, 2002). Cette phase correspond donc a une étape d’ enrichissement.
Aizpuru, 2001 et Khammar, 2002 ont mis en œuvre, pour réaliser cette étape, un réacteur
contenant des boues homogénéisées et aérées. Un effluent gazeux contenant les polluants à traiter (à
une concentration de 700 mg.m-3 par composé) a alimenté ce réacteur pendant deux mois. La
croissance des micro-organismes présents dans les boues et capables de métaboliser les COV est alors
favorisée.

23
¾ /HVSKDVHVGHSHUWXUEDWLRQV
Ces phases sont dues aux variations des paramètres opératoires. Ces dernières entraînent des
perturbations du fonctionnement du réacteur pouvant générer une diminution de son efficacité
d’ élimination. Les études des potentialités et de la flexibilité des réacteurs font donc l’ objet d’ une
attention particulière (Aizpuru, 2001).
Ainsi, afin d’ optimiser la gestion de ces procédés, les paramètres opératoires suivants doivent être
pris en compte lors de la mise en œuvre d’ un réacteur.

I.3.4. Paramètres opératoires

I.3.4.1. Concentration des polluants de l’ effluent à traiter


Les performances des procédés biologiques sont affectées par le niveau de concentration moyen
de l’ effluent en entrée de réacteur mais aussi par la variabilité de celle-ci.
L’ activité d’ une entreprise ainsi que les matières premières utilisées dans une chaîne de
production varient au cours du temps. Ainsi, la composition de l’ effluent à traiter peut différer selon
trois axes (DevinnyHWDO, 1999b) :
- l’ arrêt des chaînes de production générant les émissions gazeuses chargées en COV (panne, arrêt
estival) induit la non alimentation des réacteurs par les polluants. Au cours de ces périodes, la flore
apte à la dégradation de certains composés peut être lessivée.
- des fluctuations qualitatives et quantitatives de la composition de l’ effluent gazeux généré ont
été observées. Ces fluctuations peuvent survenir sur des périodes très courtes de l’ ordre de l’ heure ou
de la minute et ceci de manière fréquente.
- des pics de concentrations, qui peuvent être toxiques pour la microflore, peuvent également
survenir.

I.3.4.2. Paramètres physico-chimiques


- /D WHPSpUDWXUH : en général, le réacteur fonctionne à des températures comprises entre 20 et
45°C ce qui favorise le développement de bactéries mésophiles. Dans cette gamme de température,
l’ activité enzymatique augmente avec la température. ArnoldHWDO, 1997, ont obtenu une amélioration
de la dégradation du styrène de 66 à 92 % avec l’ augmentation de la température de 12 à 23°C. Cox et
Deshusses, 2000, ont pour leur part amélioré la dégradation de l’ éthanol en utilisant un filtre
percolateur fonctionnant à 53°C.

Chaque espèce bactérienne est adaptée à une gamme de températures donnée. Ainsi en fonction
de la température, la flore bactérienne présente dans les procédés biologiques traitant des COV sera
sans doute différente, comme cela a été montré dans le cas de boues issues de digesteurs anaérobies

24
fonctionnant à des températures différentes (SekiguchiHWDO, 1998). De plus, pour des températures
inférieures à 20°C, la vitesse des réactions métaboliques est généralement ralentie. Ainsi, en hiver une
diminution de l’ efficacité de traitement et une variation de la diversité microbienne peuvent être
observées.
La température a également un impact au niveau des propriètés physico-chimiques des polluants
tels que la diffusion et l’ absorption.

- /H WDX[ G¶KXPLGLWp pour les biofiltres : ce facteur est certainement celui qui a le plus grand
impact sur le fonctionnement des biofiltres. En effet, l’ eau intervient dans le transfert des gaz, les
propriétés physiques du matériau de garnissage et dans la survie de l’ activité microbienne. Ainsi, ce
paramètre est particulièrement contrôlé (QuinlanHWDO, 1999, SunHWDO, 2002).

- /H S+ : De fait, la plupart des procédés biologiques sont conçus pour fonctionner dans une
gamme de pH proche de la neutralité, comprise entre 6 et 8. Néanmoins, le pH peut varier pendant le
fonctionnement, notamment du fait de la génération de sous-produits issus de la dégradation des
polluants. La dégradation du DCM induit la formation d’ acide chlorhydrique. L’ équation de
l’ oxydation biologique réalisée par Hyphomicrobium GJ21 est donnée par OttengrafHWDO, 1986 :

CH2Cl2 + O2 + 2H2O Î CO2 + 2H3O+ + 2Cl-

Morchadi, 1994, maintient le pH à la neutralité dans des réacteurs à l’ échelle de laboratoire par
l’ ajout de soude ou d’ acide.

- /HWDX[HQR[\JqQHGDQVOHPLOLHX : la concentration en oxygène n’ est pas homogène en tout


point du réacteur, que se soit dans un biofiltre (DevinnyHWDO, 1999c), ou dans un bassin d’ oxydation
(Schramm HW DO, 1999). Dans ces conditions, la dégradation de COV peut être réaliser par la voie
fermentaire engendrant la formation de sous-produits pouvant être à l’ origine de nuisances olfactives
(aldéhydes) ou d’ une diminution du pH (acides carboxyliques). Un ralentissement de l’ activité
métabolique aboutissant à une diminution de l’ efficacité du procédé peut aussi être observé.

Ainsi, lors de la mise en œuvre des procédés biologiques, le contrôle des différents paramètres
opératoires est à prendre en compte afin d’ optimiser le fonctionnement du procédé. De plus, il apparaît
nécessaire de comprendre l’ impact des variations des ces paramètres sur le fonctionnement des
réacteurs afin de limiter les dysfonctionnements du procédé.

25
I.3.5. Etude de la microflore
La figure I-6 résume schématiquement le fonctionnement d’ un procédé biologique.

)LJXUH,)RQFWLRQQHPHQWLQWHUQHJOREDOG¶XQSURFpGpGHGpSROOXWLRQ

La figure I-6 montre que dans les procédés biologiques, la gestion de la microflore constitue un
paramètre opératoire primordial particulièrement complexe. Au cours du fonctionnement des
bioprocédés, la variation des paramètres environnementaux induit des variations des autres paramètres
(biotiques et abiotiques). Elle montre aussi que l’ écosystème est en perpétuelle évolution.

Par conséquent, pour améliorer ces procédés, il est primordial de mieux comprendre les
mécanismes biologiques se déroulant lors de la dégradation des polluants. Une meilleure gestion du
fonctionnement de la microflore pourra permettre de :
- limiter les dysfonctionnements (colmatage, absence de dégradation),
- améliorer les phases de démarrage ou redémarrage du système.

26
Dans un premier temps, il est donc important d’ étudier le fonctionnement de l’ écosystème
microbien lors des différentes étapes de la vie du procédé (phase d’ acclimatation, état stationnaire ou
perturbé), et plus particulièrement de comprendre l’ incidence de l’ évolution de la flore sur les
performances du procédé.

Trois types d’ approches peuvent être envisagées :


- travailler avec un écosystème contenant des micro-organismes modèles. Les micro-organismes
présentant des capacités de dégradation spécifiques sont inoculés dans un réacteur. Le champignon
([RSKLDODOHFDQLLFRUQL possède des capacités à dégrader certains COV tel que le toluène, l’ EB, l’ AB
(Woertz et Kinney, 2000). Néanmoins, cet organisme n’ est pas capable de dégrader p-xylène et le
benzène. Ainsi, ce type de configuration peut être difficilement applicable lorsque l’ effluent à traiter
contient un large éventail de molécules.
- travailler avec des FRQVRUWLD microbiens « améliorés ». Une stratégie pour améliorer les
performances d’ un procédé biologique est l’ addition de micro-organismes spécialisés. Cependant la
bio-augmentation échoue régulièrement par manque de compétitivité des organismes ajoutés face aux
autochtones. Ces organismes sont donc soit éliminés soit lessivés (JitnuyanontHWDO, 2001, Watanabe
HWDO, 2000).
- travailler avec des FRQVRUWLD microbiens. Les boues activées provenant de stations d’ épuration
des eaux usées sont généralement utilisées. Elles renferment une grande diversité de micro-organismes
qui sont potentiellement aptes à dégrader une large diversité de polluants. L’ inoculation du réacteur
avec une microflore complexe est une pratique courante à l’ échelle du laboratoire. Néanmoins, les
données relatives à la description de ces écosystèmes et aux mécanismes de dégradation des composés
sont rares.

Par conséquent, pour approcher le fonctionnement des procédés biologiques de traitement


d’ effluent gazeux contenant un mélange de COV, la dernière configuration a été choisie. De plus, pour
appréhender le fonctionnement de cet écosystème complexe, il apparaît primordial de mettre en
relation la structure des communautés microbiennes et l’ efficacité du procédé.
Pour définir la diversité d’ un écosystème, des techniques ont été développées. Il apparaît
important de recenser les principales méthodes disponibles. De plus, il est intéressant de présenter les
principaux résultats des études écologiques portant sur le fonctionnement de la microflore ayant
colonisé les procédés biologiques de dépollution des effluents gazeux chargés en COV.

27
,7HFKQLTXHVG¶pWXGHGHODPLFURELRORJLHGHVSURFpGpV

I.4.1. Techniques d’ étude de la diversité classiques, biochimiques


et moléculaires

I.4.1.1. Mise en place (Atlas et Bartha, 1997a)


Avec les premières observations microscopiques (Antonie van Leeuwenhoek, 1680), est apparue
la nécessité d’ identifier les populations présentes dans un écosystème. Mais la caractérisation
morphologique des individus, obtenue à partir des observations microscopiques, se révéla insuffisante
pour décrire l’ étendue de la diversité.

Dans la seconde moitié du XIXème siècle, Pasteur (1861), puis Koch (1883) ont mis au point les
premiers milieux nutritifs permettant la culture des micro-organismes. Par la suite, de nombreux
milieux ont été conçus, et ont été notamment employés pour étudier la diversité des écosystèmes. Des
travaux ont montré que seuls 1 à 10 % des micro-organismes sont capables de croître sur les milieux
de culture mis au point (AmannHWDO, 1995). Cette démarche de microbiologie classique s’ est avérée
par conséquent non satisfaisante pour décrire la diversité microbienne d’ un écosystème donné
(WagnerHWDO, 1993). Néanmoins, ces méthodes ont permis d’ obtenir des données sur la physiologie
et la génétique des micro-organismes. Ces informations ont contribué au développement et à l’ essor
des techniques de microbiologie moléculaire.

Le développement des techniques de biologie moléculaire a permis l’ émergence des études sur la
diversité de la microflore. Ces techniques sont complémentaires des études de microbiologie classique,
car elles permettent de décrire la structure des écosystèmes microbiens, alors que les méthodes
culturales permettent l’ étude des caractéristiques physiologiques de souches dites de références.

I.4.1.2. Développement des méthodes moléculaires


¾ Lors du développement des techniques moléculaires, les séquences moléculaires choisies
pour réaliser une classification des organismes sont les séquences protéiques et les acides nucléiques
(Gupta, 1998, Zuckerkandl et Pauling, 1965).
Dans le cadre de l’ étude de la diversité d’ un écosystème, les séquences utilisées sont celles des
gènes UUQ, en particulier, celles codant pour l’ Acide DésoxyriboNucléique ribosomal (ADNr) 16S chez
les bactéries et l’ ADNr 18S pour les eucaryotes. Ce choix se justifie par la distribution ubiquitaire de
ces gènes dans le monde vivant, le rythme lent de leur évolution, leur caractère non codant,
l’ alternance sur leur séquence de zones hautement conservées et de zones variables et leur taille
(Woese, 2000, Olsen et Woese, 1993).

28
La réalisation de banques de clones d’ ADNr a permis d’ inventorier les populations présentes dans
les écosystèmes microbiens sans avoir recours à la mise en culture. Des banques de clones d’ ADNr
16S, provenant d’ écosystèmes divers ont été élaborées : océans (GiovannoniHWDO, 1990, FuhrmanHW
DO, 1993), lacs (PernthalerHWDO, 1998), rivières (LangworthyHWDO, 1998), estuaires (CrumpHWDO,
1999), geysers (HugenholtzHWDO, 1998b), sédiments (LiHWDO, 1999), sols (ZhouHWDO, 1997), boues
(GodonHWDO, 1997), intestins d’ animaux (Ohkuma et Kudo, 1996) ou humains (SuauHWDO, 1999).
L’ image de la diversité bactérienne est alors apparue beaucoup plus large que celle donnée par les
méthodes classiques (Boivin- JahnsHWDO, 1995, WagnerHWDO, 1993).

¾ La compréhension du fonctionnement d’ un écosystème nécessite un suivi de la diversité dans


le temps et l’ espace. Pour visualiser des variations de la microflore, le nombre de séquences à
déterminer pour chaque échantillon est important (Zhou HW DO, 2002), et par conséquent difficile à
mettre en œuvre.
Ainsi, de nouvelles techniques permettant d’ obtenir plus rapidement une image de la microflore
de l’ écosystème ont été développées. Dans un premier temps, elles ont permis de différencier les
individus préalablement isolés ou clonés (Méthode Restriction Fragment Lenght Polymorphism
(RFLP), Terminal RFLP (T-RFLP), Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) et
Random Amplified Polymorphic DNA (RADP). Ensuite, l’ analyse de la globalité de la microflore a
pu être réalisée grâce à la réalisation d’ empreintes moléculaires de l’ écosystème en se basant sur des
méthodes biochimiques ou moléculaires.

Les méthodes biochimiques utilisées sont les suivantes :

- les études physiologiques menées sur les souches en culture pure ont permis de mettre en
évidence des différences de constitution des cellules procaryotes notamment au niveau des
membranes. Sur une population donnée, la richesse relative en différentes catégories de
phospholipides ou bien d’ acides gras peut être déterminée, il s’ agit respectivement de la
méthode PFLA (PhosphoLipids Fatty Acids), et de la méthode FAME (Fatty Acid Methyl
Ester).

- les méthodes moléculaires utilisées sont les suivantes :


- les méthodes d’ hybridation mettent en œuvre des sondes qui peuvent être employées LQVLWX
dans le cas de la méthode FISH (Fluorescence ,Q 6LWX Hybridation), ou bien encore des
puces à ADN. Ces sondes spécifiques ont été définies grâce aux données descriptives
obtenues par les inventaires moléculaires, ainsi que par les études génétiques des souches.
- les méthodes électrophorétiques reposent sur des différences de migrations dans un champ
électrique de fragments d’ ADN de tailles identiques : Denaturating Gradient Gel

29
Electrophoreses (DGGE), Thermal Gradient Gel Electrophoreses (TGGE), ou Single
Strand Conformation Polymorphism (SSCP) ; ou de tailles différentes : Automated rRNA
Intergenic spacer Analysis (ARISA).

L’ analyse d’ un nombre important d’ échantillons peut désormais être mise en oeuvre. Ainsi,
l’ étude de la diversité microbienne en fonction de paramètres environnementaux, soit au cours du
temps, soit géographiquement est alors envisageable.

¾ Le tableau I-4 récapitule les principales techniques utilisées couramment lors de la


caractérisation de la flore microbienne, ainsi que des exemples d’ études de la diversité bactérienne
dans différents écosystèmes.
7DEOHDX,3ULQFLSDOHVWHFKQLTXHVG¶DQDO\VHGHODGLYHUVLWpPLFURELHQQH

Méthodes Molécules cibles Echelle Références


d’ observation
0pWKRGHV%LRFKLPLTXHV
Profile des quinones Chaîne respiratoire Communauté LinHWDO, 2003, OkunukiHW
DO, 2004
FAME Acides Gras Communauté HaackHWDO, 1994
PLFA Phospholipides Communauté Von KeitzHWDO, 1999
0pWKRGHVEDVpHVVXUODVpTXHQFH$'1
Inventaire ADNr 16S Individu GiovannoniHWDO, 1990,
GodonHWDO, 1997
RADP Génome entier Communauté FranklinHWDO, 1999
ARDRA ADNr 16S Individu HiraishiHWDO, 2000
DGGE ADNr 16S Communauté MuyzerHWDO, 1993
TGGE ADNr 16S Communauté FelskeHWDO, 1997
ARISA 16S-23S intergène Communauté García-MartínezHWDO, 1999,
RanjardHWDO, 2000
SSCP ADNr 16S Communauté LeeHWDO, 1996, Schwieger et
Tebbe, 1998
FISH ADNr 16S Communauté WagnerHWDO, 1994
FriedrichHWDO, 2003
Puce à ADN ADNr 16S Communauté CookHWDO, 2004

Des biais méthodologiques ont été constatés quelle que soit la méthode utilisée. Dans ce
paragraphe, seuls les biais des méthodes basées sur l’ analyse de séquence d’ ADN sont évoqués.

Lors de la réalisation des techniques d’ empreintes moléculaires, deux étapes sont généralement
nécessaires :
1) l’ extraction de l’ ADN de l’ échantillon
2) l’ amplification de l’ ADN de l’ échantillon.

30
La représentativité de l’ amplifiat dépend donc des biais introduits lors des étapes d’ extraction
(Leff HW DO, 1995) et lors de l’ amplification de l’ ADN par la méthode Polymerase Chain Reaction
(PCR) (WintzingerodeHWDO, 1997).

Lors de l’ étape PCR, l’ amplification sélective de certains groupes bactériens est observée (Suzuki
et Giovannoni, 1996). Whitford HW DO, 1998 ont montré que cet événement peut être limité par la
réduction du nombre de cycles et par la diminution de la température d’ hybridation. D’ autres biais
sont également observés durant l’ amplification tels que l’ apparition de mutations, la formation
d’ hétéroduplex et de chimères (QuiHWDO, 2001, Suzuki et Giovannoni, 1996). Des études ont montré
que le taux de création de chimères augmentait avec le nombre de cycles et la réduction du temps
d’ élongation, et que le taux de mutations augmentait avec la concentration d’ ADN et selon l’ ADN
polymérase utilisée (Qiu et al, 2001).

I.4.2. Méthode Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)


La technique SSCP a été développée, dans un premier temps, pour analyser les mutations
génétiques humaines et bactériennes (Hayashi, 1991, OritaHWDO, 1989, SheffieldHWDO, 1993). Puis,
différentes équipes, dont Lee HW DO, 1996, ont contribué à adapter cette technique à l’ étude de la
diversité bactérienne dans les écosystèmes complexes. Le principe de cette technique repose sur la
dépendance de la migration électrophorétique, en conditions non-dénaturantes, d’ une molécule à sa
taille, son poids moléculaire mais aussi à sa conformation spatiale. Cette dernière est liée aux
interactions intramoléculaires inhérentes à la séquence nucléotidique. En conditions non dénaturantes,
une séparation des différentes conformations est réalisable.

Des optimisations techniques ont montré que la séparation de brins phylogénétiquement très
proches était optimale lorsque la région amplifiée comptait environ deux cent paires de bases
(Sheffield HW DO, 1993), et que le gel de polyacrylamide contenait 10 % de glycérol (Orita HW DO,
1989).
D’ autres aspects de la méthode ont été améliorés et plus particulièrement la détection des brins
d’ ADN, et la méthode de comparaison des échantillons. La première méthode de visualisation des
brins d’ ADN reposait sur une coloration au nitrate d’ argent. Aujourd’ hui, l’ utilisation d’ amorces
marquées par un fluorophore, ainsi qu’ une automatisation de la méthode par électrophorèse capillaire
améliore la détection des séquences nucléotidiques (Zumstein HW DO, 2000). De plus, l’ ajout d’ un
marqueur interne au moment de l’ analyse permet de comparer une grand nombre d’ échantillons après
une correction informatique (ZumsteinHWDO, 2000).

31
L’ hypothèse émise est qu’ un pic (ou bande) obtenu sur l’ électrophorégramme correspond à un
phylotype. Le positionnement des pics (ou bandes) est relié aux groupes phylogénétiques.
L’ identification des micro-organismes correspondant aux pics (ou bandes) nécessite une étape de
clonage des ADNr 16S, puis un tri des clones par SSCP préalablement au séquençage de ces derniers.

Une limitation commune aux méthodes SSCP, DGGE, et TGGE est l’ apparition de plusieurs
bandes lors de l’ analyse d’ une souche (King HW DO, 2005). Les bandes supplémentaires peuvent
provenir :

- de l’ existence de plusieurs conformations pour une seule séquence,


- de la présence d’ au moins deux opérons dans une même souche,
- de la reconstitution de doubles brins (homoduplex ou hétéroduplex).

Pour limiter la formation de ces doubles brins, deux voies ont été explorées, l’ une consiste en la
digestion d’ un des brins et la seconde s’ est focalisée sur le choix de la région d’ ADN amplifiée. Dans
le premier cas, un brin est marqué à l’ aide d’ une amorce phosphorylée puis digéré par une exonucléase
(Schwieger et Tebbe, 1998). Dans le deuxième cas, Schmalenberger HWDO, 2001, ont montré que la
formation d’ hétéroduplex était plus limitée lors de l’ analyse de la région V4-V5 que pour la région
V2-V3 de l’ ADNr 16S.

Malgré ces limitations, l’ exploration de la diversité de nombreuses matrices comme l’ eau (LeeHW
DO, 1996), le sol (Schwieger et Tebbe, 1998), les procédés de dépollution anaérobies (ZumsteinHWDO,
2000), aérobies (Khammar HW DO, 2005), et le fromage (Duthoit HW DO, 2003) ont été étudiées avec
succès. De plus, sur ces différents milieux, les trois domaines phylogénétiques (WoeseHWDO, 1990)
ont été étudiés (LeclercHWDO, 2001, PetersHWDO, 2000,DelbesHWDO, 2000, OritaHWDO, 1989).

I.4.3. Quantification de la diversité

I.4.3.1. Caractérisation classique de la diversité

¾ 'pILQLWLRQ
L’ application des méthodes citées ci-dessus permet de dessiner les contours de la diversité.
Plusieurs indices mathématiques ont été utilisés pour caractériser la diversité (Atlas et Bartha, 1997b)
et ainsi comparer différents échantillons entre eux. Parmi les indices existants, la diversité de
l’ écosystème est définie selon trois axes principaux :

32
1) La diversité totale est évoquée généralement sous le terme derichesse de l’ écosystème c'
est-à-
dire le nombre d’ espèces différentes dans un écosystème. Elle peut être exprimée par le ratio du
nombre d’ espèces (S) sur le nombre d’ individus (N).

d S 1
logN

2) La répartition du nombre d’ espèces, encore appelée équitabilité, définit le nombre


d’ individus de chaque espèce présente dans l’ écosystème. Cet indice révèle la présence d’ une
population dominante.

Un indice très employé est l’ indice de Shannon-Weaver. Cet indice prend en compte la richesse
de l’ écosystème et la répartition des espèces. Il est exprimé en fonction du nombre d’ individus (N), du
nombre d’ individus de l’ ième espèce (ni) et de C = 2,3.
___
C
H= (N log N - Σ ni log ni)
N

L’ équitabilité Lebaron HW DO, peut être calculée à partir de l’ indice de Shannon-Weaver, cet
indice est indépendant de la taille de l’ échantillon contrairement à l’ indice de Shannon-Weaver.
___

J= H
Log S

Où S représente le nombre d’ espèces.

3) Le pourcentage de recouvrement (&RYHUDJH) qui indique la proportion de la diversité


recouverte au cours de l’ étude. Cet indice a été défini par Good en 1953, il est utilisé par de nombreux
auteurs (McCaig HW DO, 1999, Wagner HW DO, 2002). Il est fonction de n le nombre de phylotypes
trouvé en un seul exemplaire et du nombre total de phylotypes.
_ n
C= (1 ) 100
N *

¾ /LPLWDWLRQVjOHXUPLVHHQRHXYUH
Ces indices sont utilisés aussi bien pour des études cultures dépendantes que cultures
indépendantes. Néanmoins, deux limites à l’ utilisation de ces indices sont avancées.

1) Définition de l’ espèce bactérienne


En l’ absence d’ un concept universel, la définition du terme espèce est laissée à l’ appréciation de
chaque auteur. De plus, les inventaires moléculaires ont mis en évidence qu’ une espèce bactérienne ne
pouvait pas être considérée comme une entité génétiquement bien séparée de ses voisines
(Stackebrandt et Goebel, 1994).

33
Pour pallier ce problème, deux solutions ont été apportées :

™ le terme espèce est remplacé par le terme phylotype notamment dans les études utilisant des
méthodes moléculaires. Ce terme désigne un groupe d’ individus possédant des caractéristiques
communes donc par extension des individus phylogénétiquement proches. Pour chaque
méthode, la définition du phylotype est précisée par les auteurs :

- lors d’ un travail réalisé à partir de la séquence de l’ ADNr 16S, un phylotype est


généralement défini par un ensemble d’ individus présentant une homologie de séquence
supérieure ou égale à 97 %. Ce seuil de coupure a été établi par Stackebrandt et Goebel,
1994.

- lors de l’ utilisation des méthodes d’ empreintes moléculaires, l’ hypothèse de travail


est qu’ une bande représente un phylotype. Cependant, il a été montré que cette hypothèse
est imparfaite. En effet, une bactérie peut être représentée par plusieurs bandes (voir
paragraphe I.4.2) et une bande peut représenter plusieurs bactéries (Zumstein HW DO,
2000).

™ un indice ne prenant pas en compte la notion d’ espèce ou toute notion approchante peut être
utilisé. Watve et Gangal, 1996 proposent de mesurer la moyenne des distances (taxonomique
des isolats ou d’ homologie de séquences) entre les individus et de l’ utiliser comme indice.

2) Vision partielle de l’ écosystème


Les méthodes d’ étude de la diversité d’ un écosystème aboutissent à une vision incomplète de la
diversité :

- dans le cas des méthodes de microbiologies classiques, seul 1 à 10 % des espèces présentes dans
un écosystème sont cultivables.

- pour les méthodes d’ empreintes moléculaires, MuyzerHWDO, 1993, ZoetendalHWDO, 1998 ont
estimé que dans le cas de la méthode DGGE, seuls les groupes bactériens représentant plus de
1 % de la population bactérienne totale sont visibles sur les profils électrophorétiques.

34
I.4.3.2. Autres méthodes de caractérisation de la diversité
D’ autres méthodes statistiques sont nouvellement appliquées à l’ analyse de la microflore.

D’ une part, des travaux ont été réalisés afin de définir la taille de la diversité d’ un écosystème.
Les résultats sont disparates. McCaigHWDO, 1999 ont testé l’ effet de la fertilisation des prairies sur la
flore microbienne des sols. Ils ont conclu que les deux cent soixante quinze clones séquencés répartis
en une quarantaine de groupes recouvraient moins de 15 % de la diversité. Les données de cette étude
ont été reprises par d’ autres auteurs afin d’ appliquer deux méthodes statistiques. La méthode
paramétrique permet d’ estimer la diversité totale à six milles trois cent espèces (Bohannan et Hughes,
2003). La méthode non-paramétrique estime que cet écosystème est constitué de quatre cent soixante
sept à cinq cent quatre-vingt dix espèces (HughesHWDO, 2001).

D’ autre part, des méthodes statistiques pour analyser rapidement un nombre important
d’ empreintes moléculaires de la microflore ont été utilisées. En effet, pour définir une évolution dans
le temps ou l’ espace de l’ image de la diversité, il est nécessaire de comparer les différents profils, de
pouvoir définir les profils identiques et ceux présentant des différences, de manière à corréler la
dynamique bactérienne aux paramètres de l’ environnement.

Les méthodes d’ Analyse en Composante Principale (ACP) et d’ analyse canonique permettent


d’ effectuer des regroupements des échantillons. Au cours de ces analyses, de nombreux paramètres,
comme la position des pics ou l’ importance relative des pics, peuvent être pris en compte. C’ est
pourquoi ces méthodes sont de plus en plus utilisées. Dans l’ étude de McCaigHWDO, 2001, la diversité
de trois séries d’ échantillons, provenant de prairies fertilisées, semi fertilisées ou non fertilisées, a été
définie par la méthode DGGE. Les profils obtenus lors de cette analyse ont été observés par les
méthodes ACP et canoniques. Si dans le cadre de cette étude, l’ ACP ne permet pas de mettre en
évidence une corrélation, l’ utilisation de la méthode canonique permet de regrouper les échantillons
selon leur provenance, et de montrer que l’ apport de fertilisant et la diminution de la diversité des
végétaux entraîne une variation de la diversité bactérienne.

35
I.4.4. Classification de la diversité
La figure I-7 présente l’ étendue de la diversité obtenue par les méthodes traditionnelles et
moléculaires.

L’ arbre phylogénétique de la diversité donnée par les méthodes conventionnelles, a été rapporté
par Carl Woese. L’ arbre phylogénétique du domaine bactérien comptait douze phylums. En revanche,
l’ arbre phylogénétique obtenu, en complétant les informations par les données moléculaires, compte
un nombre de phylums plus important : HugenholtzHWDO, 1998a en démonbrent trente six divisions ;
Rappé et Giovannoni, 2003 déterminent cinquante deux phylums.

)LJXUH,: Représentation de la diversité du domaine phylogénétique des bactéries décrite en 1987


par Carl Woese (En médaillon) et en 1998 (HugenholtzHWDO, 1998b).

De plus, il apparaît qu’ un tiers des divisions définies par +XJHQKROW]HWDOEne comptaient
pas, parmi ses membres, d’ individus isolés sur milieux de culture.

36
Les méthodes moléculaires ont permis d’ explorer des groupes bactériens inconnus. Certains
possèdent un nombre important de phylotypes, ce qui laisse supposer un rôle important dans le
fonctionnement des écosystèmes : +RORSKDJD$FLGREDFWHULXP, OP11, WS6… (Dojka HW DO, 2000,
LudwigHWDO, 1997, NeefHWDO, 1998) De plus, les groupes précédemment décrits par les méthodes
conventionnelles ont été remaniés. La division des 3URWHREDFWHULD, notamment, a été enrichie par de
nouveaux groupes dont le groupe SAR11 issus d’ inventaires réalisés sur les milieux aquatiques (Bahr
HWDO, 1996, FuhrmanHWDO, 1993, GiovannoniHWDO, 1990, GlöcknerHWDO, 2000).

I.4.5. Etude du fonctionnement des écosystèmes


Les paragraphes précédents ont permis de dresser un bilan des méthodes disponibles afin de
caractériser la diversité d’ un écosystème. Cependant, parallèlement au critère de diversité, il est
nécessaire de considérer les paramètres suivants :
1. l’ activité de biodégradation en prenant en considération :
la dégradabilité de la molécule avec :
- la disponibilité de la molécule (solubilité, adsorption, désorption)
- la toxicité du composé,
le temps de contact polluants / microflore,
les interactions entre les composés,
2. les densités de populations
3. la diversité de la microflore avec :
la présence des micro-organismes possédant des capacités à dégrader,
les interactions entre les populations microbiennes.

La prise en compte simultanée de ces paramètres n’ est pas facilement réalisable. En effet, la
définition de la résultante fonctionnelle n’ est pas toujours aisée. Néanmoins, lors de l’ étude des
procédés biologiques de dépollution d’ effluents aqueux ou gazeux, la résultante fonctionnelle est
assimilée à l’ activité de biodégradation des polluants. Les autres fonctions des micro-organismes dans
l’ écosystème ne sont pas considérées.

La majorité des études microbiologiques concernant les procédés de dépollution sont réalisées sur
des réacteurs traitant des eaux usées. Ainsi, avant de présenter les principaux résultats se rapportant
aux études microbiologiques des procédés de traitement de l’ air, il paraît judicieux de présenter
quelques résultats issus de l’ étude du fonctionnement de la microflore impliquée dans le traitement
d’ effluents liquides. De plus certains concepts d’ écologie microbienne seront définis.

37
Dans un premier temps, les données ont été essentiellement descriptives, et ont permis de mettre
en évidence les éléments suivants :

- XQH PrPH DFWLYLWp GH ELRGpJUDGDWLRQ SHXW rWUH UpDOLVpH SDU GHV IORUHV EDFWpULHQQHV
GLIIpUHQWHV. Le suivi de la diversité des FRQVRUWLD microbiens ayant colonisé des unités
pilotes à l’ échelle de laboratoire sur de longues périodes et en absence de variation des
paramètres environnementaux a été réalisé. Fernandez HWDO, 1999, ZumsteinHWDO, 2000,
ont montré que la diversité évoluait au cours du temps. La redondance fonctionnelle dans un
écosystème représente la mesure du nombre d’ espèces écologiquement équivalentes vis-à-vis
d’ une fonction donnée (Lawton, 1994, Yin, HWDO., 2000) Plusieurs espèces peuvent assumer
une même fonction dans l'
équilibre d'
un écosystème. On parle alors de redondance. Une
redondance fonctionnelle qui a son importance dans la résistance et la résilience des
écosystèmes face aux perturbations anthropiques et naturelles.

- VHORQODUpVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOH GHO¶pFRV\VWqPH ODGLYHUVLWpGHOD PLFURIORUHSUpVHQWH


GDQVXQpFRV\VWqPHYDULH. La comparaison des structures des communautés microbiennes
au sein de réacteurs ne réalisant pas les mêmes fonctions ont montré des divergences
significatives. Ainsi, la méthode FISH a été employée sur des échantillons provenant de
systèmes de boues activées réalisant ou non la déphosphatation (BondHWDO, 1995, BondHW
DO, 1999, Lin HW DO, 2003) ou la dénitrification (Lee HW DO, 2002a) de l’ effluent à traiter.
Dans l’ écosystème réalisant la déphosphatation de l’ effluent, 35 % des bactéries détectées
sont des bactéries Gram positif à haut pourcentage de bases G et C (HGCGPB). Cette
division n’ est pas retrouvée dans le réacteur ne réalisant pas cette fonction. Pour leur part,
Lee HW DO 2002, ont travaillé sur deux réacteurs ensemencés avec le même LQRFXOXP et
soumis aux mêmes conditions opératoires. L’ un a présenté une efficacité d’ élimination du
nitrate élevée (supérieure à 90 %), alors que le second présentait une capacité trois à quatre
fois plus faible (24 %). Cette différence d’ efficacité était accompagnée d’ une divergence de
la flore ayant colonisé ces réacteurs en termes de densité et de diversité et plus
particulièrement au niveau de la sous division 3URWHREDFWHULD. La communauté
fonctionnelle ou groupe fonctionnel est l’ ensemble d’ espèces ayant des effets similaires sur
les processus majeurs de l’ écosystème. La communauté fonctionnelle impliquée dans la
dégradation des COV est peu connue (paragraphe I.5.2.2).

38
Pour améliorer cette approche et tenter d’ identifier les acteurs des voies métaboliques, une
nouvelle stratégie est appliquée. Elle consiste en l’ introduction de perturbations au sein de
l’ écosystème. La modification des paramètres opératoires d’ un écosystème entraîne des variations en
terme de densité, de diversité et de fonctionnalité. Les perturbations apportées lors de l’ étude des
procédés biologiques portent généralement sur la composition de l’ effluent alimentant ces derniers.

L’ impact d’ un stress produit des réactions variées qui dépendent de l’ LQRFXOXP (CrapezHWDO,
2000, Moreno et Buitrón, 2004), du mode d’ introduction des polluants (aiguë ou chronique), et des
autres paramètres environnementaux :

- suite à l’ injection de polluants, une diminution des densités de peuplement et de la diversité


microbienne précède une augmentation progressive de ces mêmes paramètres (Müller HW
DO, 2001, Rasmussen et Sørensen, 2001).

- la modification des conditions environnementales induit une sélection et une adaptation du


potentiel génétique, favorisant la croissance des micro-organismes dégradant les polluants.
Ainsi, dans le cas de la dégradation du toluène, cinq voies métaboliques ont été identifiées.
Les enzymes régissant ces différentes voies métaboliques sont sensibles aux variations de
la pression en oxygène et de la concentration en nitrate du milieu (Leahy et Olsen, 1997).
De plus, l’ émergence de certains micro-organismes est due à l’ existence de deux types de
stratégies de croissance. Juteau HW DO, 1999 montrent l’ émergence, après un an de
fonctionnement d’ un réacteur de traitement de l’ air, de bactéries K stratégie par rapport aux
bactéries r stratégie.

