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Université de Mostaganem

Abdelhamid Ibn Badis


Faculté des SNV
Département de Biologie
L3 Biochimie

LES BANQUES D’ADN

Assuré par : Dr. DAHMANI C.A


Plan des cours
• Chapitre I
• Chapitre VI
Rappel sur les bases du Séquençage
génie génétique. Les banques génomiques
• Chapitre II Les banques d’ADNc
Introduction au génie PCR
génétique • Chapitre VII
• Chapitre III Hybridation moléculaire
Sondes et marquage d’ADN.
Outils enzymatique du génie
• Chapitre VIII
génétique.
Applications biotechnologiques
• Chapitre IV de l’ADN recombinant.
Cartes et enzymes de
restriction
• Chapitre V
Clonage moléculaire.
Les banques d’ADN

 Une banque d’ADN est un ensemble de grands fragments d’ADN

d’un génome d’intérêt qui sont clonés dans un vecteur réplicatif et

introduit dans une cellule hôte facile à répliquer


Les banques d’ADN

• Les séquences de gènes sont organisées dans le génome de manière


aléatoire et la sélection ou l’isolement d’un gène est une tâche
laborieuse, en particulier lorsque les séquences génomiques ne
sont pas connues.
• Une petite partie du génome est transcrite pour donner l'ARNm
alors qu'une partie importante est non transcrite dite non codante.
Les banques d’ADN

 Il existe deux manières de représenter une information de


séquence génomique sous la forme d'une bibliothèque (banque) :

 Les banques d’ADN génomique

 Les banques d’ADN complémentaire


Banques d’ADN génomiques

• Les banques créées à partir de l’ADN génomique purifié des


différents types cellulaires sont strictement identiques.
Banques d’ADN génomiques
Procédure ?

• Extraction de l’ADN génomique total à partir d’un tissu de l’organisme d’intérêt


• Digestion partielle de l’ADN de haut poids moléculaire
• Sélection des fragments d'ADN de 100 à 250kb
• Ligation dans un système de vecteur approprié tel que BAC et YAC
• Transformation des cellules hôtes appropriées.
• Organisation des clones en microplaques en utilisant une station robotique à haut
débit
• Contrôle qualité et caractérisation de la bibliothèque
Banques d’ADN génomiques
Procédure ?
Banques d’ADN génomiques
Procédure ?
Banques d’ADN génomiques
Procédure ?

• Extraction de l’ADN génomique total à partir d’un tissu de l’organisme d’intérêt


• Digestion partielle de l’ADN de haut poids moléculaire
• Sélection des fragments d'ADN de 100 à 250kb
• Ligation dans un système de vecteur approprié tel que BAC et YAC
• Transformation des cellules hôtes appropriées.
• Organisation des clones en microplaques en utilisant une station robotique à haut
débit
• Contrôle qualité et caractérisation de la bibliothèque
Banques d’ADN complémentaire

• L’ARN est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou


d’organismes entiers.
Banques d’ADN complémentaire
Banques d’ADN complémentaire
Procédure ?

 La construction de la bibliothèque d’ADNc implique les étapes


suivantes :
1. Extraction de l'ARNm
2. Synthèse des brins d'ADNc
3. Incorporation d'ADNc dans un vecteur
4. Clonage d'ADNc
Banques d’ADN complémentaire
Procédure ?

1. Extraction de l'ARNm
• Préparation des ARNm à partir d’un type cellulaire spécialisé, tel
que les graines en développement, les érythrocytes, les cellules β
du pancréas, etc.
• Les extrémités 3‘ de l'ARNm eucaryote consistent en une queue
polyA, ce qui facilite la séparation des ARNr et des ARNt en
utilisant une colonne contenant des oligo-dT.
Banques d’ADN complémentaire
Banques d’ADN complémentaire
Banques d’ADN complémentaire
Comparaison ?
Banques d’ADN complémentaire
Que trouve t’on ?

• Pour un organisme donné (l’homme) l’ADN contenu dans la


banque d’ADNc sera dépendant du choix de la cellule d’origine
(ex musculaire ou nerveuse).
• Les banques d’ADN complémentaire ne contiennent que les gènes
exprimés dans la cellule choisie pour la construction de la banque.
Comparaison entre banques d’ADN
génomique et complémentaire ?
Le séquençage de l’ADN
Séquençage de l’ADN ?

• Le séquençage de l’ADN est la détermination de la succession des


nucléotides le composant.
• C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de
biologie.
•Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis
une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN.
Séquençage de Sanger ?

• Lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP, elle n'est plus


capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse
du brin d'ADN s'arrête.
Séquençage de Sanger ?
Protocol ?

Du coup, il faut préparer 4 mélanges contenant :


 Le fragment qui doit être séquencé (ADN)
 Un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à
l'extrémité 3' du fragment à séquencer (oligonucléotides)
 Les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP,dTTP)
 L'ADN polymérase (séquenase)
Séquençage de Sanger ?
Protocol ?
Séquençage de Sanger ?
Protocol ?

Du coup, il faut préparer 4 mélanges contenant :


 Le fragment qui doit être séquencé
 Un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à
l'extrémité 3' du fragment à séquencer
 Les 4 dNTP's
 L'ADN polymérase (séquenase)
 Dans chaque tube, de petites quantités d'un ddNTP
Séquençage de Sanger ?
Protocol ?
Séquençage de Sanger ?
Protocol ?

• On obtient à la fin des réactions un ensemble de brins


d'ADN de tailles variées, selon l'endroit où un ddNTP se
sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée.
Séquençage de Sanger ?
Protocol ?

NB:
La synthèse du brin
complémentaire, donc si
arrêt par un ddGTP,
c’est qu’il s’agit d’une
cytosine sur la séquence.
Séquençage de Sanger ?
Lecture ?
Séquençage automatique ?

• Capables de réaliser les réactions de séquence puis de faire la


lecture.
• Une fois la réaction de séquence terminée, la taille des fragments
obtenus est déterminée par une chromatographie.
• Le séquenceur détecte la fluorescence sortant des colonnes de
chromatographie, repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille
précise
Séquençage automatique
Exemple d’un enregistrement de lecture