UNIVERSITE DES ANTILLES ET DE LA GUYANE NOM :

UFR SCIENCES EXACTES ET NATURELLES

PRENOM :
Licence STS - Mention BGS - UEP 1.3 Nom :
Enzymologie Plier le coin Prénom :
Examen – semestre 3
Janvier 2007 – 1h30

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1 - Etude de la phosphatase alcaline

A – (25 mn – 5 points) On mesure la vitesse initiale de la réaction catalysée par les

phosphatases alcalines contenues dans un échantillon de sérum. Deux substrats sont utilisés,
le 2glycérophosphate et le nitro-4-phényl-phosphate. Les vitesses initiales de transformation
des substrats en fonction de concentration différentes de substrats sont les suivantes :

Vitesses initiales en µmole.mn-1

Concentrations en 2-glycérophosphate nitro-4-phényl-phosphate

mole.l-1 1/S 1/V 1/V

1.25 10-4 0.8104 0.083 10-3 12 10 3

0.100 10 -3
10 103
2.50 10-4 0.4104 0.105 10-3 9.5103 0.160 10-3 6 103
-4 4
5.00 10 0.210 0.120 10-3 8.3103 0.250 10-3 4 103

Déterminer pour ce sérum les Km apparents des phosphatases alcalines pour chacun des deux
substrats. Justifier pour quel substrat l’affinité des phosphatases alcalines est la plus forte.
Répondre sur la courbe.

B – (10 mn – 3 points) On recommence la mesure des vitesses initiales en fonction de la

concentration en nitro-4-phényl-phosphate en rajoutant dans chaque tube une quantité
identique de 2-glycérophosphate. Les résultats obtenus sont représentés suivant le tracé de
Lineweaver-Burk (voir ci-dessous). Quel est l’effet du 2-glycérophosphate sur la cinétique de
transformation du nitro-4-phényl-phosphate ? Argumenter la réponse.
 Réponse :
1/v
µmole- Avec 2
1 Le 2-glycérophosphate est un inhibiteur
.mn glycérophosphate
compétitif du nitro-4-phényl-phosphate pour les
phosphatases.
En effet en présence de 2-glycérophosphate, la
Sans glycérophosphate cinétique du nitro-4-phényl-phosphate par les
phosphatases montre :
Le Vmax reste inchangé
Le Km augmente.
104 mole-

1/[S] Nitro-4-phényl-

2 – ( 30 mn - 6 points) Activité molaire spécifique

Soit 5 ml de β-galactosidase de concentration 0,2 mg par ml qui hydrolysent en 10 mn 0.8 g de

lactose à pH 8 et à 25°C. On donne M β-galactosidase = 135000. On suppose la masse molaire de
lactose connue.

Calculer l’activité en :

µmoles/mn/ml En déduire AS en UI/mg

MM lactose = (180X2)-18 = 342
0.8 x106
6
0.8 x10 342 x10 x5 x 0.2 = 234
342 x10 x5 = 46.8 1
1
moles/s/ml En déduire Activité spécifique en kat /mg
0.8
342 x10 x5 x60 = 0.78 10-6 0.8
342 x10 x5 x60 x0.2 = 3.9 10-6
1 1
moles/s/mole En déduire Activité molaire spécifique (AMS)
en kat/mole (soit en s-1)
0.8 x 103 x 135000
342 x10 x5 x60 x0.2 = 526 526

1 1

3 – (20 mn - 5 points) Dosage enzymatique du galactose par la galactose déshydrogénase

La galactose déshydrogénase oxyde le D-galactose en D-galactonolactone. La formation du

cofacteur réduit NADH+H+ est suivie par spectrophotométrie.

Ecrire la réaction (les formules chimiques ne sont pas demandées)

galactose déshydrogénase

D-galactose + NAD+ _______________ D-galactonolactone + NADH2

.5
D’après les courbes d’absorption du cofacteur sous forme réduite ou oxydée ci-dessous, qu’elle
est la longueur d’onde choisie pour faire le dosage. Justifier la réponse.

Réponse :
A Forme réduite
Forme oxydée

Seul le NADH2 absorbe à 340 nm, cette longueur d’onde permet donc de
suivre la formation du NADH2
Une mole de NADH2 formée correspond à une mole de galactose
transformée

260 nm 340 nm λ

Le dosage du galactose urinaire d’un patient est réalisé comme suit :

Dans une cuve de spectrophotomètre de trajet optique de 1cm on dépose :
3 ml de tampon triéthanolamine à pH 7.5, 0.1 ml de solution contenant le NAD+, 0.2 ml d’urine
préalablement diluée au 1/10. On homogénéise, l’absorbance lue est : A1 = 0.15
Puis on dépose 0.02 ml de galactose déshydrogénase, on homogénéise, on laisse agit 20 mn
L’absorbance lue est alors A2 = 0.65
A la longueur d’onde choisie, le coefficient d’extinction molaire est de 6.3 103 mole-1.l.cm-1

Que représente la lecture A1 ? 0.2

Représente le témoin avant la transformation du galactose, l’enzyme étant absent

Que se passe-t-il quand on ajoute 0.02 ml de galactose déshydrogénase ? 0.3

Le galactose est transformé, le NADH2 apparaît.

En déduire :
La concentration en galactose dans le cuve : 1

C Tube = (0.65 – 0.15) / 1 x 6, 3 103 = 7.9 10-5 mole / l

La concentration en galactose de l’échantillon déposé (0.2 ml d’urine diluée au 1/10)

C Echantillon déposé = (0.65 – 0.15) x 3.32 / 0.2 x 1 x 6, 3 103 = 1.32 10-3 mole / l
1
La concentration en galactose dans l’urine du patient

C Urine = (0.65 – 0.15) x 3.32 / 0.2 x 1 x 6, 3 103 = 1.32 10-2 mole / l

4 – Définitions (5 mn – 1 point)

Qu’appelle-t-on cofacteurs vrais et cofacteurs prosthétiques ? 0.6

Donner un exemple pour chacun. 0.4
Un cofacteur vrai est un cofacteur qui s’associe à l’enzyme au moment de la réaction et qui s’en
détache après la réaction
Exemple le couple NAD+ /NADH2
Un cofacteur prosthétique est un cofacteur qui reste toujours fixé sur l’enzyme
Exemple l’hème de l’hémoglobine