La dynamique de la microflore peut être testée face à des variations de la charge polluante.
L’ étude de la diversité est basée sur l’ étude de la séquence de l’ ADNr 16S ou de l’ ARNr 16S (Delbes
HWDO, 2000). L’ analyse de l’ ARNr 16S permet d’ observer les variations de la diversité plus rapidement
et de manière plus nette qu’ avec l’ analyse de L’ ADNr 16S. Ces études ont permi de mettre en avant le
rôle de bactéries tels que les 6SLURFKHWHV et les &ORVWULGLD lors de la digestion anaérobie (DelbesHWDO,
2000, FernandezHWDO, 2000, HashshamHWDO, 2000).

Le suivi du fonctionnement de l’ écosystème permet de caractériser deux propriétés de


l’ écosystèmes que sont la résilience et la résistance. Elles peuvent être caractérisées a deux niveaux :
la structure de la communauté bactérienne et la concentration de la charge polluante (HashshamHWDO,
2000, PesaroHWDO, 2004).

39
- La résilience d’ un écosystème correspond à la capacité d’ un écosystème à retrouver son
état d’ équilibre suite à un phénomene de perturbation. Cette proprièté est définié soit
comme la capacité de l’ écosystème à maintenir la composition des communautés
microbiennes présentes à un temps donné, soit comme le temps nécessaire à l’ élimination
des composés toxiques.
- La résistance correspond à la capacité de l’ écosystème à résister à une pertubation. La
réorganisation de la composition des membres de la communautés peut avoir lieu
(Fernandez HW DO, 2000, Hashsham HW DO, 2000). Cette propriété peut aussi être évaluée
grâce à la mesure de l’ accumulation de produit toxique dans le milieu (HashshamHWDO,
2000).

40
,(FRORJLHPLFURELHQQHGHVSURFpGpVGHWUDLWHPHQWGH
O¶DLU
Les procédés biologiques traitant les COV sont généralement ensemencés par un FRQVRUWLXP
microbien, tel des boues activées. Pour connaître les capacités de dégradation de ces organismes,
l’ impact des polluants sur la microflore et la réactivité du système à des perturbations, il est nécessaire
de caractériser au préalable la flore microbienne présente dans les systèmes des boues activées et de
détailler les travaux portant sur la flore présentant des capacités à dégrader les COV.

I.5.1. Structure de la communauté bactérienne dans les boues


activées
Le procédé dit « des boues activées » est le procédé biologique le plus répandu dans le cadre du
traitement des effluents liquides domestiques et industriels. Il consiste en un réacteur biologique
aérobie, où les micro-organismes sont en suspension dans un liquide aéré. Ce procédé admet des
variantes qui peuvent être classées selon le type d’ effluents (industriels, urbain, mixte) les paramètres
opératoires (aération prolongée, aérations mixtes… ), ainsi que sur leurs effets biologiques
(nitrifiant/dénitrifiant, amélioration de la déphosphatation… ).

La composition des « boues activées » est longtemps restée peu accessible. Elles sont décrites
comme un écosystème contenant un mélange complexe de micro-organismes. Ceux-ci appartiennent à
deux des trois domaines phylogénétiques (Woese HW DO, 1990) : les bactéries et les eucaryotes. Les
boues activées contiennent une large diversité de bactéries, champignons, proto- et métazoaires
(Edeline, 1979, JenkinsHWDO, 2004, CanlerHWDO, 1999). Dans les systèmes des boues activées, les
bactéries réalisent majoritairement la dégradation des polluants.

Les boues activées comptent entre 108 et 1012 cellules bactériennes.ml-1 dont 1 à 15 % seulement
sont cultivables (WagnerHWDO, 1993). De plus, les méthodes classiques ont induit une vision erronée
de la diversité présente dans les boues activées. En effet, dans les systèmes favorisant la
déphosphatation, une place prépondérante a été accordée à des groupes non majoritaires comme
$FLQHWREDFWHU (Bond HW DO, 1995, Wagner HW DO, 1993, Wagner HW DO, 1994). L’ utilisation des
méthodes moléculaires a permis de décrire de manière plus complète la diversité bactérienne des
boues activées. Par conséquent, seules, les données relatives à la diversité bactérienne, obtenues par
des méthodes moléculaires seront présentées.

Aujourd’ hui, les études sur les différents types de procédés mettant en œ uvre les boues activées
se sont multipliées. Elles ont été réalisées sur différents types de configurations permettant
d’ appréhender la flore bactérienne présente dans ces systèmes. La richesse bactérienne, mise en

41
évidence par l’ utilisation des différentes méthodes moléculaires, est très étendue (Wagner et Loy,
2002,HiraishiHWDO, 2000).
Le tableau I-4 résume les résultats obtenus par les méthodes d’ inventaire moléculaire et
d’ hybridation LQVLWX sur différents réacteurs de dépollution mettant en œ uvre des boues activées.

Le tableau I-4 montre que les images de la diversité projetées par les méthodes d’ inventaires
moléculaires et FISH sont similaires. En effet, les mêmes divisions bactériennes sont répertoriées.
La flore bactérienne présente dans les boues activées est dominée par la division des
3URWHREDFWHULD. La sous division 3URWHREDFWHULD est présente dans toutes les études. De plus cette
sous division est le groupe le plus important pour vingt et un réacteurs sur un total de vingt six.
Dans les cinq autres réacteurs, les groupes dominants sont la sous division -3URWHREDFWHULD
(EschenhagenHWDO, 2003), la division &\WRSKDJD)ODYREDFWHULXP%DFWHURLGHV (DabertHWDO, 2001)
et la divisions des bactéries HGCGPB (ChristenssonHWDO, 1998, ZillesHWDO, 2002).

Ainsi, les divisions les plus fréquemment rencontrées dans les boues activées sont les divisions
évoquées précédemment (  -3URWHREDFWHULD, &\WRSKDJD)ODYREDFWHULXP%DFWHURLGHVHWHGCGPB),
mais également -3URWHREDFWHULDet +RORSKDJD$FLGREDFWHULXP. Certaines divisions comme Green no
Sulfur (GNS) sont recensées sporadiquement, mais leur effectif peut être élevé (tableau I-4,
JuretschkoHWDO, 2002).

Le taux de recouvrement obtenu n’ excède jamais 83 %, (Bramucci HW DO, 2003, Jeon HW DO,
2003) malgré le nombre important de clones séquencés (cent quatre-vingt neuf clones) dans l’ étude de
Bramucci HWDO., 2003.

7DEOHDX,5pVXOWDWVREWHQXVORUVGHVLQYHQWDLUHVPROpFXODLUHVRXO¶XWLOLVDWLRQGHODPpWKRGH),6+
VXUGHVpFKDQWLOORQVGHERXHVDFWLYpHV

42
,QYHQWDLUHPROpFXODLUH
Référence de l’ étude Pourcentage de Clones (1RPEUHVGHSK\ORW\SHVSDUGLYLVLRQ)

Clones

Phylotypes

Recouvrement
Pourcentage
(Caractéristique de l’ échantillon)

&KORUREL
CFB

$FLGREDFWHULXP
+RORSKDJD

LGCGPB

HGCGPB

3ODQFWRP\FHWHV

1LWURVSLUD

9HUUXFRPLFURELD

)XVREDFWHULXP

Autres

Non identifiés
3URWHREDFWHULD
α β γ δ ε
Bond HWDO, 1995
M-P 97 69 48 13() 31() 8() 3() 2() 5() 3() 1() 4() 13() 3() 1() 3() 4() 3()
M - non P 92 75 28 17() 25() 10() 1() 7() 13() 7() 2() 9() 2() 2() 3()
SnaidrHWDO, 199797
M-1 62 25 77 3() 52() 18() 13() 10() 3()
Christensson HWDO., 1998
-P 51 30 51 17() 8() 10() 2() 10() 37() 8() 8()
Lapara HWDO, 2000
I - thermophile 22 15 54 45() 14() 27() 5() 9()
I - mésophile 27 24 15 15() 29() 4() 15() 4() 4() 7() 4() 7() 11()
Dabert et al, 2001
-P 92 50 46 4() 19() 5(2) 3() 42() 10(6) 4(2) 3() 4() 4()
Juretschko et al, 2002
I-N 94 53 64 26() 31() 2() 1() 5(3) 1(1) 1(1) 12(10) 2() 3() 16()
Bramucci HWDO., 2003
I 218 78 79 8() 72() 5() 1() 11() 1() 2()
I 189 57 83 8() 77() 2() 1() 9() 1() 1() 1()
Jeon, et al., 2003
-P 34 14 83 18() 50() 18() 6() 8()
EschenhagenHWDO, 200303
-P 77 58 23 6 21 2 7 22 4 5
-P 70 37 25 9 4 5 9 23 2 22
43

43


+\EULGDWLRQLQVLWX
Pourcentage d’ hybridation en fonction du nombre total de cellules

nombre total de cellules


Pourcentage d’ hybridation /

3URWHREDFWHULD

9HUUXFRPLFURELD
$FLGREDFWHULXP

3ODQFWRP\FHWHV

)XVREDFWHULXP

Non identifiés
Référence de l’ étude

+RORSKDJD

HGCGPB

Nitrospira
LGCGPB
&KORUREL

Autres
(Caractéristique de

CFB
l’ échantillon)

α β γ δ ε

WagnerHWDO, 1994 - M 78 9 26 10 8 19
WallnerHWDO, 1995 79 2 41 8
SnaidrHWDO, 1997 M-1 81 8 41 12 12 13
HesselmannHWDO, 1999 88 3 89 2 5 <1
77 9 34 7 16 20
JuretschkoHWDO, 2002 NF 16 47 2 1 6 12 5 11
LeeHWDO, 2002a N 76 12 42 18 13 15
QRQ1 52 13 37 31 10 9
BondHWDO, 1999 P 63 4 45 <1 35
Q 78 <1 58 <1
ZillesHWDO, 2002 - P 78 10 25 3 ND 9
83 4 12 7 4 15
EschenhagenHWDO, 2003 - P 75 15 17 9 12 11 15
M ou I : Effluent Municipal ou Industriel ; N, P : Traitement des nitrates, ou phosphates. Autres : Regroupe les divisions phylogéniques suivantes : GNS,
Green Sulfur, OP11, TM7, 6SLURFKHWHV, synergistes&KORURIOH[L
1 : Informations de l’ article complétées par la revue de Wagner et Loy, 2002. : le pourcentage est exprimé en fonction des cellules marquées par la sonde
bactérienne
NF : information non fournie
44

44
I.5.2. Dégradation des COV

I.5.2.1. Interaction entre les substrats


Les émissions gazeuses chargées en COV d’ origine industrielle sont généralement constituées par
un mélange de composés appartenant à des familles chimiques diverses (Le Cloirec et Martin, 1998).
Lorsqu’ un mélange de COV est introduit dans le réacteur, l’ efficacité du procédé dépend des
interactions qui s’ établissent entre les substrats.

¾ ,QKLELWLRQFRPSpWLWLYH
Lorsque les micro-organismes sont en présence de plusieurs molécules polluantes introduites
simultanément dans le réacteur, l’ ordre de dégradation suit naturellement la biodégradabilité des
composés. Les polluants utilisés en priorité sont ceux qui fournissent la plus grande quantité d’ énergie.
Ainsi, l’ AE est dégradé préférentiellement au toluène (Deshusses HW DO, 1999, Hwang HW DO, 2003,
LiuHWDO, 2002).

Une forte interaction est également observée lorsque la dégradation des substrats est soumise aux
mêmes voies métaboliques. La molécule présentant l’ affinité la plus élevée sera dégradée en priorité.
Du PlessisHWDO, 2001 ont testé la dégradation des BTEX (Benzène, toluène, EB et xylène) dans un
biofiltre préalablement acclimaté au toluène. Les auteurs montrent qu’ à l’ exception du p-xylène, le
catabolisme de tous les composés est inhibé en présence de toluène. Inversement le catabolisme du
toluène est réduit par la présence des autres composés.

Néanmoins, les interactions entre les composés sont moins fortes lorsque la dégradation est
confiée à un FRQVRUWLXP bactérien plutôt qu’ à une souche pure (OhHWDO, 1994).

¾ &RPpWDEROLVPH
• A l’ inverse des phénomènes d’ inhibition décrit dans le paragraphe précédent, des
interactions « positives » entre les composés sont observées. Il s’ agit de généralement du phénomène
de co-métabolisme. Le co-métabolite est dégradé en présence d’ un substrat de croissance (Fanlo HW
DO, 1998, Pitter et Chudoba, 1990).

OhHWDO, 1994 ont mis en évidence que la capacité à éliminer le p-xylène de la souche pp01 et
d’ un FRQVRUWLXP bactérien provenant de boues activées nécessitait la présence de toluène et/ou de
benzène. D’ autre part, GreeneHWDO, 2000 et Du PlessisHWDO, 2001 ont respectivement montré que la
présence d’ ortho-xylène (o-xylène) augmente la dégradation du toluène et du benzène sur milieux de
culture et que la présence de toluène améliore celle du p-xylène dans un biofiltre.

45
Des phénomènes de co-métabolisme ont également été observés dans le cas de la dégradation des
composés chlorés en présence de composés aromatiques. La dégradation du trichloroéthène est
effective en présence de toluène (FriesHWDO, 1997b, FriesHWDO, 1997a).

Hormis le phénomène de co-métabolisme, d’ autres paramètres peuvent expliquer l’ amélioration


de la dégradation d’ un composé en présence d’ un autre. Bhattacharya et Baltzis, 2000 ont mis en
évidence une augmentation de la dégradation de l’ ortho-dichlorobenzène de 70 à 90 % en présence
d’ éthanol. Les auteurs ont relié cette amélioration à l’ augmentation de la densité bactérienne en
présence d’ éthanol, ce qui favoriserait ensuite la dégradation de l’ ortho-dichlorobenzène.

¾ (WXGHVFRPSOpPHQWDLUHV
Les études portant sur la capacité de micro-organismes isolés à dégrader les COV apportent
les éléments suivants :
- la dégradation des composés peut être réalisée par différentes voies métaboliques. Dans le cadre
de la dégradation du toluène, cinq voies métaboliques ont été identifiées. Les enzymes régissant
ces différentes voies métaboliques sont activées de manières différentes selon la pression en
oxygène et la concentration en nitrate (Leahy et Olsen, 1997).
- la capacité de cinquante cinq souches à dégrader six BTEX a été testée (Gulensoy et Alvarez,
1999) :
- des corrélations négatives ont été mises en évidence. Une souche incapable de dégrader le
benzène, ne pourra pas non plus dégrader l’ o-xylène.
- des corrélations positives entre le toluène l’ EB, le p-xylène et le méta-xylène ont aussi été
identifiées. En d’ autres termes, une souche capable de dégrader le toluène est capable de
dégrader les trois autres composés.
- les souches capables de dégrader des composés aromatiques peuvent également dégrader le
trichloroethylène ou le triéthylbenzène, en revanche leur capacité à dégrader le DCM ou le
chloroforme est réduite (LeahyHWDO, 2003).

En plus des interactions entre substrats, il apparaît important de considérer les micro-organismes
dégradant les COV.

46
I.5.2.2. Diversité bactérienne dégradant les COV
Il convient de noter que :
- les informations relatives à la diversité bactérienne présente dans les écosystèmes
contaminés par des COV sont généralement obtenues par les techniques de microbiologie
classique.
- les composés les plus étudiés sont les BTEX, et plus particulièrement le toluène. Les
informations relatives à la flore microbienne capable de dégrader les autres COV sont
plus rares.

L’ identification de la flore bactérienne ayant colonisé un biofiltre traitant un effluent gazeux


contenant un mélange de onze COV a été réalisée par des méthodes culturales. A partir d’ un
échantillon de biofilm bactérien prélevé le trente deuxième jour de fonctionnement du réacteur, vingt
et une souches bactériennes ont été isolées et identifiées. Parmi ces dernières, neuf souches
appartiennent à la division HGCGPB, dont les genres 5KRGRFRFFXV, &RU\QHEDFWHULXP, $UWKUREDFWHU,
0LFURFRFFXV, $FWLQRP\FqWHV, et *RUGRQLD. Les douze autres souches appartenaient aux sous divisions
et -3URWHREDFWHULD Les genres 3VHXGRPRQDV, )UDWHXULD, 5DKQHOOD, <HUVLQLD ont été représentés
pour la sous division -3URWHREDFWHULD, la sous division –3URWHREDFWHULD est représentée par les
genres %XUNKROGHULD et 0DVVLOLD(KhammarHWDO, 2005)

ShenHWDO, 1998, ont analysé la flore bactérienne d’ un sol contaminé par du toluène. Ils ont
montré que les genres 3VHXGRPRQDV, %RUGHWHOOD, $]RVSLULOOXP appartenant respectivement aux sous
divisions  HW 3URWHREDFWHULDont colonisé ce sol.

Des micro-organismes sont capables de croître sur des milieux de culture ayant comme seule
source de carbone un COV (Gulensoy et Alvarez, 1999, Woertz et Kinney, 2000, ArnoldHWDO, 1997,
Alvarez et Vogel, 1991, HubertHWDO, 1999).
Les capacités à dégrader les composés aromatiques sont largement distribuées parmi la
communauté bactérienne, aussi bien parmi les bactéries Gram positif que négatif avec %XUNKROGHULD
FHSHFLD G4, 3VHXGRPRQDV SXWLGD F1, 3VHXGRPRQDVDHUXJLQRVD,%DFLOOXV, 1RFDUGLD, 0\FREDFWHULXP
(ArnoldHWDO, 1997, GreeneHWDO, 2000, HubertHWDO, 1999, JuteauHWDO, 1999, Leahy et Olsen,
1997). Les bactéries appartenant aux genres 3VHXGRPRQDV et les bactéries gram négatif prédominent
dans les systèmes de dépollution des COV. MollerHWDO, 1996 ont mis en œ uvre un biofiltre traitant
un air synthétique contenant du toluène. Ils ont mis en évidence que 65% du toluène est dégradé par 3
SXWLGD.

47
Néanmoins, l’ abondance des souches varie en fonction de l’ alimentation des réacteurs. Dans
certains cas, les genres 3VHXGRQRFDUGLD et 5KRGRFRFFXV appartenant à la division des $FWLQRP\FHWHV
peuvent être présents en nombre plus important (JuteauHWDO, 1999).

Des souches capables de dégrader les composés chlorés ont été identifiées. Le 1,2 dichloroéthane
est dégradé par ;DQWKREDFWHU DXWRWURSKLFXV GJ10 (Ottengraf HW DO, 1986), $QF\OREDFWHU DTXDWLFXV
AD20, AD25, AD27, et le DCM par +\SKRPLFURELXP GJ21 (OttengrafHWDO, 1986), 0HWK\ORSKLOXV
VS DM11, et 0HWK\OREDFWHULXPVS. DM4.

En anaérobiose, les souches capables de dégrader les COV appartiennent aux genres *HREDFWHU
pour le benzène (Rooney-Varga HW DO, 1999) et aux 'HVXOIREDFWHULDFHDH (sous division  –
3URWHREDFWHULD) pour le xylène (Harms HW DO, 1999). Une étude récente met en évidence qu’ une
espèce bactérienne identifiée comme appartenant au genre $]RDUFXV (sous division –
3URWHREDFWHULD) est liée à la dégradation du toluène en milieu anoxique (PelzHWDO, 2001).

Ainsi, en traitement d’ air, l’ étendue de la diversité microbienne dans le système biologique et


plus particulièrement dans les biofiltres a été démontré (Friedrich HW DO, 2002, Juteau HW DO, 1999,
KhammarHWDO, 2005, KhammarHWDO, 2004) laissant supposer la complexité des interactions mises
en jeu au sein de la communauté microbienne. Néanmoins, les travaux portant sur le fonctionnement
des écosystèmes de dépollution des effluents gazeux chargés en COV et prenant en compte la diversité
et la résultante fonctionnelle de la microflore sont encore rares. Néanmoins, les principaux résultats
sont exposés dans le paragraphe suivant.

I.5.3. Evolution des communautés microbiennes


Afin d’ étudier la dynamique de la microflore dans ces écosystèmes complexes, il apparaît
nécessaire de prendre en considération à la fois la structure de la diversité et la résultante fonctionnelle
de l’ écosystème.

Les études de la dynamique de la microflore dans des biofiltres, ont mis en évidence la variation
de la microflore dans des systèmes à l’ équilibre du point de vue de l’ efficacité d’ élimination des
composés. DevinnyHWDO, 1999b, citent les travaux de Castro HWDO, 1996, et de Webster et al, 1997 sur
les biofiltres. Castro HWDO ont montré que la dégradation de l’ -pinène, dans trois biofitres ensemencés
avec trois LQRFXOD différents (des boues activées, du compost de champignon, du sol issus d’ une forêt
de pin), était similaire après sept semaines de fonctionnement des réacteurs. Cependant la microflore
présente dans chaque biofiltre présentait des différences. Dans un biofiltre ayant une efficacité de
traitement stable, Webster et al, 1997 ont montré que la microflore présentait des variations aux cours
du temps.

48
KhammarHWDO, 2005 ont également suivi cette démarche dans le cadre d’ une étude portant sur
la biofiltration d’ un mélange de onze COV (composés oxygénés, aromatiques et chlorés).

Deux unités pilotes de biofiltration à l’ échelle du laboratoire ont été mises en oeuvre, et utilisées
comme modèle d’ étude. Ce travail a permis de montrer une structuration parallèle des fonctions de
dégradations, de la densité et de la diversité bactérienne en fonction de la hauteur de colonne. La
dégradation complète des composés oxygénés a lieu en tête de colonne, les composés aromatiques
sont éliminés dans la seconde moitié de la colonne avec une efficacité de 80 à 90 %. Cette
stratification de la résultante fonctionnelle est accompagnée par une structuration de la flore
bactérienne le long du biofiltre. La comparaison des profils SSCP obtenus en tête et bas de colonne
montre des différences qualitatives sur les profils obtenus.

L’ application de perturbations a permis de confirmer l’ importance de cette structuration pour


l’ efficacité du biofiltre :

- l’ introduction des composés oxygénés en bas de colonne a montré que la flore présente était
capable d’ oxyder les composés oxygénés. Cette dégradation s’ accompagne d’ une modification
de la diversité bactérienne, qui se traduit par l’ émergence de pics (ou bandes) sur les profils
SSCP obtenus.
- la suppression des composés oxygénés du mélange induit une diminution de l’ efficacité
d’ élimination des composés aromatiques. Parallèlement, une modification de l’ image de la
diversité bactérienne est observée. La diversité des bactéries dominantes reste identique mais les
rapports de dominance entre les espèces disparaissent.

49
,&RQFOXVLRQ
Afin de réduire les émissions industrielles de COV, des procédés mettant en œ uvre des micro-
organismes peuvent être utilisés. Néanmoins, lors du fonctionnement de ces réacteurs, des limites
d’ application sont observées. Aussi, afin d’ améliorer la gestion de ces réacteurs, est-il important de
mieux comprendre l’ écologie des populations microbiennes.

L’ équilibre d’ un procédé biologique s’ appuie sur des interactions microbiennes complexes. Notre
objectif est donc d’ approcher les mécanismes biologiques survenant au sein des unités de traitement
d’ effluent chargé en COV, en se focalisant sur l’ étape de mise en place de la communauté microbienne
impliquée dans la dégradation des polluants jusqu’ à l’ atteinte du régime stationnaire et sur l’ impact
des perturbations qualitatives et quantitatives de la composition de l’ effluent à traiter sur le
fonctionnement de cette microflore.

Dans le cadre de cette étude, le suivi microbiologique de réacteurs biologiques dans le temps a été
réalisé par la définition de la structure de la microflore et des performances de dégradation. La
stratégie expérimentale utilisée est la suivante :
- afin de rester proche des préoccupations industrielles, cette étude porte sur le traitement d’ un
mélange de onze COV de natures chimiques différentes. De plus, au cours du temps des
modifications qualitative et quantitative de la composition de l’ effluent ont été appliquées.
- des unités pilotes à l’ échelle de laboratoire, ont été ensemencées avec des boues activées
provenant d’ une station d’ épuration d’ eaux usées urbaines. Ces réacteurs sont conçus de façon à
ce que les boues activées soient alimentées par un effluent gazeux synthétique contenant un
mélange complexe de COV.
- la méthode SSCP a été utilisée pour suivre l’ évolution de la diversité des communautés
dominantes dans ces réacteurs.

Dans un tel système, le suivi microbiologique permettra de mesurer l’ effet de la charge


volumique appliquée sur la sélection des micro-organismes aptes à dégrader les COV et d’ évaluer le
potentiel d’ adaptation des espèces présentes par l’ application de perturbations relatives à
l’ alimentation du réacteur. L’ impact des fluctuations sur le fonctionnement de la microflore selon la
charge appliquée pourra ainsi être appréhendé. La description de la microflore capable d’ intervenir
lors de la dégradation des COV sera approchée par la réalisation d’ un inventaire.

50
Afin d’ optimiser la gestion de la microflore lors de perturbations caractérisées par l’ addition ou la
suppression de composés de nature chimique différente, le travail portera sur la dynamique de la
microflore d’ un réacteur alimenté par un effluent gazeux dont la composition est enrichie par des
composés de plus en plus facilement biodégradables.

Les résultats obtenus permettront également de mieux connaître les mécanismes biologiques
survenant au cours de la mise en place de la communauté microbienne impliquée dans la dégradation
des polluants (phase de pré-acclimatation).

51
52
&KDSLWUH,,(IIHWGHODFKDUJHYROXPLTXHVXUOH
IRQFWLRQQHPHQWGHODPLFURIORUHDXVHLQGHUpDFWHXUV
DpURELHV

53
,,,QWURGXFWLRQ
Les procédés biologiques, couramment utilisés pour traiter les émissions industrielles gazeuses
chargées en polluants malodorants, font, actuellement, l’ objet d’ une recherche particulièrement active
dans le but d’ élargir leur champ d’ application au traitement des COV (Aizpuru, 2001, DeshussesHW
DO, 1999, QuinlanHWDO, 1999).
Les effluents gazeux industriels émis dans l’ atmosphère sont généralement constitués par un
mélange complexe de composés de nature chimique différente (Fanlo HW DO, 1998). De plus, de
fréquentes fluctuations qualitative et quantitative de la composition des effluents à traiter pouvant être
à l’ origine de dysfonctionnements de ces procédés biologiques ont été constatées (Voir paragraphe
I.3.3.2). Par conséquent, pour améliorer la gestion de ces systèmes, les travaux de recherche
s’ orientent plus précisément vers un approfondissement des connaissances du fonctionnement des
communautés microbiennes.

Les premières études microbiologiques réalisées sur des procédés de dépollution d’ effluents
gazeux ont montré :
- l’ importante richesse de la flore microbienne (FriedrichHWDO, 2002, Khammar, 2002),
- les performances d’ élimination des polluants sont liées à la structure de la communauté
bactérienne (DevinnyHWDO, 1999b, Khammar, 2002, LiuHWDO, 2002).

Pour comprendre les mécanismes de biodégradation dans ces systèmes complexes, il est donc
nécessaire de mener une approche intégrée de la microflore selon trois axes : densité, diversité, et
résultantes fonctionnelles. De plus, des simulations de dysfonctionnements, en effectuant des
modifications de la composition de l’ effluent gazeux alimentant des réacteurs de laboratoire, peuvent
être envisagées. Cette stratégie a rarement été mise en œ uvre sur les procédés de traitement d’ effluents
gazeux (Khammar, 2002). Néanmoins, cette démarche a été adoptée pour étudier l’ adaptabilité des
communautés microbiennes suite à des perturbations au sein de réacteurs de dépollution d’ effluents
liquides (DelbesHWDO, 2000, FernandezHWDO, 2000, HashshamHWDO, 2000).

Ainsi, ces observations soulèvent les questions suivantes :


- Quel est l’ impact de la charge volumique (masse de polluant entrant dans un procédé par unité de
temps et de volume) sur les performances des réacteurs et sur la diversité de la flore microbienne ?
- Quel est l’ effet des fluctuations de la composition de l’ effluent au cours du temps sur la diversité et
la fonctionnalité de la microflore ? Cet effet varie-t-il en fonction de la charge volumique ?
- Quel FRQVRUWLXP bactérien est capable de dégrader un mélange complexe de onze COV de natures
chimiques différentes (composés oxygénés, aromatiques et chlorés) ?

54
Pour apporter des éléments de réponses aux questions précédemment posées, la démarche adoptée
lors de ce travail est le suivi microbiologique de deux réacteurs traitant des effluents gazeux de même
composition mais de charges volumiques différentes.
- La plus faible (23,1g.h-1.m-3) correspond à une charge volumique classiquement rencontrée dans
les émissions industrielles traitées par ce type de procédés.
- La plus forte (115,5g.h-1.m-3) correspond à une charge volumique utilisée lors de la phase de
pré-acclimatation des boues activées avant l’ inoculation du réacteur ou mesurée lors du
fonctionnement du procédé au cours de perturbations.

Après atteinte de l’ état stationnaire, des fluctuations de la composition en composés oxygénés de


l’ effluent à traiter ont été imposées.
La caractérisation de la microflore est réalisée par trois paramètres :
- l’ activité de biodégradation,
- la densité bactérienne,
- la diversité des communautés microbiennes.

55
,,0DWpULHOVHWPpWKRGHV

II.2.1. Dispositif expérimental


Le dispositif expérimental est composé de deux réacteurs identiques fonctionnant en parallèle.
Chaque réacteur est alimenté par un effluent gazeux pollué dont la charge volumique diffère. Pour plus
de lisibilité, ces réacteurs sont nommés C, pour « concentré » et D pour « dilué », faisant ainsi
référence à la concentration des polluants dans l’ effluent gazeux à traiter. Le schéma du montage est
présenté sur la figure II-1.

)LJXUH,,'LVSRVLWLIH[SpULPHQWDO$SUpOqYHPHQWGHVHIIOXHQWVJD]HX[%SUpOqYHPHQWGHV
pFKDQWLOORQVGHERXHVDFWLYpHV

La figure II-1 montre que le dispositif est composé de 2 éléments :


1 : Le système de génération d’ air pollué
2 : Les réacteurs

56
1) Les COV à l’ état liquide sont contenus dans une seringue. Un pousse seringue Precidor (Infors
AG, Suisse) permet de régler la concentration de chaque polluant dans le flux gazeux entre 140 et
700 mg.m-3. L’ effluent gazeux synthétique est généré par la volatilisation des COV dans un flux d’ air
de 10 L.min-1. Un ballon permet d’ homogénéiser et de stabiliser la composition de l’ air généré.

Le flux d’ air pollué généré est ensuite scindé en deux afin d’ alimenter les deux réacteurs :
- le réacteur C est alimenté par un effluent gazeux contenant les COV à une concentration de 700
mg.m-3 à un débit de 1 L.min-1 après régulation du débit initial,
- le réacteur D est alimenté par un effluent gazeux contenant les COV à une concentration de 140
mg.m-3 à un débit de 1 L.min-1 après respectivement une dilution secondaire au 1/5 de la concentration
des composés et régulation du débit initial.
Le passage de l’ air pollué est ensuite forcé au travers des boues activées contenues dans chaque
réacteur.

2) Les réacteurs en verre ont un volume de 5 L. Ils sont clos, la seule source de carbone est
l’ effluent gazeux. A t = 0, les réacteurs ont été ensemencés au 4/5 avec des boues activées provenant
d’ une station d’ épuration urbaine (Saint Christol-lez-Alès, France). A t = 1 jour, les boues sont
alimentées par l’ effluent gazeux pollué.

Ces réacteurs ont fonctionné à température ambiante entre 20 et 25°C pendant cent dix sept jours.
Le volume des boues est maintenu constant par l'
addition régulière d'
une solution aqueuse enrichie en
minéraux (JuteauHWDO, 1999). La composition de cette solution minérale est notée en annexe 1. Le
pH est maintenu à la neutralité par addition de NaOH (1 M).

II.2.2. Alimentation du réacteur

II.2.2.1. Polluants
Parmi les COV, onze composés ont été retenus. Ces composés peuvent être regroupés selon leur
nature chimique :
- les composés oxygénés :
un alcool : méthanol,
trois cétones : acétone, méthyléthylcétone (MEC), méthylisobutylcétone (MIBC),
deux esters : acétate d’ éthyle (AE), acétate de n-butyle (AB),
- les composés chlorés : dichlorométhane (DCM), 1,2- dichloroéthane (DCE)
- les composés aromatiques : toluène, éthylbenzène (EB), para-xylène (p-xylène)
Le choix s’ est orienté vers ces composés car ils sont représentatifs des émissions anthropiques de
COV usuellement rencontrées et sont largement utilisés comme solvants industriels.

57
Les COV étudiés sont aussi bien des composés aliphatiques qu’ aromatiques ou chlorés. Il peut
être souligné que ces polluants présentent des caractéristiques physico-chimiques très différentes en
terme de pression de vapeur saturante, de solubilité et de biodégradabilité. (Annexe 2)
Le mélange de COV est préparé par pesée des composés à l’ état liquide (Carlo Erba Reagenti,
pureté 99 %).

II.2.2.2. Composition de l’ effluent


La composition de l’ effluent gazeux a été modifiée au cours des cent dix sept jours de
fonctionnement des réacteurs. Ces modifications portent uniquement sur les composés oxygénés ; elles
sont reportées sur la figure II-2 :

)LJXUH,,(YROXWLRQGHODFRPSRVLWLRQGHVHIIOXHQWVJD]HX[OHVUpDFWHXUV'HW&HQIRQFWLRQGX
WHPSV$&RQFHQWUDWLRQGHFKDTXHFRPSRVp%&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpV

58
Les concentrations des composés sont cinq fois plus importantes dans l’ effluent alimentant le
réacteur C que dans l’ effluent alimentant le réacteur D.
Comme le montre la figure II-2, l’ expérience peut être découpée en quatre périodes :

SpULRGH : entre t = 1 et t = 38 jours, l’ effluent gazeux est constitué par les onze composés à une
concentration identique de 700 mg.m-3 ou 140 mg.m-3

SpULRGH : entre t = 39 et t = 47 jours, les esters sont ôtés du mélange,

SpULRGH : entre t = 48 et t = 82 jours, les esters sont réintroduits, mais la concentration des composés
oxygénés dans l’ effluent gazeux est progressivement diminuée. Pour le réacteur C, la concentration
diminue de 700 mg.m-3 à 350 mg.m-3 (entre t = 47 et t = 66 jours) puis à 140 mg.m-3 (entre t = 66 et
t = 82 jours), et pour le réacteur D de 140 mg.m-3 à 70 mg.m-3 (entre t = 47 et t = 66 jours) puis à
28 mg.m-3 (entre t = 66 et t = 82 jours).

SpULRGH : entre t = 83 et t = 117 jours, la concentration des composés oxygénés est augmentée par
paliers jusqu’ au niveau d’ origine. Pour le réacteur C, la concentration augmente de 140 mg.m-3 à
350 mg.m-3 (entre t = 82 et t = 96 jours) puis à 700 mg.m-3, (entre t = 96 et t = 117 jours), et pour
le réacteur D de 28 mg.m-3 à 70 mg.m-3 (entre t = 82 et t = 96 jours) puis à 140 mg.m-3 (entre t = 96
et t = 117 jours).

Ces modifications qualitatives et quantitatives de l’ effluent en composés oxygénés ont été


effectuées après la stabilisation de l’ activité de biodégradation.

II.2.3. Caractérisation de la microflore


La microflore présente dans les boues activées a été caractérisée durant toute la durée de
l’ expérience selon trois paramètres :
- l’ activité de biodégradation,
- la densité bactérienne,
- la diversité de la microflore.

II.2.3.1. Activité de biodégradation


Ce paramètre est évalué en mesurant les performances des réacteurs. Pour cela, la détermination
de la concentration de chaque composé dans l’ effluent gazeux est effectuée quotidiennement à l'
entrée
et à la sortie du réacteur.

59
¾ 3UpOqYHPHQWGHO¶HIIOXHQWJD]HX[
Les concentrations des onze COV dans l’ effluent gazeux sont mesurées directement à la sortie
des points de prélèvements (A sur la figure II-1), grâce à une pompe à membrane KNF installée en
dépression sur le chromatographe. Un tuyau inerte relie les points de prélèvement à la pompe, elle-
même reliée à la vanne d’ échantillonnage du chromatographe en phase gazeuse.

¾ 'pWHUPLQDWLRQGHVFRQFHQWUDWLRQV
La détermination des concentrations de chaque composé est réalisée au moyen d'
un
chromatographe HP 6890 équipé d’ un détecteur à ionisation de flamme. Les conditions analytiques
sont résumées dans le tableau II-1.

