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CC/ Mme Moulahoum A ANuP A Tech LAB 2016/2017

Mme Zerrouk F ANuP B


SPECTROPHOTOMETRIE UV-VISIBLE

Introduction
La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative et qualitative permettant la mesure
de l’absorbance ou la densité optique d’un échantillon en solution, l’absorbance est d’autant plus
importante que la concentration de l’échantillon est élevée, dans les limites de proportionnalité
énoncées par la loi de Beert Lambert.
Chaque échantillon possède une longueur d’onde d’absorption qui lui est spécifique et dont la densité
optique est lu sur un spectrophotomètre préalablement étalonné à cette même longueur d’onde.

Principe :
La capacité qu’aurait une substance donnée à absorber un faisceau de lumière monochromatique
d’intensité  « Io » traversant un trajet optique « l » de 1 cm, une partie de cette lumière est
absorbée par la substance en solution. L’intensité de lumière transmise  « I  » transmise est donc
inférieure à Io

On définit alors l’absorbance de la solution A :

On parle aussi de transmittance définie par la relation :

C’est-à-dire que
L’absorbance est une valeur positive, sans unité. Elle est d’autant plus grande que l’intensité
transmise est faible.
La relation de Beer-Lambert décrit que, à une longueur d’onde λ donnée, l’absorbance d’une
solution est proportionnelle à la concentration des espèces de la solution, et à la longueur du trajet
optique (distance sur laquelle la lumière traverse la solution). Ainsi, pour une solution limpide contenant
une seule espèce absorbante :
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DO =

 est l’absorbance ou la densité optique de la solution pour une longueur d'onde λ ;
 (en mol. l-1) est la concentration de l’espèce absorbante ;
 (en cm) est la longueur du trajet optique ;
 (en mol-1.L.cm-1) est le coefficient d’extinction molaire de l’espèce absorbante en solution. Il
rend compte de la capacité de cette espèce à absorber la lumière, à la longueur d’onde .

Les conditions d’application de cette technique : 


Les limites de validité d’application de la loi de Beert Lambert sont :
 Le domaine de mesure idéal est pour les valeurs de T situées entre 20 et 60 % ;
 Il faut un faisceau de lumière monochromatique.
 Eviter les phénomènes de réflexion et de diffraction de la lumière car peuvent fausser la
mesure.
 Les phénomènes de fluorescence ainsi que d'autres particularités chimiques liées aux espèces
absorbantes peuvent interférer.
 La concentration de la solution (une solution doit être diluée)

Plus la densité du soluté est importante, plus le faisceau de lumière incident sera réfracté avec une
valeur donnée. Ainsi, la réfraction réduit l'intensité de la lumière transmise et l'instrument indique
faussement une absorbance diminuée ou élevée. Généralement, ce phénomène peut être évité en
travaillant avec des concentrations inférieures à 0,01 mol.l-1.

Terminologie en spectrophotométrie UV-Visible :

 Groupement Auxochrome : groupement saturés lié à un chrome modifiant la longueur d’onde et


l’intensité de l’absorption. Exp : OH, NH2, Cl…..
 Effet bathochrome : déplacent les bandes vers les grandes longueurs d’ondes.
 Effet hypsochrome : déplacent les bandes vers les petites longueurs d’ondes.
 Effet hyperchrome : augmentation de l’intensité d’absorption, il permet de détecter la longueur d’onde
permettant le maximum d’absorption du soluté et donc un moyen de l’identifier
 Effet hypochrome : diminution de l’intensité d’absorption

Ces effets sont illustrés sur la figure suivante :

Dosages (= applications de la loi de Beer-Lambert) : Deux cas sont possibles :


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1/- La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (substance
colorée) ou dans l'UV (substance incolore) ; on fait alors un dosage direct.
2/- La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique; il faut alors effectuer
une réaction colorée; on fait alors un dosage indirect.

Substance incolore + réactifs de coloration produit coloré

Les conditions d'une bonne méthode de dosage sont les suivantes :

-Spécificité : la réaction colorée doit être spécifique de la substance à doser (qui doit être seule à
réagir avec les réactifs de coloration)

-Solubilité : le produit coloré obtenu doit être soluble; la solution doit être limpide pour permettre une
lecture en spectrophotométrie d'absorption.

