BIOLOGIA MOLECULAR Y DNA RECOMBINANTE

NR 2007

ANALISIS DE GENES NORMALES Y MUTADOS

COMPRENSION DE PROCESOS MOLECULARES

• BASES PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES GENETICAS .

2001
2001 El Genoma humano
30.000 genes 3.000.000.000 pb
Portada del ejemplar de Science

30.000 genes 3.000.000.000 pb

Contenido de DNA y número aproximado de genes en algunos genomas .

ANALISIS DE GENES Se requiere: • Aislar secuencias de DNA Obtener múltiples copias de ellos TECNICAS • • • Clonamiento Molecular PCR (reacción en cadena de la polimerasa) .

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped • • • .

CLONAMIENTO Enzimas de restricción DNA Ligasa Vector Célula huésped .

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS • • • • Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped * .

Enzimas de Restricción .

DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Page 103 Sitio de corte .

ENZIMAS de RESTRICCION Sitios de corte restricción Sitio de corte de enzimas dede endonucleasas de restricción ES Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima .

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • • • Vectores DNA ligasa Células huésped .

Características básicas de un vector de clonamiento • • • Origen de replicación autónomo Gen marcador de selección Sitios únicos de restricción .

coli Origen de replicación Región de inserción de DNA Exógeno codifica proteína de resistencia a ampicilina Caja de clonaje multiple .Componentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.

¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ? 1ª división celular 2ª división celular .

TIPOS DE VECTORES kpb inserto Plasmidios bacteriofagos BACS YACS 3-5 15 300 2000 .

CLONAMIENTO EN PLASMIDIO Sitio de corte DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII EcoRI PvuII Sitio de corte Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII .

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS • • Enzimas de restricción Vectores • • DNA ligasa Células huésped .

Unión de fragmentos de restricción que poseen extremos cohesivos Fragmentos de DNA genómico a b + c .

PROPAGACION EN CELULA HUESPED .

CLONES contienen diferentes fragmentos del genoma .

Identificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADAS .

DESNATURALIZACION DEL DNA .

HIBRIDIZACION Tipos de Sondas :   Secuencia específica de DNA Oligonucleótidos .

Identificación de genes en una genoteca Placa de agar con células transformadas Transferencia a papel de nitrocelulosa .

Ruptura de la célula por tratamiento con alcali y denaturación del DNA .

INCUBACION CON SONDA RADIACTIVA .

Banco de datos • secuencia de la proteína .Diseño de sondas A partir de: • secuencia del gen homólogo en otras especies.

Diseño de sondas a partir de una secuencia de aminoácidos .

CLONES contienen diferentes fragmentos del genoma .

2. Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción Clonamiento de fragmentos en vectores .Genoteca de DNA genómico Obtención : 1.

Genoteca de cDNA Obtención :  Clonamiento de cDNA obtenido mediante transcripción reversa de mRNA total. .

Obtención de cDNA: Transcripcion reversa .

Características y usos • • genoteca de DNA genómico genoteca de cDNA .

ANALISIS DE GENES Requiere: • Aislar secuencias de DNA Obtener múltiples copias de ellos TECNICAS • • • Clonamiento Molecular PCR (reacción en cadena de la polimerasa) .

AMPLIFICACION DE DNA MEDIANTE TECNICA DE PCR • • • • DNA molde dNTP partidores Taq polimerasa .

PCR .

CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR .

ANALISIS DE GENES  SECUENCIACION DEL DNA  HIBRIDIZACION .

FUNDAMENTO Las Cadenas Polinucleotídicas crecen por Adición de nucleótidos al Extremo 3´ OH .

SECUENCIACION DEL DNA METODO ENZIMATICO .

SECUENCIACION DEL DNA .

TECNICAS BASADAS EN HIBRIDIZACION DE ION DE ACIDOS NUCLEICOS Southern Blot Northern Blot Microarrays .

HIBRIDIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS TECNICA DE SOUTHERN .

Estudio de expresión diferencial de genes mediante microarrays .

Vectores de expresión .

Vector de expresión en bacterias .

Expresión de proteínas en bacterias

cDNA clonado Vector de expresión

Inicio de la transcripción
ATG

cDNA

Represor lac

IPTG

RNA
Proteina

DNA RECOMBINANTE EN MEDICINA

ANTICOAGULANTES FACTORES SANGUINEOS ERITROPOYETINA FACTORES DE CRECIMIENTO HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA INSULINA HUMANA INTERFERONES INTERLEUKINAS ANTICUERPOS MONOCLONALES VACUNAS

FUNCIÓN DE UN GEN
Herramientas de Estudio:

1. Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce. 2. Animales transgénicos y knock out.

Sobrexpresión de un gen Técnica de Microinyección Transgen Microinyección del gen en huevo fertilizado .

cDNA del gen La construcción linearizada es inyectada en el pronúcleo masculino .EXPRESION DE DNA EXOGENO Promotor Transgen.

EJEMPLO .

when fed with extra zinc. and the technique paves the way for a wave of genetic analysis using transgenic mice. Ejemplos  Sobrexpresión del gen de hormona de crecimiento Ratones knock out para el gen OB OB gen que codifica para la leptina Ob (+/+) Ob (-/-) . grow to be huge. and inject it into fertilized mouse embryos. The resulting mice.1982 First transgenic mouse • A team led by Richard Palmiter and Ralph Brinster fuse elements of a gene that can be regulated by dietary zinc to a rat growthhormone gene.

RATONES KNOCK OUT PARA EL GEN OB OB gen que codifica para la leptina Ob (+/+) Ob (-/-) Obesidad causada por deficiencia en la producción de leptina. codificada por el gen OB .

manipular o suplementar genes no funcionales en una célula mediante la introducción de genes normales .Terapia génica Procedimiento que consiste en reemplazar .

Terapia génica .

Terapia génica .

APLICACIÓN DE TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR   MEDICINA FORENSE DIAGNOSTICO GENETICO MOLECULAR .

.Prueba de paternidad mediante el análisis de polimorfismos en el DNA La posibilidad de que cualesquiera personas puedan t ener la misma “ huella”de DNA es de 1 ent re 10.000-30.000 millones.

IDENTIFICACION FORENSE .

.

DIAGNOSTICO GENETICO MOLECULAR Anemia falciforme Gen normal cctgAgg Gen mutado cctgTgg Detección de la mutación que causa anemia falciforme mediante digestión con la enzima Mst II que reconoce secuencia cctgagg. Dicha diana se pierde con la mutación que causa anemia falciforme al pasar a ser (cctgtgg) . Secuencia normal del gen de la _ -globina en los codones 5. 6 y 7 (cct gag gag) incluye la diana para el enzima Mst II (cctgagg).

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