7DEOHDX,,&RQGLWLRQVFKURPDWRJUDSKLTXHV

Injecteur Four et colonne chromatographique Détecteur


Température Rampe de température : Température 220°C
150°C 40°C Î 90°C Î 150°C
-1 -1
1 min 15°C.min 4 min 10°C.min Débit d’ air : 310 ml.min-1
Colonne HP-1 (polydiméthylsiloxane) Débit H2 : 46,5 ml.min-1
Débit He (gaz vecteur) : 2,5 ml.min-1 Débit He : 30 ml.min-1

L’ erreur de la mesure a été évaluée en réalisant neuf répétitions sur un effluent gazeux contenant
les onze COV alimentant un réacteur vide. L’ erreur relative à la moyenne (RSD) est de l’ ordre de
10 %, les valeurs propres à chaque composé sont reportées dans le tableau II-2.

7DEOHDX,,9DOHXUVGHO¶HUUHXUUHODWLYHjODPR\HQQHSRXUFKDTXH&29

RSD (%)
Méthanol 9
Acétone 9
MEC 9
MIBC 11
AE 9
AB 10
DCE 9
DCM 11
Toluène 11
EB 11
p- xylène 11

Les résultats de l’ activité de biodégradation (ou résultante fonctionnelle de l’ écosystème) sont


exprimés en pourcentage d’ abattement, qui correspond à la fraction de polluants éliminée par le
procédé. Le pourcentage d’ abattement est défini comme suit :

60
Ci - Cs X100
Abattement (%) = Ci
Avec,
entrée du réacteur (g.m-3),
Ci : Concentration des COV à l'
Cs : Concentration des COV à la sortie du réacteur (g.m-3).

Pour plus de lisibilité dans la présentation des résultats, des valeurs moyennes d’ abattement sur
cinq à dix jours ont été calculées et sont présentées dans le manuscrit.

¾ &RQFHQWUDWLRQGHV&29GDQVOHVERXHV
Les points de prélèvement des échantillons de boues activées sont indiqués sur la figure II-1 (B).
Un volume de 30 mL est prélevé à l’ aide d’ une pipette stérile. A partir de cet échantillon, les analyses
suivantes sont réalisées :
- la mesure de la concentration de chaque COV du mélange dans la phase aqueuse,
- les densités bactériennes,
- la diversité de la microflore.

La mesure de la concentration de sept COV (MEC, MIBC, toluène, EB, p-xylène, DCM et le
DCE) dans les boues est réalisée pendant soixante jours par chromatographie gazeuse selon la
méthode des ajouts dosés. L’ analyse chromatographique est réalisée sur l’ espace de tête d’ un pilulier
fermé par un bouchon équipé d'
un septum et contenant l’ échantillon de boues activées. Le protocole
est reporté en annexe 2.

II.2.3.2. Dénombrements
Les bactéries ont été dénombrées directement au microscope à épifluorescence en utilisant une
double coloration. Le 5-cyano2,3-ditolyl tétrazolium (CTC, polysciences, Warrington, USA) et le 4'
,6-
diaminido-2-phénylindole (DAPI, Sigma) ont été utilisés.
Les échantillons de boues sont prélevés dans les deux réacteurs au même moment, de manière
hebdomadaire. La méthode utilisée est une adaptation de celle utilisée par Khammar, 2002. La double
coloration a été réalisée comme suit :
1) un volume d’ échantillon (2 mL) de boues a été homogénéisé par un broyeur (Ultra turax T25
basic, IKA) pendant 1 min à 19000 rpm, dans 20 mL d'
héxamétaphosphate (1 %).
2) L'
incubation en présence du CTC (5 mM) est réalisée sous agitation à 200 rpm à l'
obscurité
pendant 4 h.
3) Les cellules sont fixées par le formaldéhyde à 3,7 % pendant 30 min.

61
4) Une contre coloration par le DAPI (20 µg.mL-1) est ensuite effectuée pendant 1h à l'
obscurité
et sous agitation à 200 rpm.
5) Les bactéries sont récupérées sur un filtre noir en polycarbonate (Millipore), monté entre
lame et lamelle. Un microscope à épifluorescence (Leica DMLB) équipé d'
un filtre
d'
excitation bleu (BP 340-380nm) et d'
un filtre barrage LP425 a été utilisé. Sur chaque lame,
trente champs ont été dénombrés.
Parallèlement, un témoin négatif de la coloration au CTC est réalisé pour chaque échantillon.
Dans ce cas, l’ étape de fixation a lieu avant l’ incubation en présence de CTC afin d’ inhiber la
respiration cellulaire (les étapes (2) et (3) sont inversées). Sur ce témoin, le dénombrement des
bactéries totales a aussi été réalisé.
Le dénombrement des bactéries totales a donc été réalisé en duplicat, l’ écart-type indiqué dans les
résultats est la moyenne des écarts-types établie sur les deux mesures de trente champs. Dans le cas
des bactéries réduisant le CTC, une seule mesure a été effectuée. L’ écart-type a été par conséquent
calculé à partir des trente champs microscopiques observés.

II.2.3.3. Structure de la communauté microbienne

¾ ([WUDFWLRQGHO¶$'1WRWDOjSDUWLUGHVERXHV
La technique utilisée est celle développée par GodonHWDO, 1997. Elle se déroule en deux étapes.
La première étape consiste en un conditionnement des échantillons permettant leur conservation à -
20°C. Cette étape permet alors de séparer l’ étape de prélèvement de celle de l’ analyse de la flore.

&RQGLWLRQQHPHQW
- un volume de boues activées (4 mL) est homogénéisé en présence d’ une solution de thiocyanate
de guanidine 4 M (Sigma), Tris HCl 0,1 M pH 7,5 et de N - lauryl sarcosine 10 % (Sigma).
- quatre aliquotes de 500 µL sont préparés et placés à -20°C.

([WUDFWLRQGHO¶$'1WRWDO
- un aliquote est incubé pendant 1 h à 70°C en présence de N - lauryl sarcosine 5 %, tampon
phosphate 0,1 M pH 8.
- la lyse des cellules permettant la libération de l’ ADN est effectuée par agitation de l’ échantillon
au moyen d’ un amalgameur (MM200, Retsch) à vitesse maximale (fréquence = 30 s-1) pendant
10 min. Des billes de verre (diamètre = 100 à 250 µm) ont préalablement été ajoutées à
l’ échantillon.
- la séparation de l’ ADN des billes de verre est réalisée suite à l’ ajout de 15 mg de
polyvinylpolypyrrolidone (Sigma). Après une centrifugation de 3 min à 12000 g, le surnageant
est récupéré.

62
- la purification de l’ ADN (piégeage des acides humiques et autres inhibiteurs) est réalisée par
l’ incubation du surnageant en présence d’ un volume d’ isopropanol.
- la pelote d’ ADN est récupérée et mise en présence de RNase 1 mg.ml-1 (Sigma) à 37°C pendant
10 min.
- l’ ADN est alors purifié au moyen d’ un kit QIAamp DNA (Qiagen, Allemagne).

¾ $PSOLILFDWLRQ3&566&3
$PSOLILFDWLRQ
Les séquences cibles ont été amplifiées grâce à deux jeux d’ amorces :
- les amorces W049 et W104 (tableau II-2) ont permis l’ amplification de la région V3 de l’ ADNr
16S bactérien ;
- les amorces W016 et W131 (tableau II-2) permettent l’ amplification partielle de l’ ADNr 18S
eucaryote.

Les amorces W104 et W131 sont marquées en 5’ par le fluorophore 6-carboxyfluoresceine (6-
FAM, Proligo, Madison, Wis, USA). L’ amplification a été réalisée en présence de 1,25 U d’ ADN
polymérase Pfu Turbo (Applied Biosystem), de 1 µL d’ ADN, de tampon Pfu Turbo 10X, de 40 mmol
de Désoxynucléotide Tri-Phosphate (dNTP, Promega), de 0,2 µg de chacune des amorces. Le volume
final a été ajusté à 50 µL.

7DEOHDX,,&DUDFWpULVWLTXHVGHVDPRUFHVXWLOLVpHVDXFRXUVGHFHWWHpWXGH

Nom Séquence Position


W016 5’ -CTTAATTTGACTCAACACGG-3’ E. FROL position F960
W018 5’ -GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ E. FROL position F9
W031 5’ -TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’ E. FROL position R500
W049 5’ -ACGGTCCAGACTCCTACGGG-3’ E. FROL position F330
W104 5’ -6-Fam -TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’ EFROL position R500
W131 5’ -6-Fam -GGGCATCACAGACCTGTT-3’ EFROL position R1195

Les programmes d’ amplification diffèrent selon le domaine amplifié au niveau du nombre de cycles,
du temps de chaque palier thermique et de la température de dénaturation, comme indiqué dans le
tableau II-4.
La taille et la quantité des produits d’ amplification ont été vérifiées sur gel d’ agarose à 2 %
contenant du bromure d’ éthidium.

63
7DEOHDX,,3URJUDPPHG¶DPSOLILFDWLRQO¶$'1UEDFWpULHQHWHXFDU\RWH

domaine bactérien domaine eucaryote

Dénaturation initiale 2 min à 94°C

Dénaturation 94°C 30 sec 94°C 1 min

Hybridation 61°C 30 sec 30 cycles 51°C 1 min 35 cycles

Extension 72°C 30 sec 72°C 1 min


Extension finale 10 min à 72°C

$QDO\VH66&3
La technique utilisée est celle décrite par ZumsteinHWDO, 2000. Les amplifiats ont été dilués en
fonction de l’ intensité des bandes. Ensuite, 1 µL de cette dilution a été ajouté à un mélange de 18,8 µL
de formamide déionisée et de 0,2 µL de standard interne 400 HD Rox (Applied Biosystem).
La dénaturation des échantillons a été effectuée à 94°C pendant 5 min, puis les tubes ont été
placés dans la glace fondante pendant 10 min.
L’ analyse SSCP a été réalisée par une électrophorèse capillaire (Séquenceur Automatique ABI
310, Applied Biosystem). Au cours de l’ analyse, 5 µL de chaque échantillon a été chargé sur un
polymère (Genescan Polymer, glycérol 10 %, TBE 1 %).

Les molécules d’ ADN simple brin sont détectées grâce à la présence lors de l’ amplification d’ une
amorce fluororescente, 6-Fam, qui est révélée par un laser. La présence de fragments d’ ADN est
traduite par l’ apparition d’ un pic sur l’ électrophorégramme. La comparaison des différents
échantillons est possible grâce à la présence d’ un marqueur interne. Le standard interne est marqué par
un fluorochrome différent, et permet, après une correction informatique des résultats, une comparaison
des différents échantillons.
Les résultats sont donnés sous forme de chromatogrammes pour lesquels un pic correspond à un
phylotype.

L’ analyse des spectres SSCP est réalisée d’ une part par comparaison visuelle des profils, mais
aussi à l’ aide du logiciel SSCP2 développé à l’ INRA de Narbonne (PaulouHWDO, 2003). Ce logiciel
permet de détecter les pics, et ainsi de les dénombrer, puis de réaliser l’ ACP.

¾ $PSOLILFDWLRQ3&5FORQDJHVpTXHQoDJH
Pour réaliser l’ identification de la flore bactérienne présente dans les boues activées du réacteur
D, la séquence du gène de l’ ADNr 16S a été partiellement amplifiée grâce à l’ utilisation de l’ amorce
universelle W031 et de l’ amorce W018 spécifique du domaine bactérien.

64
L’ amplification a été réalisée en présence de 1 U d’ ADN polymérase Taq red (Sigma), de 1 µL
d’ ADN, de Tampon Taq Red 10X, de 40 mmol de dNTP (Promega), de 0,2 µg de chacune des
amorces (Proligo). Le volume final est ajusté à 50 µL.
Le programme d’ amplification a été réalisé comme suit :
dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min,
1 min à 94°C,
puis 30 cycles composés de 3 paliers comme suit 1 min à 55°C,
1 min à 72°C
et une extension finale de 10 min à 72°C.

Le produit d’ amplification a été vérifié sur gel d’ agarose à 2 % contenant du bromure d’ éthidium.
Un fragment de cinq cents paires de bases a été amplifié.
Le clonage a été réalisé avec le kit TOPO TA cloning (Invitrogen, Pays-Bas) selon les consignes
du fournisseur. La purification du produit d’ amplification à été réalisée grâce au kit QIAquick PCR
purification (Qiagen).
Cent quatre-vingt six clones d’ ADNr 16S ont ensuite été repiqués sur milieux LB contenant de
l’ ampicilline avant leur mise en culture sur deux microplaques en présence de milieux 2YT contenant
de l’ ampicilline et du glycérol. Les microplaques ont été congelées à -80°C avant le séquençage des
clones.
Le séquençage a été réalisé par la société Millegen (Toulouse, France).

¾ 7UDLWHPHQWGHVVpTXHQFHV
7UDLWHPHQWSUpOLPLQDLUHGHVVpTXHQFHV
Dans un premier temps, les cent quatre-vingt six séquences d’ environ neuf cents paires de bases
chacune ont été traitées par Millegen :
Les fichiers de séquences ont été nettoyés des séquences dites "bad" selon les critères de l'
analyse
par le logiciel PHRED (Ewing et Green, 1998, EwingHWDO, 1998). A partir de cette analyse, quatre
séquences ont été rejetées. Les autres séquences contiennent en moyenne cinq cents paires de bases
d’ ADNr 16S.

7UDLWHPHQWGHVVpTXHQFHV
Les séquences ont été comparées à la base de données nucléotidiques EMBL.

Le traitement des séquences a, par la suite, été réalisé sous le logiciel ARB (Ludwig HW DO,
2004) :
™ Dans un premier temps une base de référence sur la diversité des boues activées a été
construite sur la base de 25 000 séquences de ARB (LSU 16S DNA janv2003). Au final, la

65
base de données comporte les séquences provenant des inventaires moléculaires réalisés sur
des échantillons prélevés dans des systèmes de boues activées suivants : Juretschko HW DO,
2002 ;Bond HW DO, 1995, Chouari HW DO, 2003, Christensson HW DO, 1998, Crocetti HW DO,
2002, DabertHWDO, 2001, EschenhagenHWDO, 2003, HesselmannHWDO, 1999, LaParaHWDO,
2000, Lee HW DO, 2002a, Snaidr HW DO, 1997, Wagner et Cloete, 2002 ; et les séquences
provenant d’ une unité pilote de biofiltration à l’ échelle de laboratoire traitant un effluent
gazeux chargé en COV (KhammarHWDO, 2005)
™ Les séquences obtenues à partir des échantillons de boues activées du réacteur D ont ensuite
été ajoutées à la base de référence.

™ Sur toutes ces séquences, le travail réalisé a été le suivant :


- alignement de séquences réalisé automatiquement grâce aux outils du logiciel ARB,
- corrections manuelles des alignements,
- introduction des séquences dans un arbre de référence (tree_1400) contenant des
séquences des principales divisions du domaine bactérien par la méthode de parcimonie,
- définition du placement phylogénétique de séquences,
- détermination des phylotypes, grâce à la réalisation de la matrice des distances. Le seuil
de similarité retenu pour un phylotype est de 97 % (Stackebrandt et Goebel, 1994).

66
,,5pVXOWDWV
Dans cette étude la microflore présente dans les boues activées a été caractérisée selon trois
paramètres :
- l’ activité de biodégradation,
- la densité bactérienne,
- la structure de la communauté bactérienne.

L’ activité de biodégradation est évaluée pour chaque réacteur par l’ abattement des composés. En
effet, la concentration de chaque composé a été mesurée quotidiennement, pendant cent dix sept jours
de fonctionnement, en entrée et en sortie des réacteurs, permettant ainsi de calculer les pourcentages
d’ abattement. Différents niveaux de dégradation sont présentés pour chaque réacteur :
- l’ activité globale de dégradation,
- l’ activité de dégradation selon la nature chimique du composé (Composés oxygénés,
aromatiques et chlorés),
- l’ activité de dégradation selon le composé.

Afin de vérifier que les pourcentages d’ abattement obtenus sont dus à une activité bactérienne et
non à des phénomènes de sorption dans la suspension de boues aérées, la concentration des COV dans
la phase aqueuse a été également dosée.

Les densités bactériennes ont été déterminées par l’ utilisation de deux marqueurs : le DAPI et le
CTC. Ce dernier permet de dénombrer les bactéries qui possèdent une activité respiratoire et le DAPI
de déterminer le nombre de bactéries totales.

La structure de la communauté de deux domaines phylogénétiques a été suivie au cours de ce


travail : la communauté bactérienne et la communauté eucaryote. La composition de chaque domaine
est visualisée grâce à la méthode SSCP.

67
II.3.1. Activité de biodégradation globale des réacteurs
L’ évolution des performances des réacteurs C et D durant les cent dix sept jours de l’ expérience
est présentée sur la figure II-3.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWJOREDOGHV&29HQIRQFWLRQGXWHPSVSRXUOHVUpDFWHXUV&HW
'

Sur la figure II-3, les quatre périodes de l’ expérience, correspondant aux différentes compositions
de l’ effluent à traiter, sont représentées (figure II-2).

Les pourcentages d’ abattement globaux obtenus sont supérieurs pour le réacteur D. En effet,
l’ abattement moyen sur la totalité de l’ expérience est respectivement de 80 % pour le réacteur D et de
35 % pour C. De plus, ce dernier présente une plus grande variation autour de la moyenne.

¾ Concentration des COV dans les boues


Les composés dont la concentration a été mesurée dans les boues, sont les suivants : MEC,
MIBC, toluène, EB, p-xylène, DCM et le DCE. Les concentrations moyennes retrouvées durant les
soixante premiers jours de fonctionnement des réacteurs sont présentées dans le tableau II-5.

68
7DEOHDX,,&RQFHQWUDWLRQPR\HQQHGHVIDPLOOHVGHSROOXDQWVGDQVOHVERXHVDFWLYpHVGHVUpDFWHXUV
&HW'DXFRXUVGHVTXDUDQWHVHSWSUHPLHUVMRXUVGHO¶H[SpULHQFH

Concentration en mg.l-1
Réacteur Oxygénés Chlorés Aromatiques globale
C 324 16 7 701
D 8 8 3 41

Le tableau II-5 montre que les concentrations des COV dosés sont plus élevées dans le réacteur C.
Ce dernier est alimenté par l’ effluent gazeux dont la concentration est la plus élevée.
De plus, pour le réacteur C, la concentration des composés oxygénés est plus élevée que celle des
composés chlorés, qui est elle-même supérieure à celle des composés aromatiques. Pour le réacteur D,
la concentration des composés oxygénés et chlorés est supérieure à celle des composés aromatiques.
La part des composés dosés dans les boues activées représente respectivement pour les réacteurs
C et D, 5,7 % et 2,5 % de la quantité totale des 7 COV dégradés pendant les quarante sept premiers
jours.

II.3.2. Période 1 : fonctionnement de la microflore en conditions


stables
Cette période s’ étend de t = 0 à t = 38 jours. La concentration de chacun des onze composés est
de 700 mg.m-3 dans l’ effluent alimentant le réacteur C et de 140 mg.m-3 dans celui alimentant le
réacteur D (cf figure II-2).

II.3.2.1. Activité de biodégradation

¾ $EDWWHPHQWJOREDO
Les abattements moyens globaux obtenus au cours de cette période sont donnés sur la figure II-4.

)LJXUH,,$EDWWHPHQWJOREDOHQIRQFWLRQGXWHPSVGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'

69
5pDFWHXU&
Au cours de cette période, l’ abattement global est en moyenne de 33 %. Cependant, cette valeur
n’ est pas constante au cours du temps. Elle diminue de 57 % à t = 1 jour à 23 % entre t = 31 et t = 38
jours.

5pDFWHXU'
Compte tenu de l’ erreur de la mesure de la concentration des composés, l’ abattement global du
réacteur D est stable au cours de cette période. Il est de 79 %.

¾ 6HORQODQDWXUHFKLPLTXHGXFRPSRVp
5pDFWHXU&
La figure II-5 présente, pour le réacteur C, les abattements moyens des familles chimiques :
composés oxygénés, aromatiques et chlorés.

)LJXUH,,$EDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVHQIRQFWLRQGXWHPSVGDQVOH
UpDFWHXU&

Les composés chlorés ne sont pas dégradés, les valeurs négatives obtenues et présentées sur la
figure II-5 sont dues aux fluctuations de la concentration en polluants dans l’ effluent généré.
L’ abattement des composés aromatiques s’ élève à 11 %. Cette valeur ne peut être attribuée à une
activité microbienne compte tenu de l’ erreur de mesure estimée à 11 % dans le cas de ces derniers.
Seuls, les composés oxygénés sont éliminés.

70
La dégradation des composés oxygénés n’ est pas constante au cours du temps. A t = 1 jour, le
taux d’ abattement est à son niveau le plus élevé, il est proche de 100 %. Puis, une forte diminution des
pourcentages d’ abattement est observée et, à t = 38 jours, l’ abattement atteint 39 %.
De plus, la dégradation des différents composés oxygénés n’ est pas identique. Les composés
oxygénés peuvent être répartis en quatre groupes selon l’ évolution des valeurs d’ abattements
observées :
- les esters (AB et AE),
- la MIBC et l’ acétone,
- la MEC,
- le méthanol
La figure II-6 présente l’ abattement moyen des différents composés oxygénés en fonction du
temps.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWVFRPSRVpVR[\JpQpVGDQVOHUpDFWHXU&

Les abattements figurant sur la figure II-6 montrent que la dégradation des esters est stable au
cours du temps ; elle est quasiment totale. En revanche, la dégradation des quatre autres composés
(trois cétones et un alcool) diminue au cours de cette période. Cette diminution est plus importante
dans le cas de la MIBC et de l’ acétone.

71
- La dégradation de la MIBC et de l’ acétone diminue de 84 % à 28 % entre t = 1 jour à t = 2-5
jours. Entre t = 2 et t = 30 jours, les valeurs des abattements sont en moyenne de 14 %. Ces
composés ne sont plus dégradés à partir de t = 31 jours.
- La dégradation de la MEC diminue elle aussi de 93 % à 32 % entre t = 1 jour à t = 2-5 jours.
Le pourcentage d’ abattement se stabilise ensuite autour de 30 %.
- Le pourcentage d’ abattement du méthanol diminue progressivement au cours du temps, de
99 % à t = 1 jour à 25 % à t = 31-38 jours.

5pDFWHXU'
La figure II-7 présente, pour le réacteur D, les abattements moyens des familles chimiques :
composés oxygénés, aromatiques et chlorés.

)LJXUH,,$EDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVHQIRQFWLRQGXWHPSVGDQVOH
UpDFWHXU'

Les pourcentages d’ abattement obtenus sont les suivants :


- l’ élimination des composés chlorés présente un abattement moyen de 59 %. Les valeurs
d’ abattement augmentent de 51 % à 73 % entre t = 1 et t = 11-20 jours. Ensuite les valeurs
diminuent, elles atteignent 47 % entre t = 31 et t = 38 jours.

72
- les composés aromatiques présentent un abattement moyen de 53 %. Les valeurs
d’ abattement augmentent de 44 % à 72 % entre t = 1 et t = 11-20 jours. Ensuite les valeurs
ont tendance à diminuer, elles atteignent 54 % entre t = 31 et t = 38 jours.
- les composés oxygénés présentent une élimination proche de 100 %

La dégradation d’ un composé est similaire à celle des autres membres de la famille chimique
auquel il appartient. C’ est pourquoi la dégradation de chaque composé ne sera pas présentée pour ce
réacteur.

II.3.2.2. Densités bactériennes


Les cellules marquées par le DAPI sont notées DAPI+, et celles capables de réduire le CTC sont
notées CTC+.
La figure II-8 présente les résultats des dénombrements entre t = 1 et t = 38 jours.

)LJXUH,,'\QDPLTXHVGHVGHQVLWpVEDFWpULHQQHVGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'DXFRXUVGHODSUHPLqUH
SpULRGH

&HOOXOHV'$3,&HOOXOHV&7& 

Les densités de peuplement d’ un échantillon de boues prélevées dans la station d’ épuration sont
de 3,1*108 bactéries totales.mL-1. Le ratio « bactéries CTC+ » sur « bactéries DAPI+ » s’ élève à 10 %.

5pDFWHXU&
La densité de la flore DAPI+ a tendance à diminuer au moment du démarrage du réacteur, entre
t = 1 et t = 4 jours. Le nombre de cellules est divisé par quatre (8,8*107 cellules.mL-1 à t = 4 jours).
Ensuite, la densité bactérienne augmente et 1,4*109 cellules.mL-1 sont dénombrées à t = 36 jours. Le
ratio « bactéries CTC+ » sur « bactéries DAPI+ » atteint, en moyenne, entre t = 2 et t = 36 jours, la
valeur de 24 %.

73
5pDFWHXU'
Le nombre de bactéries DAPI+ présente dans les boues activées diminue de 55 % entre t = 1 et
t = 4 jours. En effet, 1,4*108 cellules DAPI+.ml-1 sont dénombrés quatre jours après la mise en route
du réacteur. Ensuite, la densité bactérienne augmente, elle atteint 7,7*108 cellules.ml-1 à t = 36 jours.
Le ratio « bactéries CTC+ » sur « bactéries DAPI+ » est de 12 %.

&RPSDUDLVRQGHVGHQVLWpVEDFWpULHQQHVGHVGHX[UpDFWHXUV
La figure II-9 présente les résultats des dénombrements des cellules DAPI+ entre t = 1 et t = 38
jours pour les deux réacteurs.

)LJXUH,,&RPSDUDLVRQGHVGpQRPEUHPHQWV'$3,SRXUOHVUpDFWHXUV&HW'
5pDFWHXU&5pDFWHXU' 

Bien que la densité des cellules DAPI+ mesurée dans les boues aérées du réacteur C soient en
moyenne deux fois plus élevées à partir de t = 9 jours que celle du réacteur D, aucune différence
significative entre les densités de peuplement des deux réacteurs ne peut être mise en évidence.

II.3.2.2. Structure des communautés microbiennes


Un échantillon de boues a été prélevé à raison d’ une fois par semaine en moyenne pendant toute
la durée du fonctionnement des réacteurs, soit vingt deux échantillons par réacteur.
L’ analyse SSCP de la flore bactérienne présente dans des échantillons de boues activées prélevés
dans un réacteur biologique de traitement d’ un effluent gazeux contenant le mélange de onze COV au
même moment montre une flore similaire (figure II-10,A). Cependant, des variations de l’ image de la
flore peuvent être enregistrées si l’ événement PCR est différent (figure II-10,B).

74
A B

)LJXUH,,,PDJHGHODIORUHEDFWpULHQQHSUpVHQWHGDQVGLIIpUHQWVpFKDQWLOORQVGHERXHVDFWLYpHV
$LVVXHGXPrPHpYqQHPHQW3&5%LVVXHG¶pYqQHPHQWV3&5GLIIpUHQWV

Par conséquent, l’ amplification des échantillons de boues issus du réacteur C ou D a été réalisée
en une seule fois.

Dans notre étude, l’ image de la diversité est donnée par un électrophorégramme. La diversité de
l’ écosystème est estimée selon deux paramètres :
1) la richesse de l’ écosystème, quantifiée par le nombre de pics. L’ hypothèse de travail étant
qu’ XQSLFFRUUHVSRQGjXQSK\ORW\SH,
2) la présence de pics dominants c’ est à dire de pics présentant une intensité de signal
supérieure aux autres.

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
La figure II-11 présente les électrophorégrammes de la communauté bactérienne obtenus à partir
d’ échantillons de boues prélevés entre t = 0 et t = 38 jours. Les dynamiques bactériennes sont
différentes. Pour plus de lisibilité, certains pics ont été annotés.

75
)LJXUH,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'HQWUHW HWW MRXUV

D’ après la figure II-11, la richesse de l’ écosystème exprimée en nombre de pics est généralement
plus importante pour les échantillons issus du réacteur D par rapport à ceux issus du réacteur C. En
effet, en moyenne, une trentaine de pics sont dénombrés sur les profils provenant du réacteur D ; alors
qu’ une vingtaine de pics sont dénombrés sur les profils issus d’ échantillons du réacteur C.

76
5pDFWHXU&
L’ image de la communauté évolue pendant cette première période.
Entre t = 0 et t = 9 jours, le nombre de pics dénombrés diminue de vingt huit à neuf. Il augmente à
t = 11 jours et quinze pics sont dénombrés. A t = 15 jours, trois pics sont dénombrés. Puis, le nombre
de pics augmente et à partir de t = 22 jours, dix huit pics sont visibles sur le profil obtenu à t = 36
jours.
Le pic dominant n’ est pas identique sur tous les profils. Entre t = 1 et t = 9 jours, les pics
présentant les intensités les plus élevées, sont situés sur la droite du profil. A t = 11 jours, le pic 
émerge sur la gauche du profil, il co-domine avec le pic , dominant sur le profil précédent.
A partir de t = 22 jours, l’ image de la communauté bactérienne peut être divisée en deux parties :
- sur la gauche du profil figure la flore dominante (le pic  est dominant), la flore localisée sur la
droite du profil n’ est pas visible.
- sur les deux derniers profils, les pics les plus élevés se situent toujours sur la gauche du profil,
cependant le pic présentant l’ intensité la plus forte est le pic . Sur la droite du profil,
l’ intensité des pics varie.

5pDFWHXU'
La structure de la communauté bactérienne montre peu d’ évolution. Le nombre de pics reste élevé
pendant toute la période. A t = 1 jour, vingt huit pics sont dénombrés sur le profil, et trente sept pics
sont déterminés à t = 36 jours. Aucune simplification de la flore dominante n’ est donc visible. De plus,
les pics présentent des hauteurs de pics équivalentes. L’ image du domaine bactérien est similaire sur
tous les profils.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
La figure II-12 présente les électrophorégrammes obtenus pour les réacteurs C et D après
amplification de séquences spécifiques du domaine eucaryote.
L’ amplification a été réalisée sur un nombre moins important d’ échantillons que dans le cas de
l’ étude de la diversité du domaine bactérien. De plus, pour certains échantillons, et plus
particulièrement pour ceux provenant du réacteur D, l’ amplification n’ a pas fonctionné.
Dans les deux réacteurs, les profils sont différents lors de chaque analyse. Le nombre de pics
visibles sur les profils est moins élevé que dans le cas du domaine bactérien, ils sont regroupés sur la
gauche de l’ électrophorégramme. Le nombre de pics est plus important pour le réacteur D que pour le
réacteur C.

77
)LJXUH,,'\QDPLTXHGHVHXFDU\RWHVGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'HQWUHW HWW MRXUV

II.3.3. Période 2 : effet de fluctuations de la composition de


l’ effluent gazeux sur le fonctionnement de la microflore :
suppression des esters
La deuxième période s’ étend de t = 39 à t = 47 jours. Les esters ont été supprimés du mélange de
COV. La concentration des autres composés n’ a pas été modifiée.

II.3.3.1. Activité de biodégradation


5pDFWHXU&
La figure II-13 présente les abattements moyens atteints pour les trois familles de COV pour le
réacteur C.

78
)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU
&DXFRXUVGHODGHX[LqPHSpULRGH

Les résultats présentés sur la figure II-13 montrent que la modification de la composition de
l’ effluent n’ induit pas de modification de l’ abattement global.
Les valeurs d’ abattement des composés chlorés et aromatiques augmentent respectivement de 0 et
1 % à 13 % et 14 %. Certes, ces dernières sont supérieures à celles mesurées à t = 31- 38 jours, mais
compte tenu de l’ erreur de la mesure (9 % pour les composés chlorés et 11 % pour les composés
aromatiques), l’ amélioration de la biodégradation de ces composés est limitée. L’ abattement des
composés oxygénés est stable à 39 %.
La figure II-14 présente les abattements détaillés pour les composés oxygénés dans le réacteur C.

79
)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWVFRPSRVpVR[\JpQpVGDQVOHUpDFWHXU&
HQWUHW HWW MRXUV

La stabilité des valeurs d’ abattement des composés oxygénés est due à une augmentation de
l’ élimination des cétones, et plus particulièrement de la MEC (figure II-13). Le pourcentage
d’ abattement atteint 71 % soit une augmentation d’ un facteur trois du pourcentage d’ abattement de ce
composé obtenu entre t = 31 et t = 38 jours (24 %). La valeur d’ abattement de l’ acétone et de la MIBC
est de 22 % en moyenne au cours de cette période. L’ élimination du méthanol est stable par rapport à
la période précédente (30 %).

5pDFWHXU'
La figure II-15 présente les abattements moyens atteints pour les trois familles de COV pour le
réacteur D.

80
)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU
'DXFRXUVGHODGHX[LqPHSpULRGH

Après la modification de la composition de l’ effluent, l’ abattement global a tendance à augmenter


de 76% à 88 %, entre t = 39 et t = 44 jours,. Cette augmentation s’ explique par une meilleure
élimination des composés aromatiques et chlorés avec des abattements atteignant respectivement 75 %
et 84 % au lieu de 54 % et 47 % entre t = 31 et t = 38 jours. L’ abattement des composés oxygénés
reste stable à 100 %.
Entre t = 45 et t = 47 jours, les valeurs des abattements ont tendance à diminuer par rapport aux
valeurs mesurées entre t = 39 et t = 44 jours. Les valeurs obtenues à t = 47 jours sont supérieures à
celles obtenues entre t = 31 et t = 38 jours ; elles augmentent respectivement de 47 % et 54 % à 60 %
et 63 % pour les composés chlorés et les aromatiques. Cependant ces résultats sont à manier avec
prudence compte tenu de l’ erreur de la mesure (10%). L’ élimination des composés oxygénés reste
stable.

II.3.3.2. Densités bactériennes


Les résultats des dénombrements bactériens réalisés au cours de cette période sont indiqués dans
le tableau II-5.

81
7DEOHDX,,5pVXOWDWVGHVGpQRPEUHPHQWVEDFWpULHQVHIIHFWXpVjW MRXUGHIRQFWLRQQHPHQWGHV
UpDFWHXUV&HW'

Dénombrement (Cellules.mL-1)
Réacteur C Réacteur D
T= DAPI+ CTC + DAPI+ CTC +
36 (1,4± 0,7)*109 (3,3±1,9)*108 (7,7± 2,5)*108 (1,1±1,0)*108
43 (1,8± 0,8)*109 (3,6± 0,9)*108 (7,6± 1,8)*108 (8,2±2,0)*107

Les valeurs du dénombrement effectué au cours de cette période restent stables par rapport à celle
obtenues à t = 36 jours.
Le ratio des cellules CTC+ sur les cellules DAPI + diminue dans le réacteur C et atteint une
valeur de 19 %, celui du réacteur D reste similaire à celui de la période précédente, soit 15 %.

II.3.3.3. Structure des communautés microbiennes

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
La figure II-16 présente les électrophorégrammes de la communauté bactérienne.

)LJXUH,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHDXFRXUVGHODGHX[LqPHSpULRGHG¶DOLPHQWDWLRQGDQVOHV
UpDFWHXUV&HW'UpYpOpHSDUODPpWKRGH66&3

82
5pDFWHXU&
La structure du domaine bactérien montre que l’ image obtenue par la méthode SSCP n’ évolue pas
au cours de cette période. En effet, les pics sur les différents profils co-migrent, les rapports de
dominance sont conservés. Sur les trois profils, dix huit pics sont dénombrés.

5pDFWHXU'
Une simplification très rapide de la communauté bactérienne est notée. Elle se traduit par
l’ apparition, sur le profil de t = 40 jours, de quatre pics plus importants que les autres. Ces pics sont
répartis tout au long du profil, mais ceux situés sur la droite du profil, et notés  et , présentent une
intensité plus élevée. Cette évolution est confirmée par l’ image obtenue à partir de l’ échantillon
prélevé à t = 43 jours.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
Aucun échantillon issu du réacteur D n’ a pu être amplifié. La figure II-17 présente donc
uniquement les électrophorégrammes obtenus pour les échantillons issus du réacteur C.
La comparaison des profils obtenus avant et après la modification de l’ effluent montre la perte du
pic situé à l’ extrême gauche sur le profil. Le pic dominant, noté HVWOHPême sur les deux profils.