-Stabilité : la coloration doit être stable pendant un certain temps, pour permettre d'effectuer les
lectures sans que la coloration n'évolue; généralement il faut une certaine durée de développement de
la coloration pour qu'elle soit stable.

- Proportionnalité : l'intensité de la coloration obtenue (son absorbance) doit être proportionnelle à la


quantité de substance à doser présente; cela nécessite de mettre les réactifs de coloration en excès
(pour que la réaction colorée soit totale), et éventuellement de diluer la solution à doser (pour être
dans les conditions de validité de la loi de Beer-Lambert).

-sensibilité : la réaction colorée doit être sensible, pour permettre de doser des solutions de faibles
concentrations.

Méthode directe
• elle consiste à mesurer A et à calculer C.
• elle nécessite de connaître le ε de la substance à doser à la longueur d'onde choisie, et de bien caler
le monochromateur, car ε varie avec λ.

Méthodes indirectes : elles ne nécessitent pas de connaître ε


a/- Méthode par comparaison avec un étalon unique:
- elle consiste à mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance A sol de la solution à doser et
l'absorbance Aetalon d'une solution "étalon" ou "standard» de concentration connue Cétalon, puis à calculer
la concentration de la solution à doser Csolution
- elle suppose mais ne vérifie pas la linéarité.

b/- Méthode avec une gamme d'étalonnage :

Elle consiste à préparer une gamme de dilutions d'une solution étalon "mère" connue, à mesurer
l'absorbance de chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer la courbe d'étalonnage A = f(c).
L'absorbance de la solution à doser est mesurée dans les mêmes conditions, puis reportée sur la courbe
d'étalonnage; on fait ainsi une détermination graphique de la concentration de la solution à doser (la
gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser);
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Elle permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles erreurs de manipulation
(tracé d'une droite statistique).

Technique expérimentale :
a/- appareillage
*** Un spectrophotomètre double faisceau UV-Visible, il est composé de :
- Une source  : de lumière permettant de fournir les radiations lumineuse
- Un monochromateur  : a pour rôle de disperser le rayonnement polychromatique de la lumière et
d’obtenir un faisceau monochromatique
- Un diviseur de faisceau ou photomètre et un détecteur

*** la cuve de lecture

Elle peut être en verre, en plastique ou encore en quartz elle fait 1 cm de trajet optique
Le verre est utilisé pour des lecture dans le visible uniquement alors que le quartz est utilisé dans l’UV-
Visible
b/- Echantillon :
Les composées peuvent être dans divers états physiques (gazeux, liquide, solide….) mais les spectres
sont généralement enregistrés à partir de solutions diluées.
c/-Solvants :
Ils doivent être choisit de telle sorte à dissoudre le soluté à analyser et être transparent (aucune
capacité d’absorption)
Application de la spectrophotomètre UV-Visible
C’est une technique quantitative et au même temps elle est qualitative :
*** Etude qualitative : Le spectre UV-Visible ne peut identifier mais elle peut identifier celle du
groupement chromophore qu’il contient.
*** Etude quantitative: Cette analyse (UV-Visible) est très souvent utilisée grâce à la loi de Beert
Lambert, et ces mesures ont des applications dans plusieurs domaines :
** En laboratoire :
 Suivit de la cinétique d’une réaction
 Mesures des constantes de dissociation d’acides et bases ou autres constantes
 Détermination de la composition d’un mélange (benzène dans le cyclohexane)
** Police scientifique
** Expertise judiciaire
** Environnement : métaux lourds, ozone dans l’air, phénols dans l’eau, matière organiques, matières en
suspension, nitrates de l’eau.
** Mesure des couleurs
** En agroalimentaire
** Pharmacie : dosage du fer dans un médicament
** Parfums et cosmétiques, les crèmes solaires
** un large domaine d’application. (Chimie générale organique, chimie minérale, organique, biochimique)
** grande sensibilité (limite de détection de 105M

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