)LJXUH,,'\QDPLTXHGHODFRPPXQDXWpHXFDU\RWHGDQVOHUpDFWHXU&DXFRXUVGHODGHX[LqPH
SpULRGH

83
II.3.4. Période 3 : effet de fluctuations de la composition de
l’ effluent gazeux sur le fonctionnement de la microflore :
diminution de la concentration des composés oxygénés
Cette période s’ étend de t = 48 à t = 82 jours. Les modifications apportées à l’ effluent à traiter
consistent en la réintroduction des esters et en une diminution par palier de la concentration des
composés oxygénés (Figure II-2) :
- entre t = 48 et t = 66 jours, la concentration est diminuée de moitié, soit une concentration de
350 mg.m-3 pour le réacteur C et de 70 mg.m-3 pour le réacteur D.
- entre t = 67 et t = 82 jours, la concentration est diminuée au 1/5 par rapport à la concentration
initiale, soit 140 mg.m-3 pour le réacteur C et 28 mg.m-3 pour le réacteur D.

II.3.4.1. Activité de biodégradation


5pDFWHXU&
La figure II-18 présente les abattements moyens atteints par les différentes familles chimiques
de COV.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU&DXFRXUV
GHODWURLVLqPHSpULRGH

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 
La diminution de la concentration des composés oxygénés entraîne une augmentation de
l’ abattement global de 23 % à 43 %.

84
Cette augmentation n’ est pas due à une modification significative de l’ élimination des composés
aromatiques et chlorés. En revanche, la dégradation des composés oxygénés augmente de 39 % à 69 %
entre t = 31-38 et t = 82 jours. L’ amélioration des performances est observée lors du deuxième palier
de concentration.

La figure II-19 présente les abattements moyens des différents composés oxygénés.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWVFRPSRVpVR[\JpQpVGDQVOHUpDFWHXU&

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

Les abattements détaillés sont les suivants :


- les esters sont totalement dégradés dès leur réintroduction dans le mélange.
- les pourcentages d’ abattement des cétones augmentent à chaque diminution de la
concentration des composés oxygénés :
- l’ abattement de la MEC augmente jusqu’ à atteindre 100 %.
- l’ abattement de l’ acétone et la MIBC augmente jusqu’ à 38 %.
- le pourcentage d’ abattement du méthanol diminue lorsque la concentration de composés
oxygénés est de 140 mg.m-3 et devient nul à partir de t = 48 jours. Le méthanol est à
nouveau éliminé à t = 66 jours, et son abattement atteint 39 % lors de la seconde
diminution de la concentration des composés oxygénés.

85
5pDFWHXU'
La figure II-20 présente les abattements moyens atteints par les différentes familles chimiques
de COV pour le réacteur D.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU
'DXFRXUVGHODWURLVLqPHSpULRGH

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

La diminution de la concentration des composés oxygénés de 140 mg.m-3 à 28 mg.m-3 n’ entraîne


pas de modification de l’ abattement global.
Cependant cette stabilité de l’ abattement global masque des évolutions différentes de l’ efficacité
d’ élimination par famille de composés. La dégradation des composés oxygénés reste stable à 100 %.
L’ abattement des composés aromatiques augmente de 54 % à 73 %. Les valeurs de l’ abattement des
composés chlorés ont tendance, dans un premier temps, à augmenter (de 47 à 62 %), puis elles
diminuent de moitié pour atteindre 30 % à t = 68-82 jours.

II.3.4.2. Densités bactériennes


La figure II-21 présente les résultats des dénombrements réalisés après la double coloration au
DAPI-CTC sur des échantillons prélevés entre t = 36 et t = 82 jours pour les réacteurs C et D.

86
Les dénombrements des cellules CTC+ n’ ont pu être réalisés à t = 66 jours, ainsi qu’ à t = 75 jours
à cause d’ un problème technique.

)LJXUH,,'\QDPLTXHVGHVGHQVLWpVEDFWpULHQQHVGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'HQWUHW HWW 


MRXUV
&HOOXOHV'$3,&HOOXOHV&7& 

Les valeurs obtenues au cours de cette période montrent que les densités bactériennes sont
stables. Elles sont de 1,9*109 cellules DAPI+.mL-1 pour le réacteur C et de 5,5*108 cellules.mL-1 pour
le réacteur D.
Les ratios CTC+ sur DAPI+, eux aussi se stabilisent, à une valeur inférieure à 10 % pour le
réacteur D, et 19 % dans le cas du réacteur C.

II.3.4.3. Structure des communautés microbiennes

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
La figure II-22 présente les électrophorégrammes du domaine bactérien. Les dynamiques
bactériennes suivent toujours deux évolutions distinctes.

87
)LJXUH,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHDXFRXUVGHODWURLVLqPHSpULRGHG¶DOLPHQWDWLRQGDQVOHV
UpDFWHXUV&HW'

5pDFWHXU&
La diminution de la charge volumique en composés oxygénés, n’ entraîne pas de modification
notable de la structure de la communauté bactérienne. Les pics dominants sont toujours sur la gauche
du profil et sont identiques jusqu’ à la fin de la période. Sur les profils, dix huit pics sont dénombrés.

88
5pDFWHXU'
L’ échantillon prélevé à t = 57 jours n’ a pas pu être amplifié.
Des changements de l’ image de la communauté sont visibles entre t = 43 jours et t = 64 jours. La
simplification visualisée sur les profils de la période précédente n’ est plus observée. Le nombre de
pics dénombrés à t = 64 jours est de trente cinq, ils sont repartis sur tout le profil.
Les deux premiers profils obtenus lors du second palier de concentration (t = 68 et t = 71 jours)
montrent une image globalement semblable à celle de la période précédente. Le profil suivant présente
moins de pics sur la partie gauche du profil, la partie droite est similaire aux précédentes. Le nombre
de pics dénombrés est de trente deux à t = 68 et t = 71, et de vingt trois à t = 75 jours.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
La figure II-23 présente les électrophorégrammes de la communauté eucaryote.
L’ amplification du domaine eucaryote n’ a pas fonctionnée pour les échantillons prélevés à t = 43
et t = 64 jours.
La richesse de l’ écosystème est plus élevée dans les échantillons du réacteur D que dans ceux du
réacteur C.
Sur les profils obtenus à partir des échantillons du réacteur C, le pic présentant l’ intensité la plus
élevée est le même avant et après la diminution de la concentration des oxygénés dans l’ effluent
gazeux. En revanche, seul un pic et trois épaulements sont visibles sur le profil à t = 71 jours pour
quatre pics et trois épaulements à t = 40 jours.

)LJXUH,,'\QDPLTXHGHODIORUHHXFDU\RWHGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'

89
L’ analyse de l’ échantillon de boues prélevé à t = 71 jours dans le réacteur D montre huit pics, or
deux pics seulement avaient été visualisés pour l’ échantillon réalisé à t = 22 jours.

II.3.5. Période 4 : effet de fluctuations de la composition de


l’ effluent gazeux sur le fonctionnement de la microflore :
augmentation de la concentration des composés oxygénés
Cette phase s’ étend entre t = 83 et t = 117 jours. Les modifications apportées à l’ effluent à traiter
consistent en une augmentation progressive de la concentration des composés oxygénés jusqu’ à la
concentration initiale :
- entre t = 83 et t = 96 jours, la concentration des composés oxygénés atteint 350 mg.m-3 pour le
réacteur C, et 70 mg.m-3 pour le réacteur D.
- entre t = 97 et t = 117 jours, la concentration atteint la valeur initiale, soit 700 mg.m-3 pour le
réacteur C et 140 mg.m-3 pour le réacteur D.

II.3.5.1. Activité de biodégradation


5pDFWHXU&
La figure II-24 présente les abattements moyens atteints par les différentes familles chimiques
de COV. Cette figure permet de visualiser l’ impact de l’ augmentation de la concentration des
composés oxygénés, ainsi que le retour à la concentration initiale grâce à la présentation des valeurs
obtenues entre t = 31 et t = 38 jours.

90
)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU
&HQWUHW HWW MRXUV

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

Les valeurs de l’ abattement global ont tendance à diminuer lors de l’ augmentation de la


concentration des composés oxygénés à 350 puis 700 mg.m-3 de 43 % à 28 %.

L’ élimination suivant la nature chimique des composés est la suivante :


- les composés aromatiques et chlorés ne sont pas dégradés quelle que soit la concentration des
composés oxygénés.
- une diminution de l’ abattement des composés oxygénés est notée de 69 % à 49 %, entre
t = 83 et t = 96 jours. Lors de la seconde augmentation de la concentration des composés
oxygénés, les valeurs d’ abattement restent stables à 51 %.

La figure II-25 présente les abattements moyens des différents composés oxygénés.

91
)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWVFRPSRVpVR[\JpQpVREWHQXDXFRXUVGH
ODTXDWULqPHSpULRGHGDQVOHUpDFWHXU&

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

Les valeurs d’ abattement des composés oxygénés suivent des évolutions différentes :
- la dégradation des esters est stable,
- l’ élimination de la MEC diminue de 100 à 46 %, puis de 46 % à 35 %,
- l’ élimination du méthanol a tendance à augmenter pour atteindre des valeurs d’ abattement de
51 %,
- l’ abattement de la MIBC et de l’ acétone diminue, de 38 % à 12 %, dès la première
augmentation de la concentration en composés oxygénés puis les valeurs restent stables à
16 % entre t= 97 et t=117 jours.

La comparaison des valeurs d’ abattement des périodes t = 30-38 jours et t = 97-117 jours montre
que les valeurs obtenues sont similaires au niveau des familles de composés (figure II-24). Les valeurs
d’ abattements des composés oxygénés ont tendance à être plus élevées pour la période comprise entre
t = 97 et t = 117 jours (39 % pour 52 % entre t = 1 et t = 38 jours). Cette différence s’ explique par une
amélioration de la dégradation du méthanol (51 % d’ abattement entre t = 97 et t = 117 jours pour 25 %
entre t = 30 et t = 38 jours). Les valeurs d’ abattement des autres composés oxygénés sont similaires
pour les deux périodes.

92
5pDFWHXU'
La figure II-26 présente les abattements moyens atteints par les différentes familles chimiques de
COV.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWPR\HQGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU
'HQWUHW HWW MRXUV

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

L’ abattement global reste stable lors de l’ augmentation de la concentration des composés


oxygénés dans l’ effluent à traiter à 70 mg.m-3 puis 140 mg.m-3.
La variation de la concentration des composés oxygénés entraîne au niveau des familles
chimiques des composés :
- une diminution non significative, de 73 à 64 %, des pourcentages d’ abattements obtenus pour
les composés aromatiques. Puis, une amélioration de 64 % à 83 % est observée entre t = 97 et
t = 117 jours.
- la dégradation des composés chlorés reste stable lors du premier palier de concentration. Elle
augmente de 25 % à 44 % lorsque la concentration des composés oxygénés atteint 140 mg.m-3.
- l’ abattement des composés oxygénés est stable, ces derniers étant complètement dégradés.

93
La comparaison des deux périodes ayant une alimentation identique montre que l’ abattement
global a tendance à être supérieur en fin d’ expérience. Cette observation s’ explique par une
amélioration de l’ élimination des composés aromatiques avec une augmentation du pourcentage
d’ abattement de 54 à 83 %. La dégradation des composés oxygénés et chlorés est similaire.

II.3.5.2. Densités bactériennes


La figure II-27 présente les résultats des dénombrements réalisés après la coloration au DAPI-
CTC des échantillons prélevés entre t = 78 et t = 117 jours dans les réacteurs C et D.

)LJXUH,,'pQRPEUHPHQWVREWHQXVDXFRXUVGHODSpULRGHGHO¶H[SpULHQFHSRXUOHVUpDFWHXUV&
HW'

&HOOXOHV'$3,&HOOXOHV&7& 

Au cours de cette période, les densités sont stables. Pour le réacteur C, des moyennes de 1,9*109
cellules DAPI+.ml-1 et de 5,0*108 cellules CTC+.ml-1 ont été obtenues. Au cours des cent dix sept
jours de l’ expérience, les densités des cellules DAPI+ et CTC+ augmentent respectivement de 3,1*108
à 2,0*109 cellules DAPI+.ml-1 et de 3,0 à 5,0*108 cellules CTC+.ml-1.
Dans le cas du réacteur D, ces moyennes s’ élèvent respectivement à 3,8*108 et 4,7*107. Au cours
des cent dix sept jours de l’ expérience, les densités des cellules DAPI+ et CTC+ sont restées stables.
Les ratios CTC+ sur DAPI+ sont inférieurs à une valeur de 10 % pour le réacteur D et supérieurs
à 20 % dans le cas du réacteur C.

II.3.5.3. Structure des communautés microbiennes

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
La figure II-28 présente les électrophorégrammes de la communauté bactérienne au cours de cette
quatrième période.

94
)LJXUH,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHDXFRXUVGHODTXDWULqPHSpULRGHGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'

Les profils issus de l’ analyse des échantillons du réacteur C sont toujours identiques, les pics sont
situés essentiellement sur la gauche du profil. Le nombre de pics est de dix huit. La comparaison des
profils de cette période avec celui obtenu en fin de la première période (t = 36 jours) montre des
profils similaires.

95
Dans le cas du réacteur D, la richesse exprimée en nombre de pics est toujours aussi importante
par rapport au réacteur C. En effet, une trentaine de pics sont dénombrés par profil. L’ image de la
communauté change sur chaque profil. La comparaison des profils obtenus à t = 36 jours et t = 114
jours met en évidence deux images différentes de la structure. Cependant, sur les deux profils, le
nombre de pics est élevé, et ils sont répartis sur tout le profil. A t = 36 jours aucun pic dominant n’ est
décelable, contrairement à t = 114 jours pour lequel deux pics situés sur la droite du profil ont une
intensité supérieure aux autres.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
La figure II-29 présente les électrophorégrammes du domaine eucaryote au cours de la quatrième
période de fonctionnement des réacteurs C et D.

L’ amplification du domaine eucaryote n’ a pas pu être obtenue pour tous les échantillons, c’ est
pourquoi aucun profil n’ est présenté pour la période t = 71 -100 jours pour le réacteur C, et pour
l’ intégralité de cette période pour le réacteur D.

Le nombre de pics présents sur les profils issus de l’ analyse du réacteur C est limité. Le pic
dominant est identique sur les trois profils. Le nombre de pics varie, il est de quatre à t = 100 jours et
de six sur le profil suivant, dont deux qui présentent une forte intensité.

96
)LJXUH,,'\QDPLTXHGHODFRPPXQDXWpHXFDU\RWHGDQVOHVUpDFWHXUV&HW'DXFRXUVGHOD
TXDWULqPHSpULRGH

II.3.6. Caractérisation de la communauté bactérienne présente dans


un réacteur dégradant un mélange de onze COV
Le réacteur D présente des capacités à dégrader tous les COV. Dans ce réacteur, l’ image de la
communauté bactérienne obtenue montre une richesse importante. Cette image présente néanmoins
des variations au cours du temps.

Pour connaître plus précisément la composition de la communauté bactérienne présente dans un


réacteur capable de dégrader le mélange de onze COV, un inventaire moléculaire a été réalisé. A partir
de l’ échantillon prélevé à t = 114 jours, deux banques de clones, nommées D1 et D2, d’ ADNr 16S ont
été construites.

La figure II-30 représente l’ affiliation des clones et des phylotypes en fonction de leur division.
Le détail des données est noté en annexe 4.

97
)LJXUH,,5pSDUWLWLRQGHVFORQHVHWGHVSK\ORW\SHVG¶$'1U6LVVXGXUpDFWHXU'jW MRXUV
$UpSDUWLWLRQGHVVpTXHQFHV%UpSDUWLWLRQGHVSK\ORW\SHV
&)%&\WRSKDJD)OH[LEDFWHU%DFWHURwGHV

Cent quatre vingt deux séquences d’ ADNr 16S bactérien ont été obtenues et analysées, quatre-
vingt onze par banque réalisée. Parmi ces séquences, une a été identifiée comme étant une séquence
chimérique, et a donc été exclue de l’ analyse.

La majorité des séquences (85 %) sont réparties dans cinq divisions : trente un phylotypes (37 %
des séquences) appartiennent au groupe CFB, quinze phylotypes (16 % des séquences) sont situés
GDQVODVRXVGLYLVLRQ -3URWHREDFWHULD, quatorze phylotypes (15 %) appartiennent à la sous division -
3URWHREDFWHULD, quatre phylotypes (10 %) appartiennent aux &\RQDEDFWHULD, cinq phylotypes (7 %)
sont proches des séquences du groupe TM7. Les séquences restantes appartiennent aux huit divisions
ou sous divisions suivantes : 3ODQFWRP\FHWH (six phylotypes soit sept séquences), LGCGPB (cinq
phylotypes soit sept séquHQFHV  -SURWHREDFWHULD (deux phylotypes soit trois séquences),
9HUUXFRPLFURELXP (une séquence), HGCGPB (trois phylotypes soit quatre séquences), OP11 (une
séquence), &KORUREL (une séquence), &KORURIOH[L (un phylotype soit deux séquences).
Parmi les phylotypes, 29 % sont représentés par une séquence unique. Le taux de recouvrement
est de 71 %.

Les séquences appartiennent à treize divisions, et elles sont réparties en quatre-vingt neuf
phylotypes. Les pourcentages de similarité avec des séquences contenues dans les bases de données
publiques sont compris entre 88 % et 100 %.

98
Seuls vingt neuf phylotypes, représentant soixante huit séquences, ont une similarité supérieure
ou égale à 97 % avec une séquence contenue dans les bases de données publiques. Parmi ces derniers,
six (vingt trois séquences) sont proches de séquences provenant d’ organismes cultivables :
- un phylotype, représentant dix séquences est relié à1RYRVSKLQJRELXPKDVVLDFXP (AJ416411),
- un phylotype, représentant deux séquences, est relié à 6SKLQJRPRQDV sp. JS1 (AJ427917),
- un phylotype, représentant une séquence, est relié à 6SKLQJRS\[LV sp. C-1 (AB161684)
- un phylotype, représentant trois séquences, est relié à +\SKRPLFURELXPYXOJDUH IFAM MC-750
(Y14302)
- un phylotype, (six séquences) est relié à la souche HTCC333 (AY429712)
- le dernier phylotype est relié à*RUGRQLDEURQFKLDOLV C2 (AY262331).
Pour chaque phylotype déterminé précédemment, l’ origine des dix séquences les plus proches
dans la base de données Genbank a été déterminée. Les résultats de cette analyse figure en annexe 4.

Les séquences définies au cours de cet inventaire ne sont pas spécifiques des séquences
retrouvées dans les boues activées. Sur les quatre-vingt neuf phylotypes caractérisés, l’ origine des huit
cent quatre-vingt dix séquences a été définie. Elles proviennent pour 32 % d’ entre-elles du sol, et pour
15% des boues activées. Parmi les séquences les plus proches de nos séquences, 23 % proviennent de
systèmes de dépollution notamment de systèmes de types « boues activées ».

99
,,'LVFXVVLRQ
Dans cette étude, le fonctionnement de deux réacteurs, nommés C et D, soumis respectivement à
un effluent gazeux synthétique complexe a été évalué sur cent dix sept jours. La composition de
l’ effluent gazeux varie :
- selon la charge volumique appliquée. Les concentrations des composés dans l’ effluent gazeux
alimentant le réacteur C sont cinq fois plus importantes que dans l’ effluent alimentant le réacteur D.
- selon les fluctuations qualitatives et quantitatives du mélange de COV au niveau des composés
oxygénés. Au cours du temps, l’ effluent alimentant les réacteurs a subi trois types de modifications :
la suppression des esters,
la diminution de la concentration des composés oxygénés, d’ un facteur deux et cinq
par rapport à la concentration initiale
l’ augmentation de la concentration des composés oxygénés d’ un facteur cinq et
deux jusqu’ à atteindre la concentration initiale.

Le suivi du fonctionnement des réacteurs a été réalisé par l’ étude de la microflore des boues
activées. Celle-ci a été caractérisée selon trois paramètres :
- l’ activité de biodégradation,
- la densité bactérienne,
- la diversité de la microflore.

II.4.1. Préliminaires méthodologiques

II.4.1.1. Densités bactériennes


A partir des échantillons prélevés dans les réacteurs, les densités bactériennes ont été évaluées
grâce à une double coloration au DAPI-CTC. La coloration par le DAPI permet de déterminer le
nombre de bactéries totales (Kepner et Pratt, 1994), tandis que le marquage par le CTC permet de
dénombrer les bactéries qui ont un système de transport d’ électron actif, et par extension qui sont
métaboliquement actives (Rodriguez HW DO, 1992, Del Giorgio HW DO, 1997, Bartosch HW DO, 2003,
Junge HW DO, 2004). L’ hypothèse émise est que seule une partie de la flore totale est active et donc
responsable de la productivité bactérienne à l’ instant t. Del Giorgio et al, 1997, ont montré
effectivement que la proportion de bactéries CTC+ sur les bactéries totales (DAPI+) est reliée à la
productivité bactérienne.
Cependant, ce fait est contesté (CréachHWDO, 2003, ServaisHWDO, 2001). En effet, Servais et al.,
2001 montrent que la contribution des CTC  à l’ activité bactérienne totale d’ un écosystème est
estimée entre 43 et 73 %. De plus, Créach, HW DO., 2003, montrent que le nombre de cellules CTC+
serait plutôt relié aux nombres de bactéries viables, c’ est à dire capables de former une colonie sur
milieux de culture.

100
Les éléments complémentaires argumentant les hypothèses des précédents auteurs sont les
suivants :
- il n’ existe pas de protocole universel. En effet les cinétiques de coloration varient d’ un
échantillon à l’ autre ; une mise au point de la méthode pour chaque type d’ échantillon est par
conséquent nécessaire.
- la toxicité du CTC induit une inhibition immédiate de la synthèse protéique, qui conduit
certainement à une sous-estimation du nombre des bactéries actives.
- un affaiblissement rapide de la coloration est observé.
- un manque de précision, lors de la lecture des résultats, par microscopie est constaté. La
détermination du nombre de cellules CTC+ est plus précise par cytométrie de flux (Del Giorgio
HWDO, 1997).

Dans notre étude, la coloration a été réalisée selon le protocole mis au point par KhammarHWDO,
2004. Les dénombrements ont été réalisés par microscopie. Les résultats des dénombrements des
cellules CTC+ représentent des données qualitatives pouvant être comparées, dans la mesure où la
signification des cellules CTC- n’ est pas connue. Les résultats de densités de populations représentent
donc un indicateur global de la « santé » des boues.

II.4.1.2. Concentration des COV dans les boues


Pendant les quarante sept premiers jours de fonctionnement des réacteurs, la concentration de sept
des onze composés introduits dans l’ effluent gazeux à traiter a été mesurée dans la phase aqueuse. Les
composés dont la concentration a été déterminée sont les trois composés aromatiques, les deux
composés chlorés, et deux composés oxygénés que sont la MEC et la MIBC.

Les concentrations des COV mesurées dans les boues varient selon la famille chimique
considérée. Pour le réacteur C, la concentration des composés oxygénés est beaucoup plus élevée
(facteur 10) que celle des composés chlorés. La concentration des composés aromatiques est la plus
faible (facteur 50) par rapport à celle des composés oxygénés.

Le transfert du polluant de la phase gazeuse dans la phase aqueuse a lieu en accord avec les lois
physiques décrivant le transfert de phases. Dans le cadre de notre étude, deux hypothèses sont prises
en compte :
- le réacteur est considéré comme un système à l’ équilibre thermodynamique,
- les boues activées sont assimilées à de l’ eau.

101
Ainsi, à l’ équilibre, la part de composé entre la phase gazeuse et la phase liquide est décrite par la
loi de Henry. Les concentrations dans l’ eau sont donc, à l’ équilibre, proportionnelles à celle de l’ air
avec une constante de proportionnalité spécifique caractéristique du polluant. Par conséquent, plus la
constante de Henry est élevée, plus la proportion de composés dans la phase liquide est importante.
Le tableau II-7 rassemble les valeurs des constantes de Henry, pour les composés dosés dans la
phase aqueuse. Les composés sont classés dans l’ ordre décroissant de la valeur de la constante de
Henry.

7DEOHDX,,9DOHXUGHODFRQVWDQWHGH+HQU\SRXUFKDTXH&29PHVXUpGDQVODSKDVHDTXHXVH /D
FRQVWDQWHHVWGRQQpHjƒ&VRXVVDIRUPHDGLPHQVLRQQHOOHF¶HVWjGLUHFRPPHOHUDSSRUWGHOD
FRQFHQWUDWLRQGXFRPSRVpGDQVODSKDVHDTXHXVHVXUFHOOHGHODSKDVHJD]HXVH 

H
MEC 633
MIBC 54
DCE 22
DCM 11
Toluène 5
EB 4
p- Xylène 4

D’ après les valeurs du tableau II-7, le transfert des composés oxygénés est favorisé par rapport à
celui des composés chlorés et aromatiques. Ce même ordre est retrouvé dans notre étude.

De plus, les concentrations des composés dans la phase aqueuse du réacteur C sont en adéquation
avec les concentrations de ces mêmes composés en phase gazeuse, d’ après la loi de Henry. Dans le cas
du réacteur D, les concentrations obtenues lors de l’ analyse sont inférieures à celles données par la loi
de Henry. Les concentrations mesurées peuvent sous estimer les concentrations réelles du fait de la
possible dégradation des composés au cours de l’ analyse.

Les concentrations des COV dans la phase aqueuse sont plus élevées pour le réacteur C, qui est
alimenté par l’ effluent gazeux dont la concentration en polluants est la plus importante. Une quantité
plus élevée de COV est, par conséquent, transférée dans la suspension de boues activées selon la loi
des équilibres liquide-gaz.

Comme vu dans la partie II.3.1. (Activité de biodégradation globale des réacteurs), la part des
composés dosés dans les boues activées ne représente respectivement que 6 % et 3 % de la quantité
dégradée pour les réacteurs C et D. Ce résultat confirme que les composés transférés dans la phase
aqueuse sont dégradés par les micro-organismes.

102
II.4.2. Comparaison des réacteurs pour une même période

II.4.2.1. Période 1 : fonctionnement de la microflore en conditions stables


Entre t = 1 et t = 38 jours, les réacteurs sont alimentés par un air contenant onze COV. La
concentration de chaque composé est de 700 mg.m-3 dans l’ effluent alimentant le réacteur C et de
140 mg.m-3 dans l’ effluent alimentant le réacteur D.

¾ 5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOH
Dans ces deux réacteurs, les polluants, sont introduits simultanément dans le mélange, l’ efficacité
du procédé dépend par conséquent, des interactions qui s’ établissent entre les substrats. Cependant, en
fonction de la charge volumique appliquée, les interactions entre les composés diffèrent.

5pDFWHXU'
Lorsque la charge appliquée est faible (23 g.h-1.m-3) les trois familles de composés sont éliminées.
Au sein de ce réacteur, le pourcentage d’ abattement est lié à la nature des composés. Les pourcentages
moyens d’ abattement obtenus sont les suivants :
- 95 % pour les composés oxygénés,
- 59 % pour les composés aromatiques,
- 60 % pour les composés chlorés.
Ces résultats montrent effectivement que les polluants, introduits simultanément dans le mélange,
sont dégradés suivant l'
ordre de biodégradabilité défini par Pitter et Chudoba, 1990. Les composés
oxygénés sont éliminés préférentiellement aux composés aromatiques et chlorés. Ce même résultat a
été constaté par Aizpuru, 2001 et par Khammar, 2002 qui ont travaillé sur la biofiltration d’ un effluent
gazeux synthétique contenant le mélange des mêmes molécules. Cependant, dans les conditions
environnementales appliquées, l’ abattement des composés aromatiques et chlorés est équivalent.
De nombreux auteurs ont montré que lors de la dégradation simultanée de composés chlorés et
aromatiques, ces derniers étaient dégradés préférentiellement AizpuruHWDO, 2001, ErgasHWDO, 1995.
Le niveau d’ élimination des composés chlorés dans notre étude est probablement dû à la combinaison
de deux facteurs :
- la meilleure solubilité des composés chlorés par rapport aux composés aromatiques (Annexe1),
- le temps de séjour en fût vide de ces composés au sein des réacteurs. Il est de quatre minutes
dans le cadre de cette étude alors qu’ il était de trente six secondes au sein du biofiltre mis en
œ uvre par Aizpuru, HWDO 2001 et Khammar, HWDO., 2005. Les composés ayant des cinétiques de
dégradation lentes comme les composés chlorés sont alors favorisés.

103
5pDFWHXU&
En revanche, dans le réacteur C, seuls les composés oxygénés sont dégradés, leur pourcentage
d’ abattement est de 39 % entre t = 31 et t = 38 jours. La présence de composés facilement
métabolisables inhibe l’ élimination de composés récalcitrants à la dégradation (Deshusses HW DO,
1999).

De plus, les six composés oxygénés ne sont pas éliminés de manière équivalente. Ces composés
peuvent être classés en trois groupes selon un ordre décroissant de biodégradabilité :
les esters sont complètement dégradés,
l'
élimination du méthanol et de la MEC varient respectivement de 99 et 93% à 25 et 24%,
l’ acétone et la MIBC ne sont pratiquement pas éliminées.

Des différences dans la dégradation des composés oxygénés avaient précédemment été soulignées
par AizpuruHWDO, 2001. Dans cette étude, à une charge volumique en polluants de 220 g COV.m-3.h-1
les valeurs d’ abattement des composés oxygénés n’ étaient pas similaires pour tous les composés. Les
esters étaient complètement éliminés, les valeurs de l’ abattement du méthanol et des cétones
atteignaient respectivement la valeur de 72 % et de 54 % (50%, 54% et 59% respectivement pour
l’ acétone, la MIBC et la MEC). La différence entre leurs résultats et ceux obtenus lors de notre étude
peut être imputée à la configuration du procédé de traitement ou bien à la composition de la
communauté microbienne.
La mise en évidence de ce comportement est fort probablement due à la charge volumique
appliquée au sein de ces réacteurs. Par conséquent, dans le cadre de notre étude, parmi les composés
les plus facilement biodégradables, le classement des composés oxygénés par ordre décroissant
d’ efficacité d’ élimination est le suivant :
Esters >> méthanol, MEC > acétone, MIBC.

7 MRXU
Dans le cas du réacteur C, l’ efficacité d’ élimination des composés oxygénés est de 92% à t = 1
jour, et diminue en fonction du temps pour atteindre 39 % entre t = 30 et t = 38 jours.
Lors de l’ introduction des composés, le niveau élevé d’ élimination peut être dû à la combinaison
de deux facteurs :
- la dégradation des composés,
- les phénomènes de sorptions.
Il est probable qu’ ensuite, les phénomènes de sorptions soient moins marqués et la biodégradation
devienne le phénomène prépondérant. Il est donc important d’ attendre que le système s’ équilibre et se
stabilise pour connaître l’ élimination atteinte par le réacteur (DevinnyHWDO, 1999c).

104
¾ 5LFKHVVHFRPSDUpHGHVUpDFWHXUVHQIRQFWLRQGHODFKDUJH
YROXPLTXH
Les réacteurs C et D ont été ensemencés avec le même LQRFXOXP de départ. Cependant, lorsque ce
dernier est soumis à des effluents dont la charge volumique diffère, la dynamique de la microflore
dans ces réacteurs suit deux évolutions différentes. Ce résultat corrobore ceux obtenus par RhoHWDO,
2000, qui ont mis en évidence l’ influence directe de la concentration en polluants sur la structure des
communautés microbiennes.

5pDFWHXU'
L’ image de la diversité bactérienne, issue de l’ analyse des échantillons prélevés dans le réacteur
D, est équivalente pour tous les échantillons effectués entre t = 1 et t = 38 jours. Le nombre de pics
dénombrés est élevé, supérieur à trente, et tous ont une intensité similaire.

L’ analyse de l’ activité de biodégradation associée a montré que les onze composés introduits sont
dégradés, avec un abattement supérieur ou égal à 50 %.

Ainsi à une fonctionnalité étendue, est associée une large diversité sans apparition d’ une
population dominante. Ce résultat peut être comparé à la diversité présente dans les systèmes de
dépollution des eaux usées où la nature des composés à dégrader est large, entraînant l’ existence de
nombreuses niches écologiques et permettant ainsi à une vaste diversité de micro-organismes de
coloniser le milieu.

5pDFWHXU&
L’ image de la diversité de la flore bactérienne, présente dans réacteur C, se simplifie lors des
premiers jours de fonctionnement et se stabilise à t = 15 jours. La microflore visualisée sur les profils,
peut présenter des aptitudes à dégrader des composés oxygénés, et/ ou se développer dans les
conditions environnementales appliquées. Dans le cas de ce réacteur, le nombre de niches écologiques
serait plus restreint que dans le cas du réacteur D ; ainsi le développement d’ une plus faible proportion
de micro-organismes serait favorisé.

De plus, les micro-organismes subissent l’ effet de la toxicité de tous les composés. Byers et Sly,
1993 montrent que le DCM affecte la vie des bactéries méthanotrophes à une concentration moyenne
de 13 mg.l-1. Dans le cadre de notre étude, la concentration de ce composé dans les boues aérées a été
mesurée à 16 mg.l-1. Il convient de noter que la concentration des sept composés dosés dans les boues
a été évaluée à 701 mg.l-1. L’ impact de la toxicité du mélange de COV sur la microflore pourrait être
amplifié par le cumul des effets des différents composés présents dans la suspension de boues activées
sur les micro-organismes.

105
¾ &RORQLVDWLRQWHPSRUHOOHGHVUpDFWHXUVHQIRQFWLRQGHODFKDUJH
'HQVLWpV
Aucune différence significative entre les densités de peuplement DAPI+ des deux réacteurs n’ a
pu être mise en évidence. Cependant, les ratios des cellules CTC+ sur les cellules DAPI+ sont
différents, il est plus élevé dans le réacteur C. Le développement d’ une flore filamenteuse est observé
dans ce réacteur. Une prolifération anormale de cette dernière est à l’ origine de dysfonctionnements
dans les procédés d’ épuration de type « boues activées », sa croissance est favorisée notamment par
l’ application d’ une charge volumique trop élevée (Soddell et Seviour, 1990).

6WUXFWXUHGHVFRPPXQDXWpVPLFURELHQQHV
La dynamique bactérienne dans le réacteur C semble se décomposer en trois temps :
- entre t = 0 à t = 4 jours, la communauté montre peu de variation,
- entre t = 4 à t = 11 jours, la structure de la communauté bactérienne change de profil en profil.
Les pics dominants apparaissent sur la gauche des profils,
- entre t = 11 à t = 36 jours, l’ image de la diversité montre peu de variation. Les pics dominants se
situent sur la gauche des profils.
La dynamique bactérienne dans le réacteur D est moins visible. Les images de la communauté
montrent les aspects suivants :
- un nombre de phylotypes élevé,
- l’ égalité des rapports de dominance entre les pics.

&RQFOXVLRQ
La charge volumique appliquée a un impact sur la microflore.
Lorsqu’ une faible charge est appliquée au réacteur, un meilleur rendement est obtenu en termes
de pourcentage d’ abattement et de qualité des composés éliminés.
Si la charge appliquée semble avoir une influence sur le rendement atteint, aucun effet de la
charge sur la densité de la communauté bactérienne totale est observé.
Les résultats montrent également que l’ application d’ une charge volumique élevée à l’ écosystème
induit une simplification de la structure génétique de la diversité avec l’ apparition d’ une communauté
bactérienne dominante.
L’ hypothèse suggérée est l’ existence d’ une relation entre les bactéries dominantes dans les boues
du réacteur C et leurs capacités à dégrader les composés oxygénés à partir de t = 15 jours. Dans ce
réacteur, l’ analyse de la composition de la communauté bactérienne a montré effectivement la
présence de pics dominants se situant sur la gauche des profils SSCP. La migration des fragments
d’ ADN dépend dans le cas de la méthode SSCP de la taille du fragment et de sa conformation spatiale.
Ainsi, le positionnement des pics et par conséquent des séquences correspondantes est probablement
corrélé à leur appartenance à des groupes phylogénétiquement proches.

106
Khammar HW DO, 2005 ont noté la prédominance des pics se situant sur la gauche du profil
parallèlement à la dégradation des composés oxygénés. En effet, lors de l’ étude sur deux biofiltres
soumis au même mélange de COV, les auteurs ont montré une stratification dans l’ espace de la
dégradation des composés et de la communauté microbienne. En tête de colonne, les composés
oxygénés étaient totalement dégradés. L’ analyse, par PCR-SSCP, d’ échantillons de tourbe prélevés en
tête de colonne, montre que les pics dominants se situent sur la gauche des profils.
L’ assignation des pics pourrait permettre de corroborer cette hypothèse.

En termes écologiques, une microflore plus diversifiée et plus équilibrée en termes


d’ abondances relatives semble être associée à un meilleur fonctionnement.

II.4.2.2. Influence des fluctuations de composition de l’ effluent


sur le fonctionnement de la microflore : diminution de la charge
volumique appliquée
Entre t = 39 et t = 82 jours, la charge volumique alimentant les deux réacteurs est diminuée. Entre
t = 39 et t = 47 jours, les esters sont supprimés du mélange. Entre t = 48 et t = 82 jours, les réacteurs
sont alimentés par un air contenant le mélange de onze COV, mais la concentration des composés
oxygénés est progressivement diminuée. Entre t = 48 et t = 66 jours, la concentration est diminuée de
moitié, soit une concentration de 350 mg.m-3 pour le réacteur C et de 70 mg.m-3 pour le réacteur D.
Entre t = 67 et t = 82 jours, la concentration est diminuée au 1/5 par rapport à la concentration initiale,
soit 140 mg.m-3 pour le réacteur C et 28 mg.m-3 pour le réacteur D.

¾ 5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOHHQIRQFWLRQGHODFKDUJHYROXPLTXH
L’ influence des fluctuations de l’ effluent à traiter sur le fonctionnement de la microflore est
différente selon la charge polluante appliquée.

5pDFWHXU&
Si les performances globales du réacteur sont stables entre t = 31 et t = 66 jours à 25 % en
moyenne, elles augmentent à partir de t = 67 jours pour atteindre la valeur de 43 %.
Seuls les composés oxygénés sont dégradés. Leur abattement augmente de 39 % à 69 %. Cette
augmentation est due à l’ amélioration de la dégradation du méthanol et des cétones et plus
particulièrement de la MEC. L’ élimination de la MEC augmente effectivement de 24 à 71 % entre
t = 39 et t = 47 jours puis atteint 100 % à partir de t = 69 jours. L’ élimination du méthanol atteint,
entre t=39 et t=43 jour, la valeur de 30 %, puis ce composé n’ est pas dégradé entre t = 48 et t = 66
jours. Les valeurs d’ abattement augmentent dans un second temps, entre t = 67 et t = 82 jours, pour
atteindre la valeur de 38 %. Les valeurs d’ abattement de l’ acétone et de la MIBC augmentent et se

107
stabilisent à 38 % dès t = 69 jours. Les esters sont complètement dégradés dès leur réintroduction dans
le mélange.

L’ ordre de dégradation observé au cours de cette période est le suivant :


Esters>> MEC > acétone, MIBC, méthanol.
Ce classement est similaire à celui observé entre t=1 et t=38 jours, excepté pour le méthanol. Cet
ordre pourrait être expliqué par les voies de dégradation que suivent ces composés :
- l’ élimination complète des esters peut provenir d’ une part d’ une activité microbienne, d’ autre
part de l’ instabilité de la molécule. En effet, celle-ci s'
hydrolyse en acide (acide acétique) et en
alcool (butanol, éthanol). Ces produits sont ensuite facilement dégradés par la flore
microbienne.
- la voie de dégradation de la MEC entraîne la production de l’ AE, pouvant ainsi expliquer
l’ augmentation privilégiée de l’ efficacité d’ élimination de ce composé lors de la modification de
l’ effluent par rapport à l’ acétone, la MIBC et au méthanol.

5pDFWHXU'
La diminution de la charge volumique de 23 g.m-3.h-1 à 13 g.m-3.h-1 n’ entraîne pas de
modification de l’ abattement global qui est de 80 %.
Cette absence de variation au niveau de l’ abattement global masque des différences d’ évolution
en terme d’ élimination des familles de composés. Si l’ abattement des composés oxygénés demeure
stable (100 %), l’ abattement des composés aromatiques augmente de 54 % (t = 30-38 jours) à 73 %
(t = 68-82 jours).
L’ abattement des composés chlorés a tendance à augmenter de 47 % (t = 30-38 jours) à 60 % à
partir de t = 44 jours. Entre t = 67 et t = 82 jours, les valeurs de l’ abattement des composés chlorés
diminuent pour atteindre 30 %. Ainsi, il a été observé que la seconde diminution de la concentration
des oxygénés dans l’ effluent, entraîne une diminution de l’ élimination des composés chlorés.

Il convient de noter que Khammar HW DO, 2005 ont montré que la suppression des composés
oxygénés dans un mélange onze COV avait induit la diminution de 90 % à 40 % de l’ élimination du
toluène et de l’ EB ainsi que l’ arrêt de la consommation du p-xylène. Aucun élément d’ information
n’ est apporté par cette étude concernant l’ élimination des composés chlorés car ils n’ étaient pas
dégradés dans le réacteur.

Dans le cadre de notre étude, des interactions entre les composés aromatiques et oxygénés
similaires à celles mentionnées par Khammar et al (2005) n’ ont pas été observées. La diminution de la
concentration des composés oxygénés dans l’ effluent induirait une augmentation de l’ efficacité
d’ élimination des composés aromatiques. En revanche, la diminution de la concentration des

108
composés oxygénés, à partir de t = 67 jours, serait à l’ origine d’ une diminution des performances de
dégradation des composés chlorés. Cette observation amènerait à suggérer, comme les précédents
auteurs, des interactions entre substrats de même type au sein du réacteur D. Quelques hypothèses
peuvent expliquer cette diminution de l’ efficacité d’ élimination des composés chlorés :
- pour certains composés chlorés, la dégradation est généralement plus élevée en milieu
anoxique. Il est probable que la dégradation microbienne des composés oxygénés diminue
localement le potentiel d'
oxydo-réduction du milieu par la consommation de l'
oxygène
favorisant ainsi la dégradation des chlorés.
- la dégradation peut s’ effectuer par co-métabolisme avec les composés oxygénés du mélange, ou
avec les sous produits issus de leur dégradation. La diminution de la quantité des composés
oxygénés introduits dans le réacteur entraîne une diminution de la consommation des composés
chlorés.
- la dégradation des composés oxygénés favorise le maintien d’ espèces indispensables à la
dégradation des composés chlorés.

L’ étude de la diversité bactérienne présente dans les boues activées avant et après cette deuxième
diminution de la concentration des composés oxygénés pourrait fournir les premiers éléments de
réponse. En effet, dans l’ étude de Khammar HW DO, 2005, l’ effondrement de la dégradation des
composés aromatiques était accompagné d’ une modification de l’ image de la diversité bactérienne. La
richesse de l’ écosystème était restée équivalente mais la structure de la diversité avait été altérée.

¾ &RORQLVDWLRQWHPSRUHOOHGHVUpDFWHXUVHQIRQFWLRQGHODFKDUJH
YROXPLTXH
5pDFWHXU&
Au cours de cette période, la densité bactérienne est de 1,9*109 cellules.mL-1. Le ratio des cellules
CTC+ sur les bactéries totales diminue pour atteindre une valeur de 19 %.
Aucune modification de l’ image de la communauté bactérienne n’ est constatée sur les
échantillons prélevés au cours de cette période. L’ image du domaine eucaryote, montre que le nombre
de pic diminue mais le pic dominant reste inchangé.
Après le stress induit lors de l’ introduction des onze COV, l’ écosystème semble tendre vers un
équilibre au niveau de la composition qualitative et quantitative de la flore microbienne.

5pDFWHXU'
Les valeurs des densités des bactéries totales sont stables à 5,5*108 cellules.mL-1. Le ratio des
cellules CTC+ sur les DAPI+ diminue pour atteindre une valeur inférieure à 10 %.

109
La structure de la communauté bactérienne est modifiée. La première modification de l’ effluent
entraîne l’ apparition transitoire de deux pics dominants sur la droite du profil. En parallèle,
l’ élimination des composés chlorés est la plus élevée et atteint 84 %. Au cours des modifications
suivantes, le nombre de pics augmente et sont repartis sur tout le profil. A partir de t = 68 jours le
nombre de pics diminue, affectant particulièrement les pics situés sur la gauche du profil.

L’ analyse des profils SSCP, obtenus avant et après la deuxième diminution de la concentration
des composés oxygénés, montre que la diminution de la dégradation des composés chlorés
s’ accompagne d’ une variation de la flore dominante, mais aussi d’ un changement dans les rapports de
dominance des pics. Ainsi, sur ce profil, les bactéries intervenant dans la dégradation des composés
oxygénés peuvent être affectées au même titre que celles intervenant dans la dégradation des
composés chlorés.

&RQFOXVLRQ
Lorsque la charge est élevée, les fluctuations appliquées ont une influence limitée sur le
fonctionnement de la microflore. En effet, des modifications sont visibles uniquement sur les
performances de dégradation des composés facilement métabolisables. Les densités bactériennes, ainsi
que la diversité évoluent peu.
Lorsque la concentration de chaque polluant est de 140 mg.m-3, les fluctuations appliquées ont
une influence sur le fonctionnement de la microflore. Des variations de l’ élimination des composés
récalcitrants (aromatiques et chlorés) sont constatées. Parallèlement, l’ image de la communauté
bactérienne fluctue.

II.4.2.3. Influence des fluctuations de composition de l’ effluent


sur le fonctionnement de la microflore : augmentation de la charge
volumique appliquée
Cette phase s’ étend entre t = 83 et t = 117 jours. Les modifications apportées à l’ effluent à traiter
consistent en une augmentation progressive de la concentration des composés oxygénés jusqu’ à la
concentration initiale :
- entre t = 83 et t = 96 jours, la concentration des composés oxygénés atteint 350 mg.m-3 pour le
réacteur C, et 70 mg.m-3 pour le réacteur D.
- entre t = 97 et t = 117 jours, la concentration atteint la valeur initiale, soit 700 mg.m-3 pour le
réacteur C et 140 mg.m-3 pour le réacteur D.

110
¾ 5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOHHQIRQFWLRQGHODFKDUJHYROXPLTXH
5pDFWHXU&
Au cours de cette période, seuls les composés oxygénés sont éliminés, mais leur abattement
diminue de 67 % à 51 %. Les esters sont complètement éliminés. L’ abattement des cétones et du
méthanol évolue de la façon suivante :
- le pourcentage d’ abattement de la MEC diminue de 100 à 30 %,
- les pourcentages d’ abattement de la MIBC et de l’ acétone diminuent de 36 à 16 %.
- l’ élimination du méthanol augmente de 35 à 49 %.

L’ ordre de dégradation observé au cours de cette période est le suivant :


Esters >> méthanol > MEC > acétone, MIBC.
Cet ordre correspond à l’ ordre établi par Aizpuru, 2001, lors du traitement du mélange de onze
COV par biofiltration à une charge volumique de 220 mg.m-3.h-1.

5pDFWHXU'
L’ augmentation de la concentration des composés oxygénés, ne modifie pas la résultante
fonctionnelle concernant les composés oxygénés, ces derniers étant totalement dégradés. L’ élimination
des composés aromatiques à tendance à diminuer, de 73 % à 64 %, lorsque la concentration des
composés oxygénés est de 70 mg.m-3, puis elle augmente à 80 % lorsque la concentration des
composés oxygénés est de 140 mg.m-3. La dégradation des composés chlorés reste stable dans un
premier temps à 30 % puis s’ améliore et atteint 44 % à la fin de l’ expérience.
L’ augmentation de la concentration des composés oxygénés entraîne une amélioration de la
dégradation des composés chlorés confirmant l’ existence d’ une relation entre ces composés. Au cours
de la période précédente, l’ efficacité d’ élimination des composés chlorés a diminué lorsque la
concentration des composés oxygénés était de 28 mg.m-3. Au cours de la quatrième période,
l’ efficacité ne s’ améliore pas lorsque la concentration des composés oxygénés augmente de 28 à
70 mg.m-3. L’ amélioration de la dégradation des composés chlorés est effective lorsque la
concentration des composés oxygénés atteints 140 mg.m-3. Ainsi, la reprise d’ efficacité de traitement
est plus lente, elle est probablement due à une nouvelle adaptation des capacités de biodégradation des
micro-organismes à cette variation quantitative de l’ effluent gazeux.

A t = 117 jours, les abattements par famille de composés sont respectivement de 100 %, 83 % et
47 % pour les composés oxygénés, aromatiques et chlorés. L’ ordre de dégradation obtenu par
différents auteurs est également observé au sein de ce réacteur (Aizpuru HW DO, 2001, Pitter et
Chudoba, 1990).

111
¾ &RORQLVDWLRQWHPSRUHOOHGHVUpDFWHXUVHQIRQFWLRQGHODFKDUJH
YROXPLTXH
5pDFWHXU&
Aucune modification des densités bactériennes et de la diversité n’ est constatée au cours de cette
période. Les images de la communauté bactérienne obtenues à partir des échantillons prélevés à t = 36
et t = 114 jours sont similaires.
L’ écosystème semble tendre vers un équilibre au niveau de la composition qualitative et
quantitative de la flore microbienne. Les changements survenant au niveau de la dégradation des
composés oxygénés semblent induire peu de variations.

5pDFWHXU'
Les densités bactériennes sont stables. La struture de la communauté bactérienne est modifiée.
Des pics dominants apparaissent sur la droite du profil à t = 114 jours. Pour émettre l’ hypothèse de
l’ existence d’ un lien entre leur présence et la dégradation des composés chlorés, des études
complémentaires sont nécessaires, telle l’ assignation des pics. Cette étape semble difficilement
réalisable compte tenu du grand nombre de pics présent sur le profil. Pour simplifier le profil SSCP,
les composés aromatiques pourraient être retirés du mélange. Les organismes dégradant les composés
chlorés et oxygénés seraient alors favorisés.

¾ &DSDFLWpGHUHWRXUjO¶pWDWLQLWLDO
5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOHHQIRQFWLRQGHODFKDUJHYROXPLTXH
Les concentrations des onze composés en fin d’ expérience sont équivalentes à celle de la phase
initiale.
Pour le réacteur C, la dégradation des composés oxygénés a tendance à s’ améliorer, l’ abattement
global est évalué à 52 % pour 39 % entre t = 31 et t = 38 jours. Parmi ces composés, l’ abattement du
méthanol a augmenté de 25 % (t = 31 et t = 38 jours) à 51 %. La MIBC et l’ acétone qui n’ étaient pas
dégradées, ont une valeur d’ abattement de 16 %. Parallèlement, l’ abattement de la MEC a tendance à
être plus élevé (35 % au lieu de 24 %).
L’ ordre de dégradation observé au cours de ces périodes est quasiment similaire :
Esters >> méthanol > MEC > acétone, MIBC.
La différence provient de l’ efficacité d’ élimination atteinte pour le méthanol et de la MEC.

Pour le réacteur D, les valeurs d’ abattement pour les composés chlorés et oxygénés sont
similaires. En revanche, l’ élimination des composés aromatiques est améliorée ; les valeurs
d’ abattement augmentent de 54 % à 83 %.

112
'HQVLWpGHVSRSXODWLRQV
Pour le réacteur C, la densité des cellules DAPI+, est de 1,4*109 cellules.mL-1 pour t = 36 et
2,0*109 cellules.mL-1 à t = 117 jours. Le ratio des cellules CTC+ sur les cellules DAPI+ est de 20 %.
Pour le réacteur D, la densité des cellules DAPI+, est de 7,7*108 cellules.mL-1 pour t = 36 et
5,4*108 cellules.mL-1 à t = 117 jours. Le rapport entre le nombre de cellules CTC+ et le nombre de
DAPI+ est de 10 %.

6WUXFWXUHGHODFRPPXQDXWpEDFWpULHQQH
L’ image de la communauté bactérienne issue du réacteur C à t = 36 et t = 114 jours est la même.
Pour le réacteur D, les images obtenues montrent des similarités : ils possèdent un grand nombre de
pics repartis sur tout le profil. Cependant sur le profil obtenu à t = 114 jours pour le réacteur D, deux
pics dominants sont recensés.
Pour comparer la diversité de la flore bactérienne entre les deux réacteurs, une ACP est réalisée à
partir des profils SSCP obtenus à t = 0, 9, 15, 36, 43, 75, 92, 114 jours. Les paramètres pris en
considération lors de la réalisation de cette analyse sont la présence des pics, et l’ intensité relative des
pics (Figure II-31).

)LJXUH,,5pVXOWDWGHO¶$&3VXUOHVSURILOV66&3&HW'1RPGXUpDFWHXUOHFKLIIUHMRXUGX
SUpOqYHPHQW

Les résultats de cette analyse montrent que la flore dominante des deux réacteurs est différente
dès t = 9 jours. En effet, deux groupes sont distingués avec d’ une part les profils du réacteur D et du
réacteur C prélevés jusqu’ à t = 9 jours, et d’ autre part les échantillons du réacteur C prélevés à partir
de t = 15 jours. De plus, la variabilité de la diversité est plus grande dans les échantillons issus du
réacteur D que dans ceux issus du réacteur C à partir de t = 15 jours.

113
&RQFOXVLRQ
L’ impact des fluctuations de la composition de l’ effluent gazeux sur le fonctionnement de la
microflore est limité, quelle que soit la charge appliquée.
Les fluctuations appliquées aux deux réacteurs C et D ont mis en évidence la résistance de
l’ écosystème et l’ adaptation des communautés microbiennes à ces fluctuations de la composition de
l’ effluent gazeux.
De plus, à l’ issue des fluctuations appliquées aux deux bioréacteurs, la résilience de l’ écosystème
tant fonctionnelle qu’ au niveau de la structure de la communauté bactérienne est observée.

II.4.3. Cas particulier de la flore eucaryote


Au cours de ce travail, la dynamique du domaine eucaryote a été étudiée. La structure de la
communauté obtenue peut difficilement être comparée, car le nombre de travaux concernant l’ étude de
la diversité du domaine eucaryote par des méthodes moléculaires est limité. Les études réalisées
concernent plus particulièrement la flore eucaryote présente dans les systèmes aquatiques ou les
milieux extrêmes tels que les sols de l’ Antarctique (LawleyHWDO, 2004). Néanmoins, une étude a été
réalisée sur ce domaine dans les boues activées (MarshHWDO, 1998).

Dans le système des boues activées, Canler HW DO., 1999 ont estimé que les métazoaires
(rotifères-nématodes) représentaient de 1 à 5 *105 micro-organismes par litre de boues, et les
protozoaires (flagellés, sarcodines, ciliés) environ 107 micro-organismes par litre de boues. Ces
données dépendent des propriétés physico-chimiques du milieu, de l’ âge des boues.

Les profils SSCP obtenus au cours de notre étude montrent une image très versatile de la
diversité. Même si un pic majoritaire reste dominant sur une période d’ une vingtaine de jour, chaque
profil montre des modifications au niveau des rapports de dominance des pics. Aucun lien entre les
fluctuations de la composition de l’ effluent et la diversité ne peut être énoncé. Ce résultat est en accord
avec les analyses réalisées par les méthodes conventionnelles, qui ont montré que la grande majorité
de la microfaune était bactériophage, même si certaines populations peuvent participer à l’ assimilation
directe de la matière organique (CanlerHWDO, 1999).

Cependant, l’ analyse est limitée puisque le nombre de pics visibles sur les profils, obtenus lors
de cette étude, est faible (6). Il suppose une richesse en nombre d’ espèces peu importante par rapport
au domaine bactérien. MarshHWDO, 1998 ont mis en évidence que la diversité révélée par la méthode
DGGE est de cinq à six ribotypes. De plus, au cours du temps, l’ image de la diversité montre de
nombreuses variations, ce qui est en accord avec nos résultats et avec ceux obtenus par les méthodes
conventionnelles. Le tableau II-8 indique le nombre d’ individus recensé dans les boues activées par les
observations microscopiques d’ après CanlerHWDO, 1999.

114
7DEOHDX,,5HFHQVHPHQWGHVLQGLYLGXVGXGRPDLQHHXFDU\RWHGDQVOHVERXHVDFWLYpHV &DQOHUHW
DO 

Milieu naturel Ensemble des boues activées Une station donnée


Métazoaires Des milliers Une vingtaine Quelques individus de
1 ou 2 espèces
Protozoaires 40 000 Une centaine 12 espèces dont 3 ou 4
dominantes

II.4.4. Flore dégradant un mélange de onze COV


La diversité bactérienne présente dans un système aérobie traitant des COV est peu étudié par des
méthodes moléculaires. A ma connaissance, aucun inventaire moléculaire basé sur l’ ADNr 16S n’ a été
réalisé sur ce type de procédé et cette diversité de polluants, à savoir des composés aromatiques,
chlorés et oxygénés. FriedrichHWDO, 2002 ont réalisé un inventaire sur un biofiltre traitant un effluent
gazeux contenant des molécules tels que l’ ammoniac, des aldéhydes (2- et 3- méthylbutanal), et des
sulfures comme le diméthyldisulfure. Compte tenu de la nature différente des composés traités dans
cette étude, l’ affiliation des clones ne sera pas présentée.

Le calcul du pourcentage de recouvrement, montre que seulement 70 % de la diversité a été


approché lors de cet inventaire. Cette valeur est comparable a celle obtenue par BramucciHWDO, 2003,
lors d’ inventaires moléculaires réalisés à partir d’ un échantillon de boues activées sur lequel cent
quatre-vingt neuf et deux cent dix huit clones ont été séquencés permettant ainsi de recouvrir
respectivement 83 % et 79 % de la diversité.

Les résultats de cette étude montrent la prédominance d’ individus appartenant à la division CFB
(37 %), à la sous division –3URWHREDFWHULD (16 %), ainsi qu’ à la sous division –3URWHREDFWHULD
(15 %). Ces trois groupes comptent parmi les groupes les plus souvent retrouvés lors des inventaires
réalisés sur les boues activées (paragraphe I.5.1).

Les phylotypes présents dans les boues à t = 114 jours ne sont pas spécifiques du milieu, ou des
polluants. La réalisation d’ inventaires moléculaires sur d’ autres types de procédés de dépollution
d’ effluents gazeux chargés en COV est nécessaire, afin de mieux appréhender la communauté
bactérienne présente.

115
II.4.5. Application industrielle
II.4.5.1. Efficacité d’ élimination
Dans ce chapitre, deux réacteurs ont fonctionné en parallèle pendant cent dix sept jours. La
différence existant entre ces deux procédés réside dans l’ alimentation, le réacteur C ayant une charge
volumique cinq fois supérieure à celle du réacteur D.
Pour décrire les performances d’ un réacteur, deux paramètres peuvent être utilisés : le premier est
l’ abattement, le second est la capacité d’ élimination (CE). Ce dernier est défini comme étant la masse
de polluant dégradée par unité de volume du milieu et par unité de temps. Habituellement, cette valeur
s’ exprime en grammes de polluant par m3 de réacteur et par heure. La CE est définie comme :
(Ci – Cs)*Q
CE =
Vr
Avec,
CE : Capacité d’ élimination (g.m-3.h-1)
Q : Débit du gaz dans le réacteur (m3.h-1)
Vr : Volume du réacteur (m3 de boues)
La figure II-32 présente l’ évolution de la CE en fonction de la charge volumique appliquée pour
les deux réacteurs.

)LJXUH,,(YROXWLRQGHOD&(GHVSROOXDQWVHQIRQFWLRQGHODFRQFHQWUDWLRQGHFHVGHUQLHUVGDQV
O¶HIIOXHQWG¶DOLPHQWDWLRQ
&(PD[LPDOHWKpRULTXH &(REWHQXHGDQVOHVUpDFWHXUV&HW' 

La figure II-32 montre nettement qu’ il existe une charge volumique limite, à environ 26 g.m-3.h-1,
au-dessus de laquelle la capacité d’ élimination maximale est atteinte. Pour vérifier l’ existence de cette
valeur limite, les concentrations des composés dans l’ effluent alimentant le réacteur C auraient du être
appliquées au réacteur D.

116
II.4.5.2. Atteinte des performances maximales
Dans le cas du réacteur D, l’ obtention de l’ élimination maximale est très rapide. L’ état
stationnaire est atteint dès la mise en fonctionnement du système. L’ abattement global est de 70 % dès
t = 1, et reste stable jusqu’ à t = 38 jours.

Pour d’ autres types de configuration de procédés de dépollution, telles que la biofiltration, une
période de latence de quelques semaines est nécessaire avant l’ obtention de l’ activité de
biodégradation maximale (Aizpuru, et al., 2001, Khammar HW DO, 2005). Ce temps de latence a été
expliqué comme étant le temps nécessaire 1) à la sélection de la flore bactérienne capable de dégrader
les polluants et à 2) la colonisation du matériau support par cette flore.
Pour les réacteurs ne nécessitant pas d’ étape de colonisation du support, comme les biolaveurs, la
phase d’ adaptation peut être réduite.

II.4.5.3. Conséquences sur l’ étape d’ acclimatation


Avant la mise en route des réacteurs, une phase de pré-acclimatation peut être généralement
préconisée. L’ objectif de cette phase est la sélection d’ une flore capable de dégrader les composés
notamment les plus récalcitrants.
Dans le cas du réacteur C, la charge volumique appliquée correspond à celle utilisée au sein du
laboratoire lors de cette phase de pré-acclimatation. Les travaux menés dans cette étude montrent que
cette charge volumique est trop élevée, et par conséquent, seuls les composés les plus facilement
biodégradables sont éliminés. Une flore dominante est sélectionnée au démarrage du procédé puis elle
reste stable jusqu’ à la fin de l’ expérience. La flore sélectionnée est probablement impliquée, de
manière directe ou indirecte, dans la dégradation des composés oxygénés. Ainsi, l’ emploi d’ une forte
charge permet de sélectionner une flore dominante qui montre des aptitudes uniquement dans la
dégradation des composés les plus facilement biodégradables.

L’ étape limitante dans la prise d’ efficacité des biofiltres ne serait-elle pas la colonisation du
support par la microflore plutôt que la sélection de micro-organismes spécifiques ? Par conséquent, si
cette hypothèse est vérifiée, l’ étape d’ acclimatation des boues préalable à l’ inoculation présente peu
d’ intérêt. Pour vérifier cette hypothèse, le suivi du fonctionnement d’ un biofiltre avec une flore
acclimatée ou non dans les mêmes conditions que le réacteur D pourrait être réalisé.

117
,,&RQFOXVLRQ
Ce travail a permis d’ étudier plus particulièrement l’ influence de la charge volumique sur le
fonctionnement de la microflore sur deux réacteurs contenant des boues activées. De plus, l’ impact des
fluctuations de la composition de l’ effluent au cours du temps sur la diversité et la fonctionnalité de la
microflore a été approché.

Cette étude a ainsi mis en évidence que selon la charge imposée :


- le pourcentage d’ abattement varie ainsi que la flore associée. Lorsque tous les composés sont dégradés
la diversité de la flore bactérienne est importante (réacteur D), alors que dans le cas ou seuls les
composés oxygénés sont dégradés (réacteur C), deux à quatre pics prédominants apparaissent.
- les fluctuations de composition de l’ effluent à traiter ont un impact plus marqué dans le cas du réacteur
alimenté par la charge la plus faible.

De plus, l’ importance du rapport de concentrations entre les familles de polluants a été soulignée.
La diminution de la concentration des composés oxygénés provoque une modification de la diversité
bactérienne accompagnée d’ une forte diminution de l’ élimination des composés chlorés (réacteur D).
La microflore, présente dans un réacteur dans lequel l’ abattement du mélange complexe de COV
atteint des valeurs comprises entre 50 et 100%, est composée majoritairement de bactéries appartenant
à la division des CFB (37   HW DX[ VRXV GLYLVLRQV - HW -3URWHREDFWHULD (respectivement 16 % et
15 %).

Du point de vue applicatif, compte tenu du temps nécessaire à l’ atteinte de l’ état stationnaire et à
la mise en place de la microflore, la nécessité de l’ étape de pré-acclimatation est remise en question
dans le cas de procédés ne mettant pas en œ uvre une étape de colonisation.

Dans le cas de l’ application d’ une charge volumique identique à celle imposée au réacteur C, une
dégradation des composés aromatiques et chlorés aurait pu être constatée si les composés oxygénés
avaient été ôtés du mélange. Ainsi, une flore dominante différente aurait été sélectionnée et aurait
montré des capacités à dégrader les composés récalcitrants à la dégradation. Mais quelles auraient été
les performances du réacteur et l’ image de la diversité lorsque cette flore ainsi sélectionnée est mise en
contact avec un effluent contenant des composés plus facilement métabolisables ? Des éléments de
réponse à cette question sont apportés dans le chapitre suivant.

118
&KDSLWUH,,,,PSDFWGHSHUWXUEDWLRQVVXUOH
IRQFWLRQQHPHQWGHODPLFURIORUH)OH[LELOLWpGHVUpDFWHXUV
HQUHODWLRQDYHFODVWUXFWXUHGHODPLFURIORUH

119
,,,,QWURGXFWLRQ
Au cours du chapitre précédent, l’ influence des fluctuations de la composition de l’ effluent sur le
fonctionnement de la microflore a été étudiée. De plus, l’ impact de ces fluctuations en fonction de la
charge volumique appliquée a également été pris en compte. Il a été montré que :
- un ordre de biodégradation est respecté : l’ efficacité d’ élimination des composés est d’ autant
plus élevée que ces derniers sont facilement métabolisables.
- en fonction de la charge imposée, l’ efficacité d’ élimination varie ainsi que la dynamique
bactérienne.
- les fluctuations de la composition de l’ effluent entraînent des modifications de l’ activité de
biodégradation et de la dynamique bactérienne, lorsque la charge volumique appliquée est faible
(23,1 g.h-1.m-3).

Dans le but d’ optimiser la gestion de ces réacteurs, le fonctionnement de la microflore a été étudié
en se focalisant sur l’ impact de perturbations :

A. au cours du fonctionnement des réacteurs, l’ impact de la charge volumique appliquée


revêt une importance toute particulière. L’ effet de perturbations sur la microflore a aussi
une incidence. Les perturbations observées au cours du fonctionnement des procédés
biologiques de traitement d’ émissions gazeuses chargées en COV peuvent être
caractérisées par des pics de concentration ou par la modification de la composition de
l’ effluent gazeux (addition ou suppression de composés de nature chimique différente).
Afin d’ optimiser la gestion de la microflore lors de ces perturbations, des éléments de
réponse seront apportés à la question suivante : Quel est l’ impact des perturbations sur le
fonctionnement de la microflore ? Le travail porte sur la dynamique de la microflore
d’ un réacteur alimenté par un effluent gazeux dont la composition est enrichie par des
composés de plus en plus facilement biodégradables.

B. les perturbations subies par un réacteur sont transitoires. Néanmoins, suite à une
modification de l’ effluent à traiter, la variation de la structure de la microflore peut
affecter le fonctionnement de celle-ci et par conséquent les performances du système. Il
convient donc d’ appréhender les mécanismes survenant après des périodes de stress. Quel
est le comportement d’ un réacteur après qu’ il ait subi des perturbations antérieures ? En
d’ autres termes, le passé de la microflore a-t-il un rôle dans son fonctionnement ?

120
Pour répondre à ces questions, deux paires de réacteurs ont été mises en œ uvre :

A : un réacteur a été alimenté par un effluent gazeux contenant seulement les composés les plus
difficilement dégradables, à savoir les composés chlorés. Le second a été alimenté par un effluent
gazeux dont la composition a été modifiée au cours du temps. Cette dernière a été enrichie
progressivement en composés de plus en plus facilement biodégradables (composés halogénés, puis
composés aromatiques, puis composés oxygénés). Dans le but de mieux cerner l’ impact de
perturbations sur l’ écosystème, la concentration utilisée pour chaque composé est de 700 mg.m-3. Les
résultats obtenus permettront également de mieux connaître les mécanismes biologiques survenant au
cours de la mise en place de la communauté microbienne impliquée dans la dégradation des polluants
(phase de pré-acclimatation).

B : deux réacteurs ont été inoculés par le même FRQVRUWLXP microbien et chacun a été alimenté
pendant soixante six jours par un effluent gazeux dont la composition diffère. Ensuite, les réacteurs
ont été soumis, pendant cinquante jours, à un effluent gazeux identique.

121
$(WXGHGHO¶LPSDFWGHSHUWXUEDWLRQVSDULQWURGXFWLRQ
VpTXHQWLHOOHGHVFRPSRVpVVXUOHIRQFWLRQQHPHQWGHOD
PLFURIORUH
,,,0DWpULHOVHWPpWKRGHV

III.2.1. Dispositif expérimental


Pour réaliser cette étude, deux réacteurs ont été mis en oeuvre. Le montage expérimental est
similaire à celui du chapitre II (figure II-1). Les réacteurs sont identifiés dans cette étude par les lettres
S (Séquentiel) et H (Chlorés), faisant ainsi référence au mode d’ introduction des polluants dans
l’ effluent gazeux à traiter.
Le schéma du montage est présenté sur la figure III-1.

)LJXUH,,,/HVUpDFWHXUVXWLOLVpVGDQVFHWWHpWXGH$SUpOqYHPHQWGHVHIIOXHQWVJD]HX[%
SUpOqYHPHQWGHVpFKDQWLOORQVGHERXHVDFWLYpHV

122
La figure III-1 montre que la volatilisation des COV a été réalisée en deux étapes. Les COV à
l’ état liquide, contenus dans une seringue, sont introduits dans un flux d’ air de 10 L.min-1 grâce à deux
pousses-seringues :
- le premier est placé en amont de la séparation des réseaux d’ alimentation propre à chaque
réacteur. Ce dispositif permet de générer un effluent gazeux ne contenant que les composés
chlorés.
- le second est situé sur le réseau d’ alimentation du réacteur S. Ce dispositif permet d’ enrichir
l’ effluent gazeux préalablement généré en composés aromatiques et oxygénés.

Le réacteur S peut ainsi être alimenté par un effluent dont la composition diffère de celle de
l’ effluent alimentant le réacteur H.

III.2.2. Composition de l’ effluent


Les polluants sont les mêmes que ceux utilisés lors de l’ étude présentée dans le chapitre
précédent :
- composés oxygénés : méthanol, acétone, MEC, AE, AB, MIBC,
- composés chlorés : DCE, DCM,
- composés aromatiques : toluène, EB, p-xylène.

La composition de l’ effluent alimentant le réacteur H ne varie pas au cours des cent dix sept jours
de l’ expérience. La pollution est générée par l’ introduction des deux composés chlorés, le DCM et le
DCE, dans le flux d’ air (Figure III-2). La concentration de chaque composé est de 700 mg.m-3.

En revanche, des modifications ont été apportées à la composition de l’ effluent alimentant le


réacteur S. Les molécules ont été introduites de manière séquentielle dans le mélange en fonction de la
nature chimique des molécules et selon un ordre croissant de biodégradabilité. Ainsi, trois périodes ont
été définies (figure III-2) :
- SpULRGH: entre t = 1 et t = 38 jours, l’ effluent est composé uniquement par les composés chlorés, la
concentration de chaque composé est de 700 mg.m-3.
- SpULRGH  : entre t = 39 et t = 66 jours, les composés aromatiques sont ajoutés au mélange des
composés chlorés, la concentration de chaque composé est de 700 mg.m-3.
- SpULRGH : entre t = 67 et t = 117 jours, les composés oxygénés ont été introduits progressivement
dans le mélange. La concentration de chaque composé, qui augmente par palier, est successivement
de 140, 350 et 700 mg.m-3.

123
)LJXUH,,,(YROXWLRQGHVFRQFHQWUDWLRQVGHFKDTXH&29GDQVOHVHIIOXHQWVDOLPHQWDQWOHVUpDFWHXUV
6HW+
6UpDFWHXU6HW+UpDFWHXU+ 

III.2.3. Caractérisation de la microflore

III.2.3.1. Paramètres du suivi


Le suivi de ces réacteurs a été réalisé dans les mêmes conditions que celui des réacteurs C et D.
La figure III-3 schématise les différents éléments de ce suivi :
- les conditions opératoires,
- les paramètres analysés permettant plus particulièrement le suivi de la microflore.

)LJXUH,,,5pFDSLWXODWLIGXVXLYLG¶XQUpDFWHXU

124
III.2.3.2. Assignation des pics SSCP
Les pics dominants ( et ) présents sur le profil SSCP obtenus à t = 44 jours pour le réacteur S
ont été identifiés.
Pour réaliser cette étape, la région V3 de l’ ADNr 16S de l’ échantillon de boues activées issu du
réacteur S à t = 44 jours a été amplifiée grâce à l’ utilisation de l’ amorce universelle W031 et de
l’ amorce W049 spécifique du domaine bactérien (Tableau II-3).
L’ amplification a été réalisée en présence de 1U d’ ADN polymérase Taq red (Sigma), de 1 µL
d’ ADN, de Tampon Taq Red 10X, de 40 mmol de dNTP (Promega), de 0,2 µg de chacune des
amorces (Proligo). Le volume final est ajusté à 50 µL.
Le programme d’ amplification a été réalisé comme suit :
dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min,
1min à 94°C,
puis trente cycles composés de trois paliers comme suit 1min à 61°C,
1 min à 72°C
et une extension finale de 10 min à 72°C.

Le produit d’ amplification a été vérifié sur gel d’ agarose à 2 % contenant du bromure d’ éthidium.
Un fragment de deux cents paires de bases environ a été amplifié.
Le clonage de ces fragments ADNr 16S a été réalisé selon le même protocole que précédemment.
L’ analyse SSCP de onze clones a été réalisée dans les mêmes conditions que celles des
échantillons de boues (paragraphe II.2.3.3.). Ces clones co-migrent avec les pics  et  présents sur le
profil obtenu à t = 44 jours.
La figure III-4 présente les assignations des pics du profil SSCP obtenus à t = 44 jours.

125
)LJXUH,,,$VVLJQDWLRQGHVSLFVDX[SURILOV66&3REWHQXVjSDUWLUGHO¶pFKDQWLOORQLVVXGXUpDFWHXU
6jW MRXUV

Le pic  est une réplique du pic . Une banque de clones contenant la région V3 de l’ ADNr 16S a
été réalisée. Sur onze clones testés, trois clones migrent de manière équivalente au pic , et huit
migrent de manière équivalente au pic .
Pour chaque pic, trois clones co-migrants ont été sélectionnés ; les clones 1, 6 et 9 pour le pic  et
les clones 2, 4, et 11 pour le pic . Ensuite, le séquençage de l’ insert d’ ADNr 16S présent a été réalisé
dans les mêmes conditions que précédemment (paragraphe II.2.3.3.).

126
,,,5pVXOWDWV
Dans cette étude, la microflore présente dans les boues aérées issues des réacteurs S et H a été
caractérisée selon trois paramètres :
- l’ activité de biodégradation,
- la densité bactérienne,
- la diversité de la microflore.

III.3.1. Période 1 : Elimination des composés chlorés

III.3.1.1. Activité de biodégradation


Les composés chlorés ne sont pas dégradés dans les réacteurs H et S.
La détermination de la concentration des COV dans les échantillons de boues activées a été
effectuée. Le tableau III-1 récapitule la concentration moyenne obtenue pour les composés chlorés au
cours de ces trente huit jours.

7DEOHDX,,,&RQFHQWUDWLRQPR\HQQHGHVFRPSRVpVFKORUpVGDQVOHVERXHVDFWLYpHVGHVUpDFWHXUV6
HW+GXUDQWOHVWUHQWHKXLWSUHPLHUVMRXUVGHO¶H[SpULHQFH

Réacteur Concentration en mg/L


S 22
H 15

La valeur trouvée pour les composés chlorés est équivalente dans les deux réacteurs. De plus, elle
est comparable à celle obtenue lors de l’ analyse de la concentration des composés chlorés dans les
boues activées du réacteur C.

Si on considère les réacteurs à l’ équilibre thermodynamique et selon la loi de Henry, la


concentration du DCM et du DCE dans la phase aqueuse est en adéquation avec la concentration de
ces mêmes composés en phase gazeuse. Ces résultats confirment l’ absence de dégradation de ces
composés de la phase aqueuse.

127
III.3.1.2. Densités bactériennes
La densité bactérienne a été évaluée comme suit :
OHVFHOOXOHVWRWDOHV FRORUDWLRQ'$3,
OHVEDFWpULHVDFWLYHV FRORUDWLRQSDUOH&7&
Les résultats des dénombrements obtenus au cours de la première période sont présentés sur la
figure III-5.

)LJXUH,,,(YROXWLRQGHVGHQVLWpVGHVFHOOXOHV'$3,HW&7&ORUVGHODPLVHHQURXWHGHV
UpDFWHXUV6HW+
'$3,&7& 

La figure III-5 montre que les densités évoluent de manière similaire dans les deux réacteurs. En
effet, lorsque les boues activées sont uniquement soumises aux composés chlorés, une légère
diminution du nombre de cellules DAPI+ est notée dès le deuxième jour (de 3,1*108 cellules
DAPI+.ml-1 à 1,9*108 cellules DAPI+.ml-1). Entre t = 5 jours et t = 30 jours, les valeurs obtenues sont
en moyenne de 2,4*108 cellules DAPI+.ml-1. A t = 37 jours, les valeurs obtenues pour les réacteurs H
et S sont respectivement de 3,3*108 cellules DAPI+.ml-1 et 4,1*108 cellules DAPI+.ml-1.

Le nombre de cellules CTC+ pour chaque réacteur reste stable compte tenu de l’ écart-type de la
méthode. Il est en moyenne de 2,9*107 cellules CTC+.ml-1 pour les deux réacteurs.
Le ratio du nombre de cellules CTC+ évolue :
- entre t = 0 et t = 5 jours, le ratio augmente de 10 % à 20 %
- entre t = 6 et t = 37 jours, le ratio diminue jusqu’ à une valeur inférieure à 10 % à t = 37 jours.

128
III.3.1.3. Structure des communautés microbiennes

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
Les électrophorégrammes obtenus à partir de l’ analyse de la flore bactérienne des réacteurs S et H
sont présentés sur la figure III-6.

)LJXUH,,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHORUVGHO¶DOLPHQWDWLRQSDUOHVFRPSRVpVFKORUpVGDQVOHV
UpDFWHXUV6HW+

129
La figure III-6 montre que, lors de la première phase de l’ expérience, le nombre de pics reste
important dans les deux réacteurs. Dans le réacteur S, trente et un pics sont dénombrés et vingt neuf
dans le réacteur H. Les pics sont repartis sur tout le profil.
L’ interprétation visuelle des profils montre de fortes similarités. Néanmoins une analyse ACP
permet de distinguer deux populations.
La figure III-7 présente les résultats de l’ ACP réalisée à partir des électrophorégrammes de la
figure III-6.

)LJXUH,,,$&3UpDOLVpHjSDUWLUGHVSURILOV66&3REWHQXVDXFRXUVGHODSUHPLqUHSpULRGHGH
O¶H[SpULHQFH6+1RPGXUpDFWHXUOHFKLIIUH'DWHGXSUpOqYHPHQW

L’ ACP permet de séparer les populations bactériennes selon leur réacteur d’ origine à partir de
t = 10 jours selon les deux premières composantes principales.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
Les électrophorégrammes obtenus à partir de l’ analyse de la flore eucaryote des réacteurs S et H
sont donnés sur la figure III-8.

130
)LJXUH,,,'\QDPLTXHGHODIORUHHXFDU\RWHORUVGHO¶DOLPHQWDWLRQSDUOHVFRPSRVpVFKORUpVGDQV
OHVUpDFWHXUV6HW+

L’ image de la communauté du domaine eucaryote, obtenue par la méthode SSCP, est modifiée
entre chaque échantillonnage laissant apparaître trois figures différentes :
- à t = 10 jours : le nombre de pic a augmenté,
- à t = 23 jours : les profils se sont simplifiés, laissant apparaître deux pics majoritaires sur la
gauche des profils.
L’ image de la flore eucaryote évolue de manière similaire dans les deux réacteurs. Les pics
présents sur les profils des différents réacteurs, à t = 10 et t = 23 jours co-migrent. Le pic dominant sur
le profil du jour t = 0 reste dominant sur les autres profils.

III.3.2. Période 2 : Addition des composés aromatiques dans le


réacteur S
Cette période s’ étend entre t = 39 et t = 66 jours. Les composés aromatiques sont ajoutés dans
l’ effluent alimentant le réacteur S. La concentration de chaque composé est de 700 mg.m-3.

III.3.2.1. Activité de biodégradation


Dans ce paragraphe, seule la dégradation des composés dans le réacteur S est décrite. En effet,
aucune élimination de polluants n’ a été enregistrée dans le réacteur H, les valeurs d’ abattements
obtenues étant inférieures à l’ erreur de la mesure.
La figure III-9 présente les valeurs d’ abattements obtenues par les différentes familles de
composés au cours de cette période pour le réacteur S.

131
)LJXUH,,,$EDWWHPHQWVJOREDX[HWSDUIDPLOOHGHFRPSRVpVREWHQXVDXFRXUVGHODGHX[LqPH
SpULRGHGDQVOHUpDFWHXU6

¾ $EDWWHPHQWJOREDO
La figure III-9 montre que les pourcentages d’ abattement évoluent au cours du temps :
- aucune élimination des composés n’ est constatée entre t = 39 et t = 40 jours.
- la dégradation atteint en moyenne 28 % à partir de t = 41 jours.

¾ $EDWWHPHQWVHORQODQDWXUHFKLPLTXHGXFRPSRVp
Les composés chlorés ne sont pas dégradés. La dégradation des composés aromatiques varie au
cours du temps :
- aucune élimination n’ est observée entre t = 39 et t = 40 jours.
- la dégradation atteint 43 % à t = 41 jours.
- l’ élimination reste stable (40 %) jusqu’ à la fin de la période (t = 66 jours).

¾ $EDWWHPHQWSDUFRPSRVp
La figure III-10 présente les valeurs d’ abattements obtenues par les différents composés
aromatiques au cours de cette période par le réacteur S.

132
)LJXUH,,,$EDWWHPHQWVGHVFRPSRVpVDURPDWLTXHVREWHQXVDXFRXUVGHODGHX[LqPHSpULRGHGDQV
OHUpDFWHXU6

La dégradation des différents composés aromatiques n’ est pas similaire. En effet, la comparaison
de l’ abattement pour chaque composé montre les résultats suivants. Les valeurs obtenues, entre t = 61
et t = 66 jours, sont pour l’ EB de 71 %, de 41 % pour le toluène et de 33 % pour le p-xylène. Compte
tenu de l’ erreur de la mesure qui a été évaluée à 11 % (paragraphe II.2.3.1.), la dégradation de l’ EB est
plus élevée que celle du p-xylène et du toluène.

¾ &RQFHQWUDWLRQGHV&29GDQVOHVERXHV
La détermination de la concentration des COV présents dans les échantillons de boues aérées a
été effectuée. Le tableau III-2 récapitule la concentration moyenne obtenue pour les composés chlorés
et aromatiques au cours de la deuxième période.

7DEOHDX,,,&RQFHQWUDWLRQPR\HQQHGHVFRPSRVpVFKORUpVHWDURPDWLTXHVGDQVOHVERXHVDFWLYpHV
GHVUpDFWHXUV6HW+GXUDQWODGHX[LqPHSpULRGHGHO¶H[SpULHQFH

Concentration en mg.L-1
Réacteur Chlorés Aromatiques
S 22 3
H 13

133
Les concentrations des composés chlorés sont équivalentes à celle de la première période.
La valeur obtenue pour les composés aromatiques est comparable à celle obtenue lors de
l’ analyse de la concentration de ces mêmes composés dans les boues activées du réacteur C.
Si on considère les réacteurs à l’ équilibre thermodynamique et selon la loi de Henry, la
concentration des composés aromatiques dans la phase aqueuse est en adéquation avec celle de la
phase gazeuse. Cette valeur correspond à moins de 1 % de la valeur des composés aromatiques
dégradés au cours de cette période. Par conséquent, les valeurs d’ abattements sont dues à une activité
bactérienne.

III.3.2.2. Densités bactériennes


La figure III-11 montre l’ évolution des densités des cellules bactériennes totales et actives
obtenues après une double coloration au DAPI-CTC entre t = 37 et t = 68 jours.

)LJXUH,,,'HQVLWpVEDFWpULHQQHVREWHQXHVHQWUHW HWW MRXUVGDQVOHVUpDFWHXUV6HW+


'$3,&7& 

A partir de t = 38 jours, les densités des deux réacteurs évoluent de manière distincte.
Dans le cas du réacteur S, la détermination de la densité des cellules DAPI+ montre que le
nombre de cellules.mL-1 entre les jours t = 44 et t = 66 jours oscille autour de 5,0*108 cellules.mL-1. Le
ratio CTC+ sur DAPI+ augmente progressivement, de 8 % à t = 37 jours, à 25 % à t = 58 jours.
La flore totale présente dans le réacteur H se maintient à une densité de 3,7*108 cellules.mL-1 au
cours de cette période. Le ratio du nombre de cellules CTC+ sur le nombre de cellules DAPI+ a été
calculé, il s’ élève en moyenne à 5 % pour t = 37, 44 et 58 jours.

III.3.2.3. Structure des communautés microbiennes

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
La figure III-12 présente les profils SSCP obtenus à partir des échantillons prélevés dans les
réacteurs S et H.

134
)LJXUH,,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHDXFRXUVGHODVHFRQGHSpULRGHGDQVOHVGHX[UpDFWHXUV

5pDFWHXU+
L’ image de la flore évolue, une simplification de l’ image de la communauté est visible à t = 58
jours. Sur les deux derniers profils, deux pics ( et ) ont une intensité plus importante que les
autres, ils se situent sur la gauche de l’ électrophorégramme.

5pDFWHXU6
Au cours de la deuxième période, l’ image de la communauté évolue. En effet, cinq jours après la
modification de l’ effluent, le profil SSCP obtenu est différent ; quatre pics majoritaires sont visibles
sur la droite du profil ( et ). Cette image de la communauté est conservée jusqu’ à t = 65 jours.
Deux des pics dominants ( et ), présents sur le profil à t = 44 jours, ont été identifiés. Le tableau
III-3 présente les résultats de cette assignation.

135
7DEOHDX,,,,GHQWLILFDWLRQGHVFORQHV

Nom Micro-organismes ou clones ayant la plus forte


similarité de séquences (n. d'
accession) - % Similarité
 COVELI S44-1 Clone PHOS-HD43 (AF314451) 98 %
COVELI S44-6 Clone Ph20 (AY345360) 98 %
COVELI S44-9 Isolat 5-20 (AJ222834) 100 %
 COVELI S44-2 $FLQHWREDFWHU sp. PG7 (AF500327) 100 %
COVELI S44-4 $FLQHWREDFWHU sp. PG7 (AF500327) 100 %
COVELI S44-11 $FLQHWREDFWHU sp. PG7 (AF500327) 100 %

Les séquences co-migrant avec le pic  ont une homologie de séquences de 100 %, la séquence la
plus proche est $FLQHWREDFWHUVS. PG7, une souche isolée d’ un sol. Les séquences co-migrant avec le
pic  ont une homologie de séquences supérieure ou égale à 97 %. Les valeurs d’ homologie entre ces
dernières sont les suivantes :
- 98 % entre S44-1 et S44-6,
- 97 % entre S44-1 et S44-9,
- 99 % entre S44-6 et S44-9
Les micro-organismes ou clones ayant la plus forte similarité de séquences sont issus de boues
activées (PHOS-HD43, DabertHWDO, 2001), d’ eau douce (Isolat 5-20), ou de l’ océan (Clone Ph20).

La différence d’ homologie, entre les séquences S44-1 et S44-6 et S44-9, s’ explique par une
variation de quatorze paires de bases. Ces bases sont localisées sur deux régions, dont sept entre les
bases cent vingt cinq et cent trente deux et sept entre les paires de bases cent quarante quatre et cent
cinquante et un de la séquence. En se basant sur la structure secondaire de l’ ARNr 16S, ces deux
régions, situées sur un motif de type « tige-boucle », s’ apparient. Pour les séquences S44-1 et S44-6 et
S44-9, bien que des variations entre les séquences soient observées, les conformations spatiales
resteraient similaireq et par conséquent expliqueraient la co-migration des séquences.

L’ observation des séquences nucléotidiques des six clones montre que la différence de migration
entre les deux pics peut être expliquée par une variation de dix paires de bases situées entre les bases
cent vingt cinq et cent cinquante deux de la séquence.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
Les électrophorégrammes obtenus à partir de l’ analyse de la flore eucaryote au cours de cette
deuxième période sont présentés sur la figure III-13.

136
)LJXUH,,,'\QDPLTXHGHODIORUHHXFDU\RWHGDQVOHVUpDFWHXUV6HW+

Au cours de cette période, la communauté présente dans les deux réacteurs évolue jusqu’ à t = 39
jours de manière similaire, puis des différences sont observées.

5pDFWHXU6
Le pic dominant ( HVWFRQVHUYp/HQRPEUHGHSLFQHYDULHSDVDLQVLTXHOHXUSRVLWLRQQHPHQW
sur le profil.

5pDFWHXU+
Sur le profil t = 58 jours, le pic dominant ( ) se situe plus à gauche que sur le profil précédent. Le
pic qui dominait sur les profils précédents ( HVWWRXMRXUVSUpVHQWPDLVVRQLQWHQVLWpUHODWLYHHVWSOXV
faible.

III.3.3. Période 3 : Addition des composés oxygénés dans le


réacteur S

Cette période s’ étend entre t = 67 et t = 117 jours. Les composés oxygénés sont ajoutés
progressivement dans l’ effluent alimentant le réacteur S.
- Entre t = 67 et t = 96 jours, la concentration des composés oxygénés atteint 140 mg.m-3,
- Entre t = 83 et t = 96 jours, la concentration des composés oxygénés atteint 350 mg.m-3,
- Entre t = 97 et t = 117 jours, la concentration des composés oxygénés atteint la valeur de
700 mg.m-3.

137
III.3.3.1. Activité de biodégradation
La figure III-14 présente les valeurs d’ abattements obtenues par les différents composés dans le
réacteur S. Une activité de dégradation a été observée dans le réacteur S. Aucune élimination de
polluants n’ a été mesurée dans le réacteur H.

)LJXUH,,,$EDWWHPHQWGHVGLIIpUHQWHVIDPLOOHVGHFRPSRVpVGDQVOHUpDFWHXU6DXFRXUVGHOD
WURLVLqPHSpULRGH

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

¾ $EDWWHPHQWJOREDO
Les valeurs d’ abattement évoluent avec l’ addition puis l’ augmentation de la concentration en
composés oxygénés. Elles augmentent transitoirement de 30 % à 58 % entre t = 67 et t = 70 jours, puis
elles diminuent, et atteignent 40 % entre t = 71 et t = 86 jours. Cette valeur se stabilise à 30 % à partir
de t = 87 jours. Le maximum d’ élimination obtenu au cours des cent dix sept jours de fonctionnement
du réacteur S est atteint lors de l’ addition de composés oxygénés entre t = 67 et t = 70 jours.

¾ $EDWWHPHQWSDUFRPSRVpV
&RPSRVpVFKORUpV
Ils ne sont pas dégradés au cours de cette période dans le réacteur S.

138
&RPSRVpVDURPDWLTXHV
Leur dégradation diminue progressivement lorsque les composés oxygénés sont ajoutés. La
dégradation est quasiment nulle lorsque la concentration des composés oxygénés atteint 350 mg.m-3.
La figure III-15 présente les valeurs d’ abattement obtenues par les différents composés
aromatiques dans le réacteur S.

)LJXUH,,,$EDWWHPHQWGHVGLIIpUHQWVFRPSRVpVDURPDWLTXHVGDQVOHUpDFWHXU6DXFRXUVGHOD
WURLVLqPHSpULRGH

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

Les trois composés aromatiques suivent des évolutions similaires. Les valeurs d’ abattement de
l’ EB, du toluène et du p-xylène sont respectivement de 68, 44 et 26 % entre les jours t = 67 et t = 70.
De plus, l’ élimination de ces composés devient nulle (inférieure à 10 %) à partir de t = 71 jours
pour le p-xylène, de t = 83 jours pour le toluène et de t = 97 jours pour l’ EB. Ainsi, l’ ordre de
dégradation observé est le suivant : EB > toluène > p-xylène.

&RPSRVpVR[\JpQpV
Ils sont dégradés dès leur addition dans l’ effluent à traiter (figure III-14). Lorsque la concentration
des composés oxygénés est de 140 mg.m-3, les valeurs d’ abattement sont de 83 % entre t = 67 et t = 70
jours, puis elles diminuent et se stabilisent à 65 %. Les valeurs d’ abattement ont tendance à diminuer
lorsque la concentration des composés oxygénés est de 350 mg.m-3, et atteignent 54 % entre t = 87 et
t = 96 jours. Lors de l’ augmentation suivante de la concentration des composés oxygénés, les valeurs
d’ abattement restent stables à 50 %.

139
La figure suivante représente l’ évolution des valeurs d’ abattement des composés oxygénés au
cours de cette période (figure III-16).

)LJXUH,,,(YROXWLRQGHO¶DEDWWHPHQWGHVFRPSRVpVR[\JpQpVGDQVOHUpDFWHXU6&pWRQHV
$FpWRQHHW0,%&(VWHUV$%HW$(

&RQFHQWUDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVPJP 

La figure III-16 montre que la valeur maximale d’ abattement des composés oxygénés est obtenue
le jour de leur introduction dans l’ effluent. Par la suite, les valeurs d’ abattement des composés
oxygénés diminuent à l’ exception de celles des esters :
- l’ AE et l’ AB sont totalement éliminés au cours de cette période,
- l’ abattement du méthanol est de 100 % à t = 66 jours, il diminue ensuite pour se stabiliser à
61 % à partir de t = 76 jours. Lors de la modification de la concentration en composés oxygénés,
l’ élimination du méthanol reste stable à 70 %. Lors de la dernière augmentation de
concentration des composés oxygénés, les valeurs d’ abattements atteignent 51 % à partir de
t = 102 jours,
- l’ élimination de la MEC est de 78 % à t = 67 jours. Cette valeur reste constante jusqu’ à t = 82
jours. Lors des modifications suivantes, les valeurs d’ élimination de la MEC diminuent à 55 %
entre t = 83 et t = 96 jours, puis à 19 % entre t = 102 et t = 117 jours,

140
- L’ efficacité d’ élimination de l’ acétone et de la MIBC diminue de 62 % à t = 67 jours à 21 % à
t = 76 jours. Leur pourcentage d’ abattement oscille, ensuite, autour de 7 % entre t = 86 et
t = 117 jours.

&DSDFLWpG¶pOLPLQDWLRQ
La figure III-17 montre l’ évolution de la capacité d’ élimination des composés oxygénés dans le
réacteur S, ainsi que celle obtenue dans le cas où tous les composés oxygénés seraient éliminés avec
une efficacité d’ élimination de 100%.

)LJXUH,,,(YROXWLRQGHODFDSDFLWpG¶pOLPLQDWLRQGHVFRPSRVpVR[\JpQpVHQIRQFWLRQGHOHXU
FKDUJHYROXPLTXHGDQVO¶HIIOXHQWG¶DOLPHQWDWLRQ
 &(WKpRULTXH &(REWHQXHVGDQVOHUpDFWHXU6

La capacité d’ élimination des composés oxygénés au cours des trois périodes augmente.
Néanmoins, la courbe obtenue pour le réacteur S montre que la capacité maximale d’ élimination des
composés oxygénés se situe approximativement autour de 35 g.m-3.h-1.

141
III.3.3.2. Densités bactériennes
La figure III-18 montre l’ évolution des densités des cellules totales et actives obtenues après une
double coloration au DAPI-CTC entre t = 58 et t = 114 jours.

)LJXUH,,,(YROXWLRQGHVGHQVLWpVGHVFHOOXOHVFRORUpHVSDUOH'$3,HWOH&7&DXFRXUVGHOD
WURLVLqPHSpULRGH
'$3,&7& 

L’ évolution des densités bactériennes est différente suivant le réacteur considéré.


Dans le réacteur H, le nombre de cellules DAPI +.mL-1 se maintient à 2,6*108. Le ratio des
cellules CTC+ sur les cellules DAPI+ est inférieur à 5 %.
Dans le réacteur S, le nombre de cellules DAPI +.mL-1 augmente de 4,7*108 (t = 66 jours) à
8,8*108 (t = 117 jours). Le ratio du nombre de cellules CTC+ sur DAPI+ est supérieur à 25 % au cours
de cette période.

III.3.3.3. Structure des communautés microbiennes

¾ &RPPXQDXWpEDFWpULHQQH
Les images de la communauté bactérienne obtenues, suite à l’ ajout des composés oxygénés dans
l’ effluent gazeux alimentant le réacteur S à une concentration de 140 mg.m-3, sont présentées sur la
figure III-19.

142
)LJXUH,,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHGHVGHX[UpDFWHXUVHQWUHW HWW MRXUV

5pDFWHXU+
L’ image de la communauté bactérienne évolue peu. Des pics minoritaires à t = 65 jours
deviennent majoritaires par la suite, portant à quinze le nombre de pics visibles.

5pDFWHXU6
Le nombre de pics reste constant. Les modifications interviennent au niveau du pic majoritaire de
chaque profil :
- sur les électrophorégrammes obtenus à t = 65, 68 et 72 jours, le pic ayant l’ intensité la
plus élevée est le même ().
- le pic le plus haut à t = 75 jours est différent (). Le pic  est toujours visible mais
présente une intensité relative inférieure.
- à t = 79 jours, les pics  et , majoritaires sur les profils à t = 72 et à t = 75 jours sont
présents et co-dominent le profil (Figure III-19).

143
La dynamique bactérienne des trente quatre derniers jours de fonctionnement des réacteurs S et H
est présentée sur la figure III-20.

)LJXUH,,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHGHVGHX[UpDFWHXUVHQWUHW HWW MRXUV

5pDFWHXU+
La figure III-20 montre que la structure de la communauté bactérienne subit peu de modification
au cours des trente quatre derniers jours de l’ expérience.

5pDFWHXU6
La figure III-20 montre que le nombre de pics augmente : vingt cinq pics, en moyenne, sont
dénombrés par profil en fin d’ expérience. Parmi ces pics repartis sur tout le profil, deux pics ( situé
à gauche,  à droite du profil) ont une intensité supérieure aux autres.

144
7 MRXUV
La comparaison des profils obtenus pour les deux réacteurs à t = 114 jours montre que les pics
dominants ne co-migrent pas.

¾ &RPPXQDXWpHXFDU\RWH
Les images de la communauté eucaryote, obtenues au cours de la troisième période de
fonctionnement des réacteurs, sont présentées sur la figure III-21.

)LJXUH,,,'\QDPLTXHGHODFRPPXQDXWpHXFDU\RWHGDQVOHVUpDFWHXUV6HW+DXFRXUVGHOD
WURLVLqPHSpULRGH

La dynamique de la diversité du domaine est différente pour les deux réacteurs :

5pDFWHXU+
Le profil obtenu à t = 72 jours permet de visualiser un nombre de pics supérieur à celui obtenu sur
le profil à t = 58 jours (quatre pics pour deux). Entre t = 82 et t = 96 jours, le profil n’ enregistre pas de
modification. Une nouvelle augmentation du nombre de pics est observée sur le profil obtenu à t = 114
jours (sept pics). Il convient de noter que le pic ayant l’ intensité de signal la plus élevée sur chaque
profil ( ) reste identique.

145
5pDFWHXU6
A t = 72 jours, le pic dominant est le même que celui visible sur le profil obtenu à t = 0 jour. Une
modification de l’ image du domaine eucaryote survient entre t = 72 et t = 114 jours. Le nombre de pic
augmente de cinq à neuf, et le pic dominant change également.

La comparaison des profils obtenus à t = 114 jours pour les deux réacteurs montre que les pics
dominants sur la gauche du profil co-migrent. (figure III-22)

)LJXUH,,,$OLJQHPHQWGHVpOHFWURSKRUpJUDPPHVREWHQXVSRXUOHVUpDFWHXUV6HW+jW 
MRXUV/HVIOqFKHVLQGLTXHQWOHVSLFVFRPLJUDQW

146
,,,'LVFXVVLRQ
Dans cette étude, le fonctionnement de deux réacteurs, nommés S et H, soumis à des effluents
gazeux contenant différents mélanges de COV a été évalué sur cent dix sept jours. Le réacteur H a été
alimenté par un effluent gazeux contenant du DCM et du DCE. La composition de l’ effluent gazeux
alimentant le réacteur S a été modifiée au cours de l’ expérience. Les polluants ont été introduits de
manière séquentielle dans le mélange en fonction de la nature chimique des molécules et selon un
ordre croissant de biodégradabilité. Ainsi, trois périodes ont été définies (figure III-2) :
- entre t = 1 et t = 38 jours : l’ effluent est composé uniquement des composés chlorés, la
concentration de chaque composé est de 700 mg.m-3.
- entre t = 39 et t = 66 jours, les composés aromatiques sont ajoutés à la concentration de
700 mg.m-3 pour chaque composé.
- entre t = 67 et t = 117 jours, les composés oxygénés ont été introduits dans le mélange
progressivement. La concentration de chaque composé, qui augmente par palier, est
successivement de 140, 350 et 700 mg.m-3.

III.4.1. Préliminaire méthodologique : choix du référent


L’ effluent gazeux alimentant les boues activées du réacteur H ne contient que les composés
chlorés. Les objectifs de la mise en oeuvre de ce réacteur sont doubles :
- disposer d’ un réacteur permettant d’ observer la dégradation exclusive des composés chlorés,
- disposer d’ un référent afin d’ étudier l’ influence des perturbations apportées au réacteur S, et
plus particulièrement au niveau de l’ analyse de la diversité microbienne.

Lors des études basées sur le suivi des populations bactériennes, l’ élaboration d’ un réacteur
référent capable de représenter « l’ évolution normale de la flore » est délicate. Les modèles de
configurations pouvant constituer ce référent sont les suivants :
- un réacteur aéré mais non alimenté,
- un réacteur aéré et alimenté par une source de carbone facilement métabolisable par exemple du
glucose,
- le suivi du réacteur d’ origine,
- la mise en oeuvre de réacteurs identiques. Néanmoins, la reproduction des paramètres
environnementaux peut ne pas garantir la similarité des réacteurs en terme de fonctionnalité et
de diversité (Kaewpipat et Grady, 2002, Lee HW DO, 2002a). De plus, Hashsham HW DO, 2000
émet l’ hypothèse que l’ absence de reproductibilité de réacteurs identiques et ensemencés par un
même inoculum peut être due à la flore minoritaire.

147
Aucun modèle n’ est pleinement satisfaisant. Lors de cette étude, nous avons opté pour cette
dernière solution. Lors de l’ analyse de la flore bactérienne, deux structures des communautés ont été
observées :
- au cours des quarante quatre premiers jours, l’ image de la communauté évolue peu ; les profils
comptent une trentaine de pics, possédant tous une intensité de signal quasiment équivalente. Ce
résultat permet d’ observer l’ impact des perturbations, à t = 38 jours, sur le fonctionnement du
réacteur S.
- à partir de t = 58 jours, la structure de la flore bactérienne se modifie. Les profils comptent
quinze pics, dont cinq ont une intensité relative plus importante que les autres.

Le témoin utilisé (réacteur H) permet de visualiser la modification de la structure de la microflore


bactérienne, grâce à la modification tardive de la flore de ce réacteur par rapport à la date
d’ introduction des composés aromatiques dans l’ effluent gazeux alimentant le réacteur S.

III.4.2. Comparaison de l’ évolution des réacteurs

III.4.2.1. Impact des composés chlorés

¾ 5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOH
Les composés chlorés ne sont pas dégradés au cours de cette période. Cette absence de
dégradation est due soit à :
- l’ absence d’ une flore apte à leur dégradation,
- une concentration trop importante de ces composés dans les boues, induisant une toxicité élevée,
- la nécessité de disposer des composés oxygénés dans le mélange.

Lors de ces travaux, les différents réacteurs (C, D, S, H) ont été ensemencés à partir du même
échantillon de boues activées. Ainsi, parmi les individus composant la communauté bactérienne
présente dans les réacteurs H et S, certains ont la capacité à dégrader les composés chlorés, comme
cela a été montré dans le chapitre II.

¾ &RORQLVDWLRQWHPSRUHOOHGHVUpDFWHXUV
Au cours de cette période, les densités des cellules DAPI+ sont stables. L’ introduction des
composés chlorés semble induire une légère diminution du nombre de cellules au cours des cinq
premiers jours de l’ expérience. Le ratio du nombre de cellules CTC+ sur le nombre de cellules DAPI+
augmente transitoirement de 10 % à 20 % entre t = 0 et t = 5 jours.

148
Les profils de la communauté microbienne obtenus lors de l’ alimentation de réacteurs S et H par
un effluent gazeux identique montre visuellement des ressemblances. En effet, le nombre de pics est
élevé, ils sont repartis sur toute la longueur du profil, et ont des intensités équivalentes. Néanmoins,
l’ ACP montre une distinction entre les deux populations. Cette variation peut être due essentiellement
aux biais introduits lors de la phase d’ amplification d’ ADN.

L’ introduction des composés chlorés dans les deux réacteurs à une concentration de 20 mg.L-1 de
boues activées en moyenne a un très faible impact du point de vue de la structure de la communauté
microbienne au cours de ces trente huit jours de fonctionnement.

III.4.2.2. Ajout des composés aromatiques

¾ 5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOH
Les composés aromatiques sont éliminés à hauteur de 40 % trois jours après leur addition dans
l’ effluent à traiter. Cependant, la dégradation des différents composés aromatiques n’ est pas similaire.
Les valeurs d’ abattement de ces composés sont les suivantes (entre t = 61 et t = 66 jours) :
- 71 % pour l’ EB,
- 41 % pour le toluène,
- 33 % pour le p-xylène.
L’ ordre de dégradation de ces composés est : EB> toluène >p-xylène.

Lors de précédentes études, il a été montré que le p-xylène est moins facilement éliminé que les
deux autres composés aromatiques. Aizpuru, 2001 a montré, dans un biofiltre traitant le mélange
complexe de ces onze COV, que le p-xylène était moins efficacement éliminé que le toluène et l’ EB.
Lorsque la charge volumique appliquée était de 110 g.m-3.h-1 les valeurs d’ abattement des ces
composés étaient respectivement de 72, 89 et 89 %. De plus, Khammar, 2002 a montré que lors du
retrait des composés oxygénés d’ un mélange de onze COV, la dégradation des composés aromatiques,
et plus particulièrement celle du p-xylène diminue.

¾ &RORQLVDWLRQWHPSRUHOOHGHVUpDFWHXUVHQIRQFWLRQGHOD
FRPSRVLWLRQGHO¶HIIOXHQW
5pDFWHXU+
Entre t = 39 et t = 66 jours, les composés chlorés ne sont pas dégradés, les densités des cellules
DAPI+ sont stables à 4*108 cellules.mL-1. Une modification de l’ image de la communauté bactérienne
a lieu entre t = 44 et t = 58 jours. Deux structures sont identifiables :

149
- à t = 44 jours, les profils comptent une trentaine de pics, possédant tous une intensité de signal
quasiment équivalente.
- à partir de t = 58 jours, les profils comptent quinze pics, dont cinq ont une intensité relative plus
importante que les autres.

Cette variation de la structure de la communauté peut être le reflet de l’ adaptation de la


microflore aux conditions environnementales. Les réacteurs sont soumis à la présence de deux
composés chlorés reconnus comme étant toxiques pour les cellules. De plus, les communautés
microbiennes subissent un jeûne prolongé.

Certaines populations bactériennes présentes dans les boues aérées peuvent être capables de
développer des formes de résistances aux conditions oligotrophiques. Dans le cadre de l’ étude des
réponses physiologiques de populations bactériennes introduites dans un environnement oligotrophe,
Van OverbeekHWDO, 1995 ont mis en évidence l’ adaptabilité de 3VHXGRPRQDVIOXRUHVFHQFHV dans le
sol. De même Eguchi HW DO, 1996 ont utilisé la souche RB2256 de 6SKLQJRPRQDV VS. capable de
résister aux conditions du milieu marin.
Ces auteurs ont montré que ces formes de résistances aux conditions oligotrophiques présentaient
des phénomènes de résistance croisée à d’ autres types de stress. Ainsi les formes de résistances de
3VHXGRPRQDV IOXRUHVFHQFHV et 6SKLQJRPRQDV VS. souche RB2256 sont capables de survivre à des
traitements létaux comme des stress thermiques, oxydants ou à la présence d’ éthanol. De même,
WatanabeHWDO, 2000, montrent que l’ implantation d’ un micro-organisme exogène tel que 5DOVWRQLD
HXWURSKD E2 dans des boues activées est favorisée, lorsque celle-ci subissait, au préalable, une courte
période de carence en source de carbone.
De plus, des populations bactériennes peuvent également utiliser des composés tels que l’ azote
contenu dans la solution aqueuse enrichie en minéraux, ou la matière organique contenue dans les
boues. La mise en place d’ espèces bactériennes chimiolithotrophes utilisant l’ azote ammoniacal
pourrait également expliquer la variation de la diversité microbienne. Le temps de génération des
bactéries nitrifiantes étant élevé, le temps nécessaire à la colonisation de cet écosystème par ces
populations est important. Dans le cadre de notre étude, la modification de la diversité bactérienne est
observée cinquante huit jours, soit près de deux mois après le démarrage du réacteur.

5pDFWHXU6
L’ addition des composés aromatiques dans l’ effluent gazeux à traiter induit plusieurs
modifications dans le réacteur S :
- la dégradation des composés aromatiques atteint 40 % à t = 41 jours.
- la densité des cellules DAPI+ est en moyenne de 5,0*108 cellules.mL-1. Le ratio des cellules
CTC+ sur les cellules DAPI+ augmente de 8 à 25 % à t = 58 jours.

150
- l’ image de la flore bactérienne est modifiée à t = 44 jours. Les profils ne comptent que deux à
quatre pics situés sur la droite des profils.
L’ introduction des composés aromatiques entraîne leur dégradation, ainsi qu’ une simplification
de la flore avec l’ apparition de pics dominants sur la droite des profils.

Les deux pics dominants du profil obtenu à t = 44 jours ont été assignés. Les séquences co-
migrant avec le pic dominant sur le profil obtenu à t = 44 jours présente une homologie de séquence
supérieure à 97 %. Pour le deuxième pic identifié, les séquences présentent une homologie de 100 %.

Chacune des séquences est liée au genre $FLQHWREDFWHU. Ce genre appartient à la sous division 
3URWHREDFWHULD. Ce genre bactérien est ubiquitaire, il est retrouvé dans les sols, l’ eau et les boues
activées (Barberio et Fani, 1998, HoltHWDO, 1994, KnightHWDO, 1995, WagnerHWDO, 1994).

Ces bactéries émergent lorsque les composés aromatiques sont présents dans l’ effluent gazeux à
traiter et qu’ ils sont dégradés dans le réacteur S. L’ hypothèse énoncée est leur rôle probable dans la
dégradation de ces composés. Les capacités, de certaines espèces d’ $FLQHWREDFWHU, à dégrader des
composés aromatiques tels que le p-xylène et toluène ont effectivement été mises en évidence (Leahy
et Olsen, 1997, LeahyHWDO, 2003, ZilliHWDO, 2001). De plus, les bactéries appartenant à ce genre
sont connues pour être inclus dans la dégradation de diverses autres molécules aromatiques comme les
diphényles, les chlorodiphényles, l’ aniline, le phénol, les phénylalcanes, le styrène et le 1,2,4
triméthylbenzène (Barberio et Fani, 1998, LeahyHWDO, 2003).

III.4.2.3. Ajout des composés oxygénés

¾ 5pVXOWDQWHIRQFWLRQQHOOH
5pDFWHXU+
Entre t = 97 et t = 117 jours, les composés chlorés ne sont pas dégradés.

5pDFWHXU6
L’ efficacité d’ élimination des composés aromatiques diminue progressivement lorsque les
composés oxygénés sont ajoutés. La dégradation est quasiment nulle lorsque la concentration des
composés oxygénés atteint 350 mg.m-3. En revanche, les composés oxygénés sont dégradés dès leur
addition dans l’ effluent à traiter. Les valeurs d’ abattement diminuent de 83 %, entre t = 67 et t = 70
jours, à 54 %, entre t = 87 et t = 96 jours. Elles se stabilisent à 50 % jusqu’ à la fin de l’ expérience

Les effluents gazeux d’ origine industrielle sont généralement composés d’ un mélange complexe
de COV. En d’ autres termes, les molécules polluantes sont variées et appartiennent à des familles
chimiques différentes (Le Cloirec et Martin, 1998). Les travaux menés dans le cadre de cette étude

151
ainsi que ceux de Aizpuru, 2001 et Khammar, 2002 ont mis en évidence que lors du traitement de
COV par voie biologique, l’ efficacité de traitement des différentes familles de composés suit l’ ordre
de biodégradabilité.
Les raisons de la conservation de cet ordre de biodégradation dans les unités de traitement sont
probablement le résultat de la combinaison de plusieurs facteurs :
¾ les phénomènes de sorption déterminant la disponibilité des composés pour les micro-
organismes,
¾ la vitesse de dégradation,
¾ la toxicité des composés considérés,
¾ le rendement énergétique de la dégradation,
¾ les interactions entre les composés,
¾ les interactions au sein de la flore microbienne.

¾ &RORQLVDWLRQWHPSRUHOOHGHVUpDFWHXUVHQIRQFWLRQGHOD
FRPSRVLWLRQGHO¶HIIOXHQW
5pDFWHXU+
Les densités des cellules DAPI+ sont stables à 2,6*108 cellules.mL-1. L’ image de la structure de la
communauté bactérienne est stable, avec cinq pics ayant une intensité plus élevée que les autres.

5pDFWHXU6
L’ addition progressive des composés oxygénés dans l’ effluent gazeux à traiter induit des
modifications au niveau des paramètres du suivi :
- l’ augmentation de la quantité de polluants éliminés,
- l’ inhibition progressive de la dégradation des composés aromatiques lors de l’ addition de
composés oxygénés,
- la variation de la flore bactérienne est visible à partir de t = 75 jours. Le pic dominant a changé
à t = 79 jours. De plus, le nombre de pics augmente. Ainsi, de nouveaux pics apparaissent sur
la gauche du profil (t = 107 jours). A t = 114 jours, le pic qui prédomine est localisé sur la
gauche du profil. Les pics situés sur la droite du profil sont toujours présents.
- l’ augmentation de la densité bactérienne de 4,7*108 cellules DAPI+.mL-1 à t = 66 jours à
8,8*108 cellules.mL-1 à t = 117 jours.

Les composés aromatiques introduits dans l’ effluent alimentant le réacteur S sont éliminés ; en
parallèle, le développement d’ une flore dominante sur la droite des profils SSCP est observé. Les
composés oxygénés ajoutés dans l’ effluent gazeux sont également dégradés et une flore dominante sur
la gauche des profils SSCP se développe.

152
Le même résultat a été obtenu par KhammarHWDO, 2005. Le travail réalisé met en évidence que
la dégradation d’ un mélange de onze COV, similaire à celui utilisé dans notre travail, entraîne une
structuration longitudinale de deux biofiltres, garnis de tourbe, en termes de dégradation des polluants
et de structuration de la communauté microbienne. Seuls les composés oxygénés sont dégradés en tête
de colonne. L’ analyse SSCP de la communauté bactérienne réalisée sur des échantillons de tourbe
prélevés à cette profondeur montre que les pics dominants sont essentiellement situés sur la gauche du
profil. Les composés aromatiques sont dégradés en bas de colonne, lorsque les composés oxygénés ont
été éliminés, et la microflore dominante associée à cette profondeur du biofiltre se localise sur la droite
des profils SSCP. Il convient de noter que ces résultats sont à manier avec prudence car les conditions
opératoires utilisées lors de cette étude et de notre travail ne sont pas les mêmes, plus particulièrement
en terme de configuration des réacteurs mis en œ uvre. En effet, nous disposons d’ une flore
microbienne libre dans un milieu aqueux contrairement aux biofiltres utilisés par Khammar HWDO, 2005
dans lesquels la flore bactérienne se développe en formant un biofilm. Les paramètres de l’ analyse
SSCP en revanche ne montrant pas de différences, la position des pics sur la gauche des profils est
probablement la signature de groupes phylogéniques proches.

III.4.3. Cas particuliers de la communauté eucaryote


Les profils de la flore eucaryote sont semblables pour les deux réacteurs sauf entre t = 58 et t = 93
jours.
De plus, ces profils montrent de nombreuses modifications au cours du temps. Aucun lien ne peut
être établi entre la diversité présente et l’ activité de biodégradation. Dans ce type de procédé, la
majorité des populations de la microfaune (procaryotes et métazoaires) est bactériophage mais
certaines peuvent participer directement à l’ assimilation directe de la matière organique (CanlerHWDO,
1999). Il est probable que dans un réacteur biologique, tel que ceux utilisés dans cette étude, l’ activité
de biodégradation soit due à la flore bactérienne.
La flore eucaryote figurant sur les profils représente probablement les protozoaires qui
présenteraient essentiellement une activité de régulation de l’ écosystème (Edeline, 1979). Juteau HW
DO, 1999 ont émis l’ hypothèse que la résistance à la prédation pouvait conditionner l’ abondance de
certaines espèces bactériennes, tels que les individus du genres 3VHXGRQRFDUGLD et 5KRGRFRFFXV, dans
des biofiltres traitant des effluents gazeux chargés en toluène.
Il convient de noter qu’ une flore eucaryote, notamment des espèces fongiques, peut être utilisée
pour ensemencer des procédés de dépollution afin de traiter les effluents (ChristenHWDO, 2002, Van
HeiningenHWDO, 2000, Woertz et Kinney, 2000). L’ utilisation préférentielle de ces organismes dans
des biofiltres a été avancée pour traiter des effluents présentant de fortes charges volumiques.

153
III.4.4. Réactivité du système
Lorsque les polluants introduits peuvent être dégradés par la flore microbienne présente (réacteur
S) :
- les performances maximales d’ élimination sont rapidement atteintes dans ce type de
réacteur. L’ échelle de temps est de l’ ordre de la semaine.
- la variation de la flore bactérienne dominante est observée selon la même échelle de
temps.
Lorsque les polluants ne sont pas dégradés, des variations de la structure de la communauté
bactérienne sont observées. L’ échelle de temps est alors de l’ ordre du mois (réacteur H).
Pour observer la réactivité de la microflore l’ utilisation d’ un référent adéquat est nécessaire.

L’ observation de la réactivité du système met en évidence qu’ il est possible de corréler


l’ apparition d’ une activité de biodégradation avec l’ apparition d’ une flore bactérienne. En revanche, la
disparition d’ une communauté en place consécutivement à la disparition d’ une activité de dégradation
est plus lente (réacteur S). Pour approcher les mécanismes de biodégradation dans un écosystème tels
que les procédés biologiques de traitement d’ air, il semble judicieux de considérer l’ apparition d’ une
activité et de la relier à la communauté bactérienne émergente.

III.4.5. Application Industrielle : dégradation des composés récalcitrants

Les communautés bactériennes présentes au sein des réacteurs utilisés dans cette étude sont
capables de dégrader les composés chlorés (réacteur D, Chapitre II). Cependant, dans les deux
réacteurs S et H, ces composés ne sont pas éliminés. La concentration des composés chlorés dans les
boues aérées est probablement trop élevée, elle est deux fois supérieure dans la phase aqueuse du
réacteur S par rapport à celle du réacteur D. L’ effet toxique de la concentration utilisée est donc
suggéré.

De plus, au cours des soixante huit premiers jours, aucune flore spécifique n’ est sélectionnée.
Ainsi, l’ utilisation d’ un traitement agressif n’ induit pas une meilleure sélectivité de la microflore.

Par conséquent, la concentration appliquée au cours du traitement couramment réalisé avant


l’ ensemencement des biofiltres au laboratoire n’ atteint pas l’ objectif recherché à savoir la sélection
d’ une microflore apte à dégrader un mélange complexe de polluants.

154
Les composés aromatiques sont dégradés lorsqu’ ils sont introduits seuls dans l’ effluent à traiter.
Leur dégradation est inhibée lors de l’ ajout des composés oxygénés, qui sont plus facilement
biodégradables (Deshusses HW DO, 1999 ;Aizpuru HW DO, 2001, Liu HW DO, 2002 ; Khammar, 2002).
Ainsi la sélection de la flore, pour améliorer la dégradation des composés récalcitrants, est difficile à
mettre en oeuvre, la flore utilise préférentiellement les composés fournissant les rendements
énergétiques les plus élevés lors de leur oxydation.

Pour enrichir l’ LQRFXOXP avec des espèces efficaces dans la dégradation des molécules
difficilement biodégraddable, afin d’ améliorer l’ étape de pré-acclimatation le dispositif utilisé doit être
modifié.

Le système doit être simple à mettre en œ uvre. La sélection d’ une microflore efficace en terme de
dégradation des polluants à traiter serait observée en alimentant des boues activées par un effluent
gazeux contenant l’ intégralité des composés à traiter ou non. En se basant sur les données de cette
étude, ainsi que celles obtenues lors des études de biofiltration du même mélange de onze COV
(Aizpuru, 2001, Khammar, 2002), un système couplant deux voire trois réacteurs pourrait être testé.
Ce travail nécessite au préalable de comprendre le lien existant entre la dégradation des composés
oxygénés et celle des composés chlorés (période 3 du réacteur D). Cette relation peut être de même
nature que dans l’ étude de Kao HW DO, 2003 pour laquelle la dégradation du tétrachloroéthylène est
améliorée lorsque l’ oxygène du milieu est limité, soit il peut s’ agir d’ une relation de co-métabolisme.

De plus, le travail réalisé montre que les réacteurs doit être alimenter avec un effluent contenant
les COV à une concentration équivalente à celle alimentant le réacteur D pour les composés
aromatiques et chlorés.
Dans le premier réacteur, il est fort probable que les composés oxygénés, aromatiques et chlorés
soient éliminés. Dans le réacteur suivant, la flore intervenant dans l’ élimination des composés plus
récalcitrants (aromatiques et chlorés) pourrait être favorisée. Néanmoins, dans ce dernier, il est
important de vérifier si les interactions entre substrats sont respectées et donc de contrôler les
paramètres environnementaux.
De plus, il convient de noter que si la flore sélectionnée est ensuite, mise en contact avec des
composés plus facilement biodégradables, l’ équilibre de l’ écosystème sera modifié et la flore
s’ adaptera à ce nouvel environnement en utilisant probablement préférentiellement les composés les
plus facilement métabolisables. Le développement d’ un biofilm à partir d’ une flore en suspension
ayant subi préalablement une phase d’ enrichissement peut entraîner la mise en place d’ une
communauté bactérienne présentant des caractéristiques différentes de celle obtenue à l’ issue de la
phase d’ enrichissement (StoffelsHWDO, 1998).

155
156
%5{OHGHO¶KLVWRLUHGHODPLFURIORUHGDQVOH
IRQFWLRQQHPHQW
Le suivi microbiologique des réacteurs S et H a permis de mettre en évidence les résultats
suivants :
- l’ alimentation d’ un réacteur par un effluent gazeux contenant exclusivement des composés
récalcitrants ne permet pas d’ améliorer l’ élimination de ces composés même si l’ LQRFXOXP
bactérien considéré est complexe.
- l’ application de perturbations sur le réacteur S a un impact sur le fonctionnement de la
microflore. En terme de fonctionnalité, la microflore utilise préférentiellement les composés les
plus facilement métabolisables. De plus, la structure de la flore bactérienne est également
modifiée.

La question qui se pose est donc la suivante : Quel est le comportement d’ un réacteur après qu’ il
ait subi des perturbations antérieures ? En d’ autres termes, le passé de la microflore et donc sa
structure a-t-il un rôle dans le fonctionnement de l’ écosystème ?

,,,'pPDUFKHH[SpULPHQWDOH
Pour apporter des éléments de réponse à cette question, deux réacteurs (S et C) ensemencés par le
même LQRFXOXP de départ ont été alimentés pendant soixante jours par un effluent gazeux dont la
composition diffère, avant d’ être soumis à un effluent gazeux de composition identique pendant
cinquante et un jours.

Les conditions opératoires concernant ces deux réacteurs sont les suivantes :
- les schémas de la génération des effluents gazeux et des réacteurs, sont donnés aux
paragraphes II.2.1. pour le réacteur C et III.2.1. pour le réacteur S,
- la composition de l’ effluent gazeux alimentant ces réacteurs est rappelée sur la figure III-23.

157

)LJXUH,,,&RPSRVLWLRQGHO¶HIIOXHQWJD]HX[DOLPHQWDQWOHVUpDFWHXUV6HW&

Dans cette étude deux périodes sont considérées :


1) entre t = 1 et t = 66 jours : la composition de l’ effluent à traiter alimentant les deux
réacteurs est différente :
- le réacteur C est alimenté par un effluent contenant les composés chlorés,
aromatiques et oxygénés.
- le réacteur S est alimenté uniquement avec les composés chlorés, puis un
effluent gazeux contenant les composés chlorés et aromatiques.

2) entre t = 67 et t = 117 jours, la composition de l’ effluent gazeux alimentant chaque


réacteur est similaire. L’ effluent gazeux contient les onze COV.
La concentration des composés chlorés et aromatiques est de 700 mg.m-3. La
concentration des composés oxygénés augmente par palier :
- elle est de 140 mg.m-3 entre t = 67 et t = 82 jours,
- elle est de 350 mg.m-3 entre t = 83 et t = 96 jours,
- elle est de 700 mg.m-3 entre t = 97 et t = 117 jours.

Les méthodes d’ analyses des COV sont décrites dans le chapitre II (paragraphe II.2.3.).

158
,,,5pVXOWDWV
Les résultats de ces réacteurs ont déjà été commentés dans le chapitre précédent ou dans la
première partie de ce chapitre. Ils sont donc juste rappelés dans le paragraphe suivant.

III.6.1. Activités de biodégradation

III.6.1.1. T = 0 à t = 66 jours
Au cours de cette période, la composition de l’ effluent alimentant les deux réacteurs est
différente. Les valeurs d’ abattement, obtenues à t = 66 jours, sont indiquées dans le tableau III-4.

7DEOHDX,,,3RXUFHQWDJHVG¶DEDWWHPHQWUHOHYpVjW MRXUVGHIRQFWLRQQHPHQWGHVUpDFWHXUV6HW
&

Composés Réacteur S Réacteur C


Oxygénés _ 45
Aromatiques 36 Pas de dégradation
Chlorés Pas de dégradation Pas de dégradation

Les résultats présentés dans le tableau III-4 montrent que les composés aromatiques sont dégradés
dans le réacteur S.
Dans le réacteur C, les composés aromatiques et chlorés ne sont pas éliminés. Concernant les
composés oxygénés, le pourcentage d’ abattement des esters et de la MEC atteint respectivement
100 % et 53 %. Le méthanol, l’ acétone et la MIBC ne sont pas dégradés.

III.6.1.2. A partir de t = 66 jours


A partir de t = 66 jours, la composition de l’ effluent alimentant les réacteurs S et C est identique.
La concentration des composés chlorés et aromatiques est de 700 mg.m-3. La concentration des
composés oxygénés augmente progressivement jusqu’ à 700 mg.m-3.

¾ $EDWWHPHQWVJOREDX[
Les abattements globaux obtenus pour les réacteurs S et C entre t = 66 et t = 117 jours sont
représentés sur la figure III-24.

159
)LJXUH,,,$EDWWHPHQWVJOREDX[GHVUpDFWHXUV&HW6HQWUHW HWW MRXUV

 UpDFWHXU&HW UpDFWHXU6

La figure III-24 montre que les abattements globaux évoluent de manière similaire pour les deux
réacteurs.

¾ $EDWWHPHQWVHORQOHVFRPSRVpV
/HVFRPSRVpVFKORUpVQHVRQWSDVpOLPLQpV
Les composés aromatiques sont uniquement dégradés dans le réacteur S. Cependant, leur
abattement diminue progressivement de 40 % (t = 66 jours) à 20 % (t = 67 jours) puis de 20 à
0 % (t = 82 jours) avec l’ addition progressive des composés oxygénés.
L’ élimination des composés oxygénés en fonction du temps est indiquée dans la figure III-25.
- les esters sont complètement dégradés,
- l’ acétone et la MIBC présentent une valeur d’ abattement de 34 % entre t = 66 et t = 82
jours dans les deux réacteurs. Elles ne sont plus éliminées à partir de t = 83 jours.
- les valeurs d’ abattement de la MEC dans les réacteurs S et C ne sont pas équivalentes
entre t = 66 et t = 82 jours. Elle est de 96 % pour le réacteur C et de 75 % pour le
réacteur S. Dans les deux réacteurs, l’ efficacité d’ élimination diminue au cours du
temps. Entre t = 97 et t = 117 jours, les valeurs du pourcentage d’ abattement sont
similaires, elles sont de 32 %.
- entre t = 66 et t = 82 jours, les valeurs d’ abattement du méthanol ne sont pas identiques
pour les deux réacteurs. Elles sont respectivement de 35 % et de 75 % pour les réacteurs
C et S. Elles deviennent similaires entre t = 97 et t = 117 jours (53 %).

160
)LJXUH,,,$EDWWHPHQWGDQVOHVUpDFWHXUV&HW6DXFRXUVGHODGHX[LqPHSKDVHGHO¶H[SpULHQFHHQ
IRQFWLRQGHO¶HIIOXHQWG¶DOLPHQWDWLRQ

III.6.2. Densités bactériennes


Les résultats des dénombrements sont présentés sur la figure III-26.

III.6.2.1. T = 0 à t = 66 jours
Dans le réacteur C, le nombre de cellules DAPI+ augmente de 3,1*108 cellules.mL-1 à 1,9*109
cellules.mL-1 à t = 66 jours. Le ratio des cellules CTC+ sur les cellules DAPI+ est en moyenne de
23 %.

161
Dans le cas du réacteur S, la densité des cellules DAPI+ reste stable. A t = 0, le nombre de
cellules est de 3,1*108 cellules.mL-1 ; et 4,7*108 cellules.mL-1 à t = 66 jours. Le ratio des cellules
CTC+ sur les cellules DAPI+ est de 14 %.

III.6.2.2. A partir de t = 66 jours


Dans la seconde partie de l’ expérience, la densité des cellules DAPI+, dans le réacteur C, reste
constante, à 2,2*109 cellules.mL-1. Le ratio des cellules CTC+ sur les cellules DAPI+ est en moyenne
de 23 %.
Dans le réacteur S, le nombre de bactéries DAPI+ augmente de 4,7*108 cellules.mL-1 à 9,0*108
cellules.mL-1.
Le ratio des cellules CTC+ sur les cellules DAPI+ est de 27 % au cours de la deuxième partie de
l’ expérience.

)LJXUH,,,(YROXWLRQGHVGHQVLWpVEDFWpULHQQHVGDQVOHVUpDFWHXUV6HW&DXFRXUVGHVFHQWGL[VHSW
MRXUVGHIRQFWLRQQHPHQWGHVUpDFWHXUV

'$3,&7& 

III.6.3. Structure du domaine bactérien


Les principaux électrophorégrammes obtenus lors de l’ analyse des échantillons des réacteurs S et
C, de t = 66 à t = 117 jours, sont présentés sur la figure III-27.

162
)LJXUH,,,'\QDPLTXHEDFWpULHQQHGDQVOHVGHX[UpDFWHXUVGHW jW MRXUV

La structure du domaine bactérien, révélée par la méthode SSCP, montre que la diversité de la
microflore présente dans le réacteur C évolue peu. Le nombre de pics est de dix huit, ils sont
majoritairement présents sur la gauche des profils.
Les profils issus du réacteur S permettent de dénombrer quatre pics à t = 64 jours. Puis entre
t = 79 à t = 114 jours, des pics apparaissent sur la gauche du profil, et vingt cinq pics sont dénombrés à
t = 114 jours. Les nouveaux pics sont visibles sur la gauche des profils, dont un possède l’ intensité la
plus élevée lors de l’ analyse de l’ échantillon à t = 114 jours.

163
Pour analyser plus finement ces résultats, une analyse en composante principale a été réalisée. Le
résultat est présenté sur la figure III-28.


)LJXUH,,,$&3SURGXLWjSDUWLUGHVSURILOV66&3

L’ analyse ACP révèle une différenciation entre deux populations selon l’ axe 2, qui correspond à
30 % de la variance. Ces populations correspondent aux deux réacteurs.
De plus, les distances mesurées entre les échantillons prélevés dans le réacteur S sont plus élevées
que celles mesurées entre les échantillons prélevés dans le réacteur C. Cette différence est
principalement portée par la première composante principale du graphique qui correspond à 41 % de la
variance.

Les profils obtenus lors de l’ analyse SSCP des échantillons prélevés à différents jours ont été
alignés puis comparés. Les profils à t = 64 et 65 jours pour les deux réacteurs montrent des images de
la diversité différentes, aucun pic ne co-migre, en revanche, l’ alignement des profils obtenus à t = 114
jours (figure III-29) indique que six pics co-migrent.

164
)LJXUH,,,(OHFWURSKRUpJUDPPHVREWHQXVORUVGHO¶DQDO\VHGHVpFKDQWLOORQVjW RXHW
W MRXUV

III.6.4. Structure du domaine eucaryote


Les principaux électrophorégrammes obtenus lors de l’ analyse des échantillons des réacteurs S et
C, sont présentés sur la figure III-30.

5pDFWHXU6
Le nombre de pics s’ élève à six sur le profil issu de l’ échantillon prélevé à t = 1 jour. Le profil
comportant le plus grand nombre de pics est celui provenant de l’ échantillon prélevé à t = 114 jours ;
dix pics sont dénombrés. Néanmoins les profils sont différents pour chaque prélèvement.

5pDFWHXU&
Pour l’ échantillon prélevé à t = 114 jours, six pics ont pu être dénombrés. Cette valeur est
conservée sur les profils obtenus à partir d’ échantillons prélevés entre t = 40 et t = 100 jours.

&RPSDUDLVRQ&HW6
La superposition des profils à t = 114 jours montre deux communautés distinctes.

165
)LJXUH,,,'\QDPLTXHGHODIORUHHXFDU\RWHGDQVOHVGHX[UpDFWHXUVWRXWDXORQJGHO¶H[SpULHQFH

166
,,,'LVFXVVLRQ
Au cours de cette étude, un échantillon de boues activées prélevé dans une station d’ épuration
urbaine a été reparti dans deux réacteurs en verre. Dans un premier temps, les réacteurs ont été
alimentés par des effluents gazeux de compositions différentes, puis par un effluent gazeux dont la
composition est identique.

III.7.1. Deux histoires différentes


A t = 66 jours, les trois paramètres du suivi présentent des caractéristiques différentes.
L’ activité de biodégradation est propre à chaque réacteur. Dans le réacteur C, seuls trois
composés sur les onze contenus dans l’ effluent gazeux, sont dégradés : les esters avec un abattement
de 100 %, et la MEC avec un abattement de 53 %. Pour le réacteur S, trois composés sur cinq présents
dans l’ effluent gazeux sont éliminés ; les valeurs d’ abattement sont respectivement de 52 %, 41 % et
28 % pour l’ EB, le toluène et le p-xylène.
Les densités bactériennes sont différentes. Le nombre de cellules DAPI+.mL-1 est plus important
dans le réacteur C par rapport au réacteur S avec respectivement 1,9*109 cellules.mL-1 et 4,7*108
cellules.mL-1. Le ratio de la densité des cellules CTC+ sur la densité des cellules DAPI+ est supérieur
pour le réacteur C que pour le réacteur S (23 % contre 14 %).
Les structures des communautés bactériennes et eucaryotes sont différentes à t = 66 jours. Dans le
cas de la structure de la communauté bactérienne, les profils SSCP se sont simplifiés entre t = 0 et
t = 66 jours dans les deux réacteurs. Cependant, cette simplification s’ est effectuée selon deux voies
distinctes. Dans le cas du réacteur C, les pics dénombrés (18) apparaissent majoritairement sur la
gauche du profil, alors que pour le réacteur S, les pics (4) sont localisés sur la droite du profil.
L’ alimentation de ces réacteurs par un effluent gazeux de composition différente a donc induit des
fonctionnements différents au niveau de la microflore.

III.7.2. Impact de l’ histoire d’ un écosystème


Dans un deuxième temps, l’ effluent gazeux alimentant les réacteurs S et C est similaire.

1) Les suivis des activités de dégradation ont montré que les abattements globaux sont
équivalents :
- les composés chlorés ne sont pas éliminés, quel que soit le réacteur considéré.
- les composés aromatiques ne sont pas dégradés dans le réacteur C. Dans le second réacteur,
l’ élimination de ces composés diminue progressivement de 40 % (t = 66 jours) à 20 % (t = 67
jours) puis de 20 à 0 % (t = 82 jours).

167
- les valeurs d’ abattement des composés oxygénés diminuent au cours du temps dans les deux
réacteurs :
- les esters sont complètement éliminés dans les deux réacteurs
- la dégradation de l’ acétone et de la MIBC suivent la même évolution
- l’ élimination de la MEC, dans les deux réacteurs, converge pour être identique à
partir de t = 96 jours. Dans le réacteur C, les valeurs d’ abattement diminuent de 96 %
à t = 66-82 jours à 31 % à t = 96-117 jours. Pour le réacteur S, les valeurs
d’ abattement diminuent de 75 % à t = 66-82 jours à 36 % à t = 96-117 jours.
- l’ élimination du méthanol converge pour être identique à partir de t = 96 jours. Elle
augmente, dans le réacteur C, de 35 % à t = 66-82 jours à 49 % à t = 96-117 jours.
Elle diminue, dans le réacteur S, de 75 % à t = 66-82 jours a 57 % à t = 96-117 jours.

2) La densité des cellules DAPI+ dénombrées sur l’ échantillon prélevé à t = 114 jours est deux
fois plus élevée dans le réacteur C (2,2*109 cellules.mL-1) que dans celle du réacteur S (8,8*108
cellules.mL-1). Cependant, dans ce dernier réacteur, la densité augmente, entre t = 66 et t = 114 jours,
contrairement au réacteur C.
Le ratio CTC+ sur DAPI+ devient similaire pour les deux réacteurs au cours de la deuxième
période. Il a été évalué à 23 % pour le réacteur C et à 27 % pour le réacteur S.

3) La dynamique bactérienne des deux réacteurs diffère. Pour le réacteur C, l’ image de la


diversité évolue peu. En revanche, sur les profils issus du réacteur S, le nombre de pics présents sur les
profils augmente au cours du temps. A t = 66 jours, les pics dominants se situent sur la droite du profil,
et à partir de t = 79 jours, des pics apparaissent sur la gauche du profil, dont l’ un devient dominant à
t = 114 jours. La comparaison des deux profils obtenus à t = 114 jours montre que 6 pics, localisés sur
la gauche du profil co-migrent.

Dans le chapitre II et la partie A de ce chapitre, la probabilité d’ un lien entre les pics présents sur
les profils et les activités de biodégradation a été suggérée :
- les pics situés sur la droite du profil correspondraient à des espèces bactériennes intervenant
dans la dégradation des composés aromatiques (réacteur S),
- les pics situés sur la gauche du profil correspondraient à des espèces bactériennes intervenant
dans la dégradation des composés oxygénés (réacteur C et S).
Le maintien du pic sur la droite du profil dans le cas du réacteur S, à t= 114 jours, peut être dû :
- au maintien des effectifs de ces espèces,
- à une intervention de ces espèces dans la dégradation des composés oxygénés.
Pour distinguer ces hypothèses, il aurait été intéressant de poursuivre le fonctionnement des
réacteurs C et S. De plus, des éléments de réponse pourraient être apportés par l’ assignation des pics.

168
Les résultats obtenus montrent que ce type de perturbations n’ entraîne pas de dysfonctionnement
à long terme des réacteurs.
De plus, en termes écologiques, .les résultats obtenus mettent en évidence la résilience de ces
systèmes tant en termes d’ activités de biodégradation que de structure génétique de la diversité.

III.7.3. Application industrielle


La première partie de l’ expérience peut être assimilée à une perturbation survenant à un réacteur
de dépollution en fonctionnement. Dans le cadre de notre étude, la convergence des paramètres du
suivi, lorsque l’ effluent devient similaire, diminue l’ importance de cette perturbation sur le
fonctionnement de la microflore.
Dans le cas de l’ utilisation d’ un biolaveur pour le traitement des émissions gazeuses industrielles
chargées en COV, les boues présentes dans le bassin d’ épuration peuvent être renouvelées. Cette
étape, par conséquent, peut entraîner le lessivage d’ espèces minoritaires pouvant intervenir dans la
dégradation de composés susceptibles d’ alimenter le réacteur lors d’ une période définie dans le temps.
L’ impact des perturbations sur le fonctionnement du procédé pourrait être ainsi plus important.
Les mêmes phénomènes interviennent dans le cas de l’ utilisation d’ un biofiltre ou d’ un lit
percolateur. Dans le cas du fonctionnement d’ un biofiltre et d’ un filtre percolateur, les variations de la
flore peuvent être dues effectivement à l’ effet toxique des polluants, au développement du biofilm
bactérien, mais aussi au lessivage. Néanmoins, pour ces procédés, l’ impact des polluants est
probablement différent de celui induit sur une biomasse libre. De plus, le lessivage de la flore pourrait
être ralenti présentant ainsi tout l’ intérêt d’ une biomasse fixée dans le cas du traitement d’ un effluent
dont la composition serait variable dans le temps.

169
,,,&RQFOXVLRQ
Au cours du fonctionnement des procédés biologiques de traitement d’ air, l’ adaptation de la
microflore à de nouvelles conditions environnementales se produit en permanence. Dans ce chapitre,
deux aspects du fonctionnement de la microflore suite à l’ application de perturbations ont été étudiés.
Lorsque l’ effluent gazeux est enrichi en composés plus facilement biodégradables, la flore
microbienne s’ adapte et utilise prioritairement ces derniers. Cette adaptation est visible au niveau de la
résultante fonctionnelle de l’ écosystème et de la diversité de la microflore, même après un à deux mois
de fonctionnement sans contact préalable avec les composés étudiés.
Le suivi microbiologique de deux réacteurs, inoculés par une microflore identique et soumis à un
effluent gazeux dont la composition diffère pendant une période de temps déterminée, montre que les
communautés microbiennes s’ adaptent spécifiquement aux conditions environnementales. La structure
des communautés microbiennes, identique à t = 0, diverge à t = 66 jours. Suite à cette période,
l’ alimentation de ces deux réacteurs par un effluent gazeux de composition identique indique que le
type de perturbations appliqué n’ entraîne pas de dysfonctionnement à long terme des réacteurs.
De plus, les résultats obtenus mettent en évidence la résilience de ces systèmes tant en termes
d’ activités de biodégradation que de structure génétique de la diversité. Ce résultat met en évidence,
dans le cadre des procédés biologiques de traitement d’ air chargés en COV, que l’ impact de
perturbations sur le fonctionnement de la microflore pourrait être limité. Ces résultats montrent
également que ces systèmes sont robustes et peuvent s’ adapter à la composition qualitative et
quantitative de l’ effluent gazeux à traiter.

170
&RQFOXVLRQ*pQpUDOH

Dans le cadre du traitement des effluents gazeux contenant des COV, les procédés biologiques
sont couramment mis en oeuvre. La pérennité de ces procédés est directement liée à la compréhension
de l’ écologie microbienne au sein de ces écosystèmes complexes. Or, les études portant sur le
fonctionnement microbien au sein de ces réacteurs sont rares et disparates.

L’ objectif de ce travail de thèse portait sur l’ approche des mécanismes biologiques survenant lors
des périodes critiques du fonctionnement de ces réacteurs que sont la phase de mise en place de la
communauté microbienne impliquée dans la dégradation des polluants et les phases de perturbations.
Lors de l’ étude de l’ écosystème, trois paramètres ont été choisis afin de caractériser la microflore ; la
densité, la diversité, et la résultante fonctionnelle.

Le chapitre II a mis en évidence l’ influence de la charge volumique sur les performances des
réacteurs. Un réacteur alimenté par une forte charge en COV (115,5g.h-1.m-3) est caractérisé par une
flore bactérienne dominée par un petit nombre de phylotypes (3). Parmi les trois familles constituant le
mélange de COV, seuls les composés les plus facilement biodégradables sont éliminés, soient les
composés oxygénés. Le pourcentage d’ abattement global atteint 35 %. Lorsque la charge appliquée est
plus faible (23,1g.h-1.m-3), la diversité de la flore bactérienne est très étendue et les rapports de
dominance sont égaux. Tous les composés sont éliminés et les efficacités d’ élimination sont les
suivantes : 100% pour les composés oxygénés, 60% pour les composés aromatiques et chlorés. Ces
résultats montrent que l’ application d’ une plus faible charge permet d’ obtenir un meilleur rendement
du système. L’ efficacité d’ élimination obtenue est plus élevée et un plus large spectre de composés
éliminés est observé. De plus, une microflore plus riche est conservée. Ce travail a mis en évidence
qu’ une microflore plus diversifiée et plus équilibrée en terme d’ abondances relatives est associée à un
meilleur fonctionnement du système .
La composition de la flore bactérienne présente au sein du réacteur D a été déterminée. La flore
bactérienne est composée majoritairement de bactéries de la division des &)% (37 %) et des sous
divisions et  3URWHREDFWHULD (respectivement 16 % et 15 %).

Le chapitre III a montré que lors de l’ introduction successive des composés selon un ordre
croissant en terme de biodégradabilité, la microflore s’ adapte à chaque modification de l’ effluent.
Ainsi, la structure de la microflore diffère suivant la composition de l’ effluent gazeux. Les résultats
montrent également que les composés facilement biodégradables sont préférentiellement éliminés : les
composés aromatiques par rapport aux composés chlorés et les composés oxygénés par rapport aux
composés aromatiques et chlorés.

171
Quel que soit le mode d’ introduction des composés dans l’ effluent (simultané ou progressif),
l’ écosystème atteint des performances épuratoires identiques. De plus, la structure de la microflore
présente des similarités. Ces éléments ont permis de souligner la robustesse de ces écosystèmes
complexes. De plus, en termes écologiques, il a été montré que les systèmes mis en oeuvre sont
résilients tant en termes d’ activités de biodégradation qu’ en terme de structure génétique de la
diversité.

Ainsi, ce travail, a montré que, pour une composition donnée de l’ effluent, pourrait correspondre
une résultante fonctionnelle et une structuration de la communauté microbienne spécifiques. Bien que
certains auteurs (Sakano et Kerkhof, 1998) tendent à relier l’ étendue de la diversité avec l’ efficacité
des procédés de dépollution, le résultat obtenu dans cette étude tend plutôt à relier le maintien d’ une
fonctionnalité de l’ écosystème à la structuration de la microflore.

L’ étude conjointe de trois paramètres de l’ environnement a mis en relief des relations probables
entre des groupes bactériens et leur activité de biodégradation. Ainsi l’ implication du genre
$FLQHWREDFWHU dans la dégradation des composés aromatiques a été suggérée, de même que le rôle du
groupe bactérien émergeant sur la gauche des profils SSCP lors de la dégradation des composés
oxygénés.

De point de vue applicatif, ce travail a mis en exergue que la charge volumique utilisée dans le
cadre de la pré-acclimatation des boues était inadaptée. Elle permet uniquement l’ élimination des
composés les plus facilement biodégradables. En revanche, l’ utilisation d’ une charge volumique
appropriée (23,1g.h-1.m-3) permet de sélectionner une microflore efficace en terme de dégradation des
polluants. De plus, la rapidité de l’ adaptation de la flore aux nouvelles conditions environnementales
amène à nous interroger sur la nécessité de conserver cette étape pour les laveurs biologiques mettant
en œ uvre une microflore libre.

De plus, de point de vue fondamental, ces réacteurs représentent un modèle expérimental


particulièrement intéressant pour répondre à des problématiques d’ écologie microbienne et plus
particulièrement l’ impact de perturbations sur la structuration et la fonctionnalité des communautés
microbiennes.

Pour comprendre le fonctionnement de ces écosystèmes de traitements des effluents gazeux


chargés en COV, différents axes d’ étude doivent être poursuivis.
- La microflore colonisant un écosystème dégradant un mélange de onze COV, a été identifiée.
Cependant, un manque d’ informations relatif à cette flore a été constaté. L’ affectation des
phylotypes à la dégradation d’ un composé ou d’ une famille de composés n’ est pas envisageable

172
dans le cas du traitement d’ un mélange complexe de COV. Par conséquent, il est nécessaire
d’ envisager la mise en œ uvre d’ unités pilotes simplifiées et de caractériser la microflore
colonisant ces unités pilotes alimentées par une famille de composés (composés oxygénés ou
composés aromatiques ou composés chlorés). Ce type d’ études, descriptives, est nécessaire pour
définir des outils performants et adaptés (sondes oligonucléotidiques, puces à ADN) à la mise en
oeuvre d’ une approche explicative.
- Des sondes oligo-nucléotidiques spécifiques de micro-organismes impliqués dans la
dégradation des polluants pourront ainsi être définies et permettre de mesurer l’ impact d’ une
perturbation sur les micro-organismes au sein de cet écosystème. De plus, pour approcher les
voies de biodégradation utilisées au sein de ces écosystèmes complexes, l’ identification des
produits de dégradation pourrait être envisagée, et les gènes de fonction pourront être
spécialement ciblés.

Parallèlement à ces travaux, il apparaît important de poursuivre les études concernant la


régulation de la flore bactérienne par la microfaune.

173
174





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175


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188


$QQH[HV

189
$QQH[H

&RPSRVLWLRQGHODVROXWLRQPLQpUDOHG¶DSUqV-XWHDXHWDO

Concentration (mM)
KH2PO4 10
NaHPO4 10
KNO3 5
(NH4)2SO4 18
MgSO4,7H2O 0,2
CaCl,2H2O 0,1
Fe(NH4)2(SO4)2,6H2O 0,009
H3BO3 0,0462
MnSO4H2O 0,0091
CuSO4 0,016*10-3
ZnCl2 0,015*10-3
CoCl2,6H2O 0,017*10-3
Na2MoO4,2H2O 0,01*10-3
conc. HCl 38 % 0,052

190
$QQH[H

&DUDFWpULVWLTXHVSK\VLFRFKLPLTXHVGHV&29XWLOLVpV

Pression de vapeur Solubilité à 20°C DBO5/DTO
pKow saturante (torr) § (g.L-1) §§ (*100) §§§
Méthanol -0,764 207,9 Miscible 56,7
Acétone -0,268 220,4 Miscible 38,5
MéthylEthylCétone 0,261 110,7 275 59,0
Acétate d’ éthyle 0,671 169,5 87 54,9
MéthylIsoButylCétone 1,189 8,7 20 55,5
Dichlorométhane 1,249 432,6 13,2 -
1,2-Dichloroéthane 1,458 352,1 8,7 -
Acétate de n-Butyl 1,729 8,0 6,8 23,5
Toluène 2,791 22,3 0,5 53,4
Ethyl Benzène 3,320 7,0 0,1 29,0
Para-xylène 3,440 6,1 0,1 -

§ : Les valeurs présentées dans le tableau proviennent du Hanbook of Chemistry and Physics (Lide,
1993)

§§ :. Les valeurs présentées dans le tableau proviennent du site http://www.reptox.csst.qc.ca

§§§ : Le rapport DBO5/DTO représente le ratio la demande biologique en oxygène obtenue au bout de
cinq jours sur la demande totale en oxygène. Les valeurs présentées dans le tableau sont celles établies
par Pitter et Chudoba, 1990. Plus ce rapport est élevé, plus le composé est considéré comme
facilement biodégrabable.

191
$QQH[H

3URWRFROHGHPHVXUHGHODFRQFHQWUDWLRQGHV&29GDQVOHVERXHV

La mesure de la concentration des COV dans les boues est réalisée par chromatographie gazeuse.
La détermination de la concentration des composés dans l’ espace de tête est effectuée par la méthode
des ajouts dosés de la manière suivante :
La concentration de sept composés du mélange est effectivement mesurée dans les boues. Les
composés, dont la concentration a été déterminée, sont les suivant : MEC, MIBC, toluène, EB, p-
xylène, DCM et le DCE. Les autres composés (méthanol, acétone, AE et AB) n’ ont pas été dosés, car
leurs concentrations dans l’ espace de tête, au moment du dosage, sont inférieures, pour chaque
analyse, à la limite de détection. Ces derniers étant les composés les plus facilement biodégradables du
mélange, il est probable qu’ ils soient dégradés au cours de l’ analyse.
Pour le dosage des COV dans un échantillon de boues, quatre aliquotes sont utilisées. Des
volumes croissants d’ un mélange de sept COV en solution dans du méthanol (1 g.L-1) ont été
introduits dans les aliquotes de manière à obtenir les concentrations finales suivantes : 0, 25, 50 et
75 mg de chaque COV par litre de boues dans le milieu réactionnel. Le volume final du mélange
« boues + composés » est de 4 mL. Ce mélange est réalisé dans un pilulier fermé par un bouchon
équipé d'
un septum. L’ analyse chromatographique a ensuite été réalisée sur le mélange « boues +
composés » comme suit :
Le mélange est mis sous agitation pendant 30 min. Le ciel gazeux a ensuite été prélevé à l’ aide
d’ une seringue et analysé par chromatographie en phase gazeuse selon les conditions analytiques
décrites dans le tableau II-1.
Le tracé de la droite réponse chromatographique (aire du pic) pour chaque composé en fonction
de la quantité de COV ajouté permet de déterminer la concentration initiale du composé.

192
$QQH[H

$IILOLDWLRQGHVFORQHV$'1U6SURYHQDQWGHO¶pFKDQWLOORQLVVXGXUpDFWHXU'jW MRXUV&)%
&\WRSKRJD)OH[LEDFWHU%DFWHURLGHV

Groupe et Représentant Nombre de clones Micro-organismes ou clones ayant la plus forte


sous groupe séquence D1 D2 similarité de séquences (n. d'
accession)- % Similarité
CFB COVELI D1A01 2 Clone PHOS-HE21 (AF314419) 98 %
COVELI D1A03 1 Clone RSC-II-66 (AJ252690) 93 %
COVELI D1A05 3 2 Clone NK192 (AB064674) 92 %
COVELI D1A06 5 5 Clone PHOS-HE21 (AF314419) 98 %
COVELI D1A08 2 3 Clone RSC-II-66 (AJ252690) 95 %
COVELI D1A09 2 Clone c230 (AY154587) 97 %
COVELI D1A10 1 Clone Cont29 (AY651292) 96 %
COVELI D1B02 2 Clone LiUU-3-229 (AY509281) 87 %
COVELI D1B05 2 Clone LiUU-9-112 (AY509327) 93 %
COVELI D1B08 1 Clone RSC-II-66 (AJ252690) 93 %
COVELI D1B11 1 2 Clone (AF010023) 99 %
COVELI D1C03 1 1 Clone BIhii45 (AJ318145) 95 %
COVELI D1D02 2 1 Clone SG2-137 (AY135927) 95 %
COVELI D1D10 1 1 Clone LBS15 (AJ232836) 93 %
COVELI D1D11 1 2 Clone BCM1-30B (AY102878) 94 %
COVELI D1E12 2 1 Clone RSC-II-81 (AJ252697) 95 %
COVELI D1F03 1 Clone M07 (AF495415) 89 %
COVELI D1F04 1 1 Clone Cont08 (AY651310) 99 %
COVELI D1G04 2 Clone isolate RSI-24 (AJ252591) 96 %
COVELI D1G07 2 Clone RSC-II-66 (AJ252690) 90 %
COVELI D1H02 2 Clone BIhii45 (AJ318145) 96 %
COVELI D1H04 1 Clone S37.04SM (AF432756) 93 %
COVELI D2A05 1 Clone PHOS-HE99 (AF314457) 98 %
COVELI D2C03 1 Clone LiUU-9-122 (AY509312) 88 %
COVELI D2D03 1 Clone RSC-II-66 (AJ252690) 93 %
COVELI D2D10 1 Candidatus Chryseobacterium massiliae (AF531766) 96 %
COVELI D2E07 1 Clone (AF010032) 95 %
COVELI D2E11 1 Clone PHOS-HE21 (AF314419) 93 %
COVELI D2F11 1 Clone RSC-II-66 (AJ252690) 92 %
COVELI D2G08 1 Clone S-49 (AY095416) 96 %
COVELI D2H08 1 Clone LiUU-3-229 (AY509281) 91 %
Total 38 28
 

  
COVELI D1A02 1 Clone C2 (AY268227) 94 %
COVELI D1A07 1 Clone #0319-7F4 (AF234144) 94 %
COVELI D1C09 1 Clone 40 (AF271331) 90 %
COVELI D2A12 2 Clone A12 (AF234727) 96 %
COVELI D2F06 1 CY0ARA026D10 (BX294726) 95 %
COVELI D2G05 1 Metal-contaminated soil K20-53 (AF145848) 98 %
Total 3 4
- Proteobacteria COVELI D1A12 1 Clone DSSD64 (AY328762) 98 %
  !" #$
%& " #
COVELI D1B07 7 2  (AJ416411) 98 %

193
COVELI D1B10 2 Clone WR8146 (AJ292834) 98 %
COVELI D1C10 1 Clone D5 (AY375144) 93 %
COVELI D1D06 1 Clone mle1-13 (AF280850) 99 %
COVELI D1D09 1 Clone N11.117WL (AF431058) 98 %
  
"(
 
COVELI D1E04 1 ' sp. C-1 (AB161684) 98 %
 )

COVELI D1E10 1 1 ' sp. JS1 (AJ427917) 97 %
COVELI D1H05 1 Clone DSSD33 (AY328732) 95 %
COVELI D2A02 2 Clone G12 (AF485399) 97 %
COVELI D2B06 1 Clone SIMO-2284 (AY711650) 96 %
") &+&
!
 #,# "+&
COVELI D2B10 3 * IFAM MC-750 (Y14302) 100 %
COVELI D2B11 1 Clone DSSF72 (AY328694) 98 %
COVELI D2D04 1 Clone DSSD70 (AY328768) 99 %
COVELI D2E03 2 Clone BCM3S-13B (AY102903) 94 %
Total 16 13
-Proteobacteria COVELI D1A04 1 Clone HOClCi59 (AY328608) 96 %
COVELI D1B01 2 Clone 178up (AY212629) 100 %
COVELI D1C01 1 Clone PKa8 (AJ744890) 94 %
COVELI D1D04 1 3 Clone Spb153 (AJ422165) 100 %
COVELI D1E03 1 3 Clone 36-9 (AF351219) 98 %
COVELI D1E11 2 4 Souche HTCC333 (AY429712) 99 %
COVELI D1F02 1 1 Clone HC-38 (AY168745) 96 %
COVELI D1F08 2 Clone Spb153 (AJ422165) 96 %
COVELI D1H06 1 Clone LO13.11 (AF358003) 97 %
COVELI D2B08 1 Clone TRE3 (AJ232805) 96 %
COVELI D2D08 1 Clone 237ds5 (AY212684) 97 %
COVELI D2D11 1 Clone 1H_31 (AY546500) 93 %
COVELI D2F05 1 Clone 178up (AY212629) 96 %
COVELI D2F07 1 Clone RAN-135 (AY499453) 97 %
12 16
-Proteobacteria COVELI D2E12 1 Clone DSSD70 (AY328768) 99 %
COVELI D2F09 2 Clone BIgi18 (AJ318136) 97 %

-"+.+ # / &+&!" #


COVELI D1G08 1 Clone S040 (AY037575) 98 %
01324145  !
&+ #78 #
COVELI D1D07 2 6 JS616 (AF498654) 96 %
COVELI D1H08 1 Clone HOClCi47 (AY328596) 91 %
COVELI D2B07 1 Clone BSV78 (AJ229222) 91 %
29 & + 8" #
COVELI D2C12 1 sp. EBR-02E-0046 (AB186360) 90 %
COVELI D1B03 2 Clone Ebpr14 (AF255644) 95 %
132:14;5
* COVELI D1E08 1 Clone ARFS-32 (AJ277698) 96 %
COVELI D1F09 2 Clone SMS9.86WL (AY043909) 96 %
1<+%8
  =!+& " " 
  
COVELI D2F03 1 C2 (AY262331) 97 %
3 1
2

!
&+ 
COVELI D1A11 8 5 Clone HOClCi9 (AY328558) 96 %
COVELI D1F11 2 2 Clone HOClCi47 (AY328596) 92 %
COVELI D2A11 1 Clone HOClCi47 (AY328596) 92 %
COVELI D2G02 1 Clone D5 (AY375144) 95 %
10 9
OP11 COVELI D2C02 1 Clone DA18 (AY193187) 92 %
2
 +&!"
COVELI D2H04 1 Clone F13.30 (AF495427) 96 %
><?@ A"BA CD@ E%FG
COVELI D2B05 2 Clone K128 (AJ786605) 95 %
TM7 COVELI D1F12 1 8 Clone PKa8 (AJ744890) 96 %

194
COVELI D2D01 1 Clone AT-s2-18 1 (AY225653) 95 %
COVELI D2E10 1 Clone BVB43b (AY013658) 90 %
COVELI D2G01 1 Clone 342B (AY571850) 93 %
COVELI D1C05 1 Clone APe4_11 (AB074645) 95 %
2 11

195
$QQH[H

5pSDUWLWLRQVHORQOHVpFRV\VWqPHVG¶RULJLQHHWODSUpVHQFHSRWHQWLHOOHGHSROOXDQWVGDQV
FHGHUQLHUGHVGL[VpTXHQFHVOHVSOXVSURFKHVGHVSK\ORW\SHV&29(/, EDVHGHGRQQpHV
*HQEDQN 

Présence potentielle de
Geysers, Stromatolites

Associés Animaux

Endophyte plante

Associés Homme

Boue Anaérobie
Boues Activées

polluants s***
Groundwater
Eau salée**
Eau douce*

Sédiments

Lagunage
Compost
Biofiltre

Autres
Sol
2D  
""H I .(
 !" &+H J:  8"!" &+  #
COVELI D1A01 2 3 4 1 5
COVELI D1A03 6 4 4
COVELI D1A05 2 6 1 1 2
COVELI D1A06 1 2 5 2 6
COVELI D1A08 7 3 3
COVELI D1A09 3 1 5 1 1
COVELI D1A10 1 3 6 6
COVELI D1B02 4 6
COVELI D1B05 2 2 4 1 1 3
COVELI D1B08 1 6 2 1 4
COVELI D1B11 1 9 9
COVELI D1C03 1 1 1 7 2
COVELI D1D02 2 5 3 3
COVELI D1D10 3 1 2 3 1 3
COVELI D1D11 2 6 2
COVELI D1E12 2 4 3 1 3
COVELI D1F03 3 1 3 3 3
COVELI D1F04 1 1 7 1 1
COVELI D1G04 4 2 1 1 2 4
COVELI D1G07 1 5 3 1 5
COVELI D1H02 1 1 8 2
COVELI D1H04 3 1 3 3
COVELI D2A05 2 2 2 1 3 3
COVELI D2C03 1 2 4 1 1 1 2
COVELI D2D03 1 6 2 1 3
COVELI D2D10 1 3 4 1 1 1
COVELI D2E07 2 1 4 3 3
COVELI D2E11 1 4 4 1 4
COVELI D2F11 1 6 2 1 4
COVELI D2G08 4 1 5 1
COVELI D2H08 5 3 1 1
 

  

196
COVELI D1A02 2 1 2 1 1 2 1 1
COVELI D1A07 9 1 2
COVELI D1C09 1 2 1 6 6
COVELI D2A12 5 2 2 1 3
COVELI D2F06 1 1 3 5 6
COVELI D2G05 2 8 2
- Proteobacteria
COVELI D1A12 4 3 1 1 1 2
COVELI D1B07 5 4 1 2
COVELI D1B10 10 8
COVELI D1C10 3 2 3 2
COVELI D1D06 2 1 2 1 3 1 2
COVELI D1D09 1 1 8
COVELI D1E04 5 1 1 1 1 1 2
COVELI D1E10 2 1 4 3 4
COVELI D1H05 6 1 3 1
COVELI D2A02 2 8 7
COVELI D2B06 6 2 1 1 1
COVELI D2B10 3 1 2 1 2 1 2
COVELI D2B11 9 1
COVELI D2D04 2 2 1 2 2 1 3
COVELI D2E03 3 5 2 1
-Proteobacteria
COVELI D1A04 4 3 3 5
COVELI D1B01 4 2 3 1 5
COVELI D1C01 4 1 1 4
COVELI D1D04 7 1 2 6
COVELI D1E03 4 1 2 3 6
COVELI D1E11 6 2 2 3
COVELI D1F02 4 2 1 2 1 3
COVELI D1F08 6 1 3 7
COVELI D1H06 2 3 3 1 1 2
COVELI D2B08 3 1 5 1 5
COVELI D2D08 6 1 2 1 3
COVELI D2D11 1 1 1 7
COVELI D2F05 2 1 6 1 7
COVELI D2F07 1 1 6 2 3
-Proteobacteria
COVELI D2E12 2 1 1 5 1 1
COVELI D2F09 1 3 2 2 2 7
-"+.+ # / &+&!" #
COVELI D1G08 1 1 8 1
01324145
COVELI D1B03 3 3 1 1 1 1 1
COVELI D1D07 1 9 1
COVELI D1H08 3 1 1 4 1 1
COVELI D2B07 1 7 1 1 1
COVELI D2C12 4 1 3 2 2
132:14;5
*

197
COVELI D1E08 5 1 3 1
COVELI D1F09 2 7 1
COVELI D2F03 2 8 9
2

!
&+ 
COVELI D1A11 3 2 4 1
COVELI D1F11 4 2 3 1
COVELI D2A11 4 2 3 1
COVELI D2G02 3 2 4 1
OP11
COVELI D2C02 5 2 1 2 3
2
 +&!"
COVELI D2H04 10 10
><?@ A"BA CD@ E%FG

COVELI D2B05 1 2 3 3 1 3
TM7
COVELI D1C05 3 3 2 1 1 5
COVELI D1F12 1 4 5 5
COVELI D2D01 1 5 1 3 5
COVELI D2E10 1 1 3 1 1 1 2 3
COVELI D2G01 1 5 4 4

*Eau douce (rivière, lac, marais, système distribution d'


eau, nappe, réservoir)
**Eau salée (océan, mer, marais)
***Polluants : Eaux usées, effluents gazeux, méthanol, hybrocarbures aromatiques polycycliques,
trichloroéthylène, métaux

198
7DEOHGHVILJXUHV

Chapitre 1

Figure I-1: Evolution des émissions de COVNM en France de 1990 à 2002 (d’ après le
CITEPA, 2004). A : Evolution globale, B : Evolution par secteur d’ activité..... 13
Figure I-2Les systèmes d'
épuration des COV contenus dans les effluents gazeux............ 16
Figure I-3 : Faisabilité économique des différents procédés en fonction du débit d’ air à
traiter et de la concentration en polluant (Herman, et al., 1998)........................ 17
Figure I-4 : Les procédés biologiques de traitement de l’ air pollué .................................... 21
Figure I-5 : Représentation type du fonctionnement d’ un procédé biologique.................... 23
Figure I-6 : Fonctionnement interne globale d’ un procédé de dépollution.......................... 26
Figure I-7 : Représentation de la diversité du domaine phylogénétique des bactéries
décrite en 1987 par Carl Woese (En médaillon) et en 1998 (Hugenholtz, et al.,
1998b). ............................................................................................................ 36

Chapitre 2

Figure II-1 : Dispositif expérimental. A : prélèvement des effluents gazeux, B :
prélèvement des échantillons de boues activées................................................ 56
Figure II-2 : Evolution de la composition des effluents gazeux les réacteurs D et C en
fonction du temps. A : Concentration de chaque composé B : Concentration
des composés oxygénés ................................................................................... 58
Figure II-3 : Evolution de l’ abattement global des COV en fonction du temps pour les
réacteurs C et D ............................................................................................... 68
Figure II-4 : Abattement global en fonction du temps dans les réacteurs C et D................. 69
Figure II-5 : Abattement moyen des différentes familles de composés en fonction du
temps dans le réacteur C .................................................................................. 70
Figure II-6 : Evolution de l’ abattement moyen des différents composés oxygénés dans le
réacteur C ........................................................................................................ 71
Figure II-7 : Abattement moyen des différentes familles de composés en fonction du
temps dans le réacteur D .................................................................................. 72
Figure II-8 : Dynamiques des densités bactériennes dans les réacteurs C et D au cours de
la première période .......................................................................................... 73
Figure II-9 : Comparaison des dénombrements DAPI+ pour les réacteurs C et D .............. 74
Figure II-10 : Image de la flore bactérienne présente dans différents échantillons de boues
activées, A : issue du même évènement PCR, B : issue d’ évènements PCR
différents ......................................................................................................... 75

199
Figure II-11 : Dynamique bactérienne dans les réacteurs C et D entre t = 0 et t = 36 jours . 76
Figure II-12 : Dynamique des eucaryotes dans les réacteurs C et D entre t = 0 et t = 22
jours ................................................................................................................ 78
Figure II-13 : Evolution de l’ abattement moyen des différentes familles de composés
dans le réacteur C au cours de la deuxième période.......................................... 79
Figure II-14 : Evolution de l’ abattement moyen des différents composés oxygénés dans
le réacteur C entre t = 31 et t = 47 jours............................................................ 80
Figure II-15 : Evolution de l’ abattement moyen des différentes familles de composés
dans le réacteur D au cours de la deuxième période.......................................... 81
Figure II-16 : Dynamique bactérienne au cours de la deuxième période d’ alimentation
dans les réacteurs C et D révélée par la méthode SSCP .................................... 82
Figure II-17 : Dynamique de la communauté eucaryote dans le réacteur C au cours de la
deuxième période............................................................................................. 83
Figure II-18 : Evolution de l’ abattement moyen des familles de composés dans le
réacteur C au cours de la troisième période ...................................................... 84
Figure II-19 : Evolution de l’ abattement moyen des différents composés oxygénés dans
le réacteur C .................................................................................................... 85
Figure II-20 : Evolution de l’ abattement moyen des différentes familles de composés
dans le réacteur D au cours de la troisième période. ......................................... 86
Figure II-21 : Dynamiques des densités bactériennes dans les réacteurs C et D entre
t = 36 et t = 82 jours......................................................................................... 87
Figure II-22 : Dynamique bactérienne au cours de la troisième période d’ alimentation
dans les réacteurs C et D .................................................................................. 88
Figure II-23 : Dynamique de la flore eucaryote dans les réacteurs C et D .......................... 89
Figure II-24 : Evolution de l’ abattement moyen des différentes familles de composés
dans le réacteur C entre t = 83 et t = 117 jours.................................................. 91
Figure II-25 : Evolution de l’ abattement moyen des différents composés oxygénés obtenu
au cours de la quatrième période dans le réacteur C ......................................... 92
Figure II-26 : Evolution de l’ abattement moyen des différentes familles de composés
dans le réacteur D entre t = 83 et t = 117 jours ................................................. 93
Figure II-27 : Dénombrements obtenus au cours de la période 4 de l’ expérience pour les
réacteurs C et D ............................................................................................... 94
Figure II-28 : Dynamique bactérienne au cours de la quatrième période dans les réacteurs
C et D .............................................................................................................. 95
Figure II-29 : Dynamique de la communauté eucaryote dans les réacteurs C et D au cours
de la quatrième période .................................................................................... 97
Figure II-30 : Répartition des clones et des phylotypes d’ ADNr 16S issu du réacteur D à
t = 114 jours. A : répartition des séqueneces B :répartition des phylotypes ....... 98
Figure II-31 : Résultat de l’ ACP sur les profils SSCP, C et D : Nom du réacteur, le
chiffre : jour du prélèvement.......................................................................... 113
Figure II-32 : Evolution de la CE des polluants en fonction de la concentration de ces
derniers dans l’ effluent d’ alimentation ........................................................... 116

200
Chapitre 3

Figure III-1: Les réacteurs utilisés dans cette étude. A : prélèvement des effluents
gazeux, B : prélèvement des échantillons de boues activées ........................... 122
Figure III-2: Evolution des concentrations de chaque COV dans les effluents alimentant
les réacteurs S et H. ....................................................................................... 124
Figure III-3 : Récapitulatif du suivi d’ un réacteur............................................................ 124
Figure III-4 : Assignation des pics aux profils SSCP obtenus à partir de l’ échantillon issu
du réacteur S à t = 44 jours............................................................................. 126
Figure III-5 : Evolution des densités des cellules DAPI+ et CTC+ lors de la mise en route
des réacteurs S et H........................................................................................ 128
Figure III-6 : Dynamique bactérienne lors de l’ alimentation par les composés chlorés
dans les réacteurs S et H ................................................................................ 129
Figure III-7 : ACP réalisée à partir des profils SSCP obtenus au cours de la première
période de l’ expérience. S, H : Nom du réacteur, le chiffre : Date du
prélèvement. .................................................................................................. 130
Figure III-8 : Dynamique de la flore eucaryote lors de l’ alimentation par les composés
chlorés dans les réacteurs S et H .................................................................... 131
Figure III-9 : Abattements globaux et par famille de composés obtenus au cours de la
deuxième période dans le réacteur S .............................................................. 132
Figure III-10 : Abattements des composés aromatiques obtenus au cours de la deuxième
période dans le réacteur S .............................................................................. 133
Figure III-11 : Densités bactériennes obtenues entre t = 37 et t = 66 jours dans les
réacteurs S et H.............................................................................................. 134
Figure III-12 : Dynamique bactérienne au cours de la seconde période dans les deux
réacteurs ........................................................................................................ 135
Figure III-13 : Dynamique de la flore eucaryote dans les réacteurs S et H ....................... 137
Figure III-14 : Abattement des différentes familles de composés dans le réacteur S au
cours de la troisième période.......................................................................... 138
Figure III-15 : Abattement des différents composés aromatiques dans le réacteur S au
cours de la troisième période.......................................................................... 139
Figure III-16 : Evolution de l’ abattement des composés oxygénés dans le réacteur S.
Cétones : Acétone et MIBC ; Esters : AB et AE............................................. 140
Figure III-17 : Evolution de la capacité d’ élimination des composés oxygénés en fonction
de leur charge volumique dans l’ effluent d’ alimentation ................................ 141
Figure III-18 : Evolution des densités des cellules colorées par le DAPI et le CTC au
cours de la troisième période.......................................................................... 142
Figure III-19 : Dynamique bactérienne des deux réacteurs entre t = 66 et t = 82 jours ..... 143
Figure III-20 : Dynamique bactérienne des deux réacteurs entre t = 82 et t = 114 jours.... 144
Figure III-21 : Dynamique de la communauté eucaryote dans les réacteurs S et H au
cours de la troisième période.......................................................................... 145

201
Figure III-22 : Alignement des électrophorégrammes obtenus pour les réacteurs S et H à
t = 114 jours. Les flèches indiquent les pics co- migrant................................. 146
Figure III-23 : Composition de l’ effluent gazeux alimentant les réacteurs S et C ............. 158
Figure III-24 : Abattements globaux des réacteurs C et S entre t = 66 et t = 117 jours ..... 160
Figure III-25 : Abattement dans les réacteurs C et S au cours de la deuxième phase de
l’ expérience en fonction de l’ effluent d’ alimentation ..................................... 161
Figure III-26 : Evolution des densités bactériennes dans les réacteurs S et C au cours des
cent dix sept jours de fonctionnement des réacteurs ....................................... 162
Figure III-27 : Dynamique bactérienne dans les deux réacteurs de t = 66 à t = 114 jours.. 163
Figure III-28 : ACP produit à partir des profils SSCP...................................................... 164
Figure III-29 : Electrophorégrammes obtenus lors de l’ analyse des échantillons à t = 64
ou 65 et t = 114 jours ..................................................................................... 165
Figure III-30 : Dynamique de la flore eucaryote dans les deux réacteurs tout au long de
l’ expérience ................................................................................................... 166

202
7DEOHGHVWDEOHDX[

Chapitre 1

Tableau I-1: Exemple de valeurs de pKow ........................................................................ 14


Tableau I-2: Classification des procédés biologiques de traitement d’ air ........................... 20
Tableau I-3 : Avantages et inconvénients des procédés biologiques utilisés pour le
traitement des gaz (D’ après Devinny, et al., 1999a).......................................... 22
Tableau I-4 : Principales techniques d’ analyse de la diversité microbienne........................ 30

Chapitre 2

Tableau II-1 : Conditions chromatographiques .................................................................. 60


Tableau II-2 : Valeurs de l’ erreur relative à la moyenne pour chaque COV ....................... 60
Tableau II-3 : Caractéristiques des amorces utilisées au cours de cette étude ..................... 63
Tableau II-4 : Programme d’ amplification l’ ADNr bactérien et eucaryote ......................... 64
Tableau II-5 : Concentration moyenne des familles de polluants dans les boues activées
des réacteurs C et D au cours des quarante sept premiers jours de l’ expérience 69
Tableau II-6 : Résultats des dénombrements bactériens effectués à t = 43 jour de
fonctionnement des réacteurs C et D ................................................................ 82
Tableau II-7 : Valeur de la constante de Henry pour chaque COV mesuré dans la phase
aqueuse (La constante est donnée à 20°C, sous sa forme adimensionnelle,
c’ est à dire comme le rapport de la concentration du composé dans la phase
aqueuse sur celle de la phase gazeuse). .......................................................... 102
Tableau II-8 : Recensement des individus du domaine eucaryote dans les boues activées
(Canler, et al., 1999) ...................................................................................... 115

Chapitre 3

Tableau III-1 : Concentration moyenne des composés chlorés dans les boues activées des
réacteurs S et H durant les trente huit premiers jours de l’ expérience ............. 127
Tableau III-2 : Concentration moyenne des composés chlorés et aromatiques dans les
boues activées des réacteurs S et H durant la deuxième période de
l’ expérience ................................................................................................... 133
Tableau III-3 : Identification des clones .......................................................................... 136
Tableau III-4 : Pourcentages d’ abattement relevés à t = 66 jours de fonctionnement des
réacteurs S et C. ............................................................................................. 159

203
204
205
___________________________________________________________________________
RESUME
Dans le cadre de la réduction des émissions atmosphériques des Composés Organiques
Volatils (COV), de nombreux travaux visent à optimiser la gestion des procédés biologiques
utilisés pour traiter ces effluents.
Ce travail de thèse est axé sur le fonctionnement de la microflore et plus particulièrement
sur la mise en place de la communauté microbienne impliquée dans la dégradation des COV (phase
d’ acclimatation).
La caractérisation de la microflore, par l’ évaluation de la densité, de la diversité, et de
l’ activité de biodégradation, a été réalisée au sein d’ unités pilotes alimentées par des effluents
gazeux contenant onze COV (composés oxygénés, aromatiques et chlorés).
Ce travail a notamment mis en évidence que :
- la stratégie (fortes concentrations en polluants : 7,7 g.m-3) actuellement employée pour
acclimater la flore n’ est pas adaptée.
- l’ élimination des onze composés est associée à une microflore dominante hétérogène.
- lors du démarrage, le mode d’ introduction des polluants (simultané ou progressif) a peu
d’ impact sur le fonctionnement des réacteurs.
___________________________________________________________________________

Biological oxidation of gaseous effluents loaded with VOC: Ecological


approach of microbial communities
___________________________________________________________________________
ABSTRACT
Because of their impact on health and environment, the reduction of VOC emissions is of prime
necessity. Actually, many studies try to optimize the running of the biological processes
increasingly used to treat VOC emissions.
The aim of this work is to investigate the microflora functioning and more accurately the selection
of an efficient microflora (acclimatisation phase)
The microflora has been defined by monitoring the microflora density and diversity, and
the VOC removal, in laboratory-scale reactors supplied with a gaseous effluent containing
a mixture of 11 VOC (oxygenated, aromatic, halogenated compounds).
This highlighted the following points:
- The strategy (high concentrations of pollutants: 7.7 g.m-3) actually realized for the
microflora acclimatisation was not adapted.
- The removal of the compounds was associated with a heterogenic dominant microflora.
- During the start-up phase, the way of introducing VOC in the gaseous effluent (simultaneously or
progressively) had no impact on the reactors operating.
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DISCIPLINE : Ecologie Microbienne
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MOTS-CLES :
Procédé biologique, COV, diversité, fonctionnalité, résistance, résilience
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Laboratoire du Génie de l’ Environnement Industriel (LGEI)
Ecole des Mines Alès (EMA)
6, Avenue de Clavières- 30319 Alès Cedex
04-66-78-50-00 Fax : 04-66-78-50-54 http://www.ema.fr