12/11/2009

Analiza genelor

ADN ARN Proteine

Tehnologii ADN
Tehnologii Secvenţiere
PCR
Northern-blot
RT–PCR
Western-blot
Secvenţiere

recombinant Southern-blot

Hibridare in situ
Hibridare in situ Analiza funcţiei

Analiza
histochimică

Utilizarea tehnicilor de Izolarea acizilor nucleici

analiză a acizilor nucleici Izolarea ADN
• Colectarea materialului biologic (celule nucleate din
Analiza ADN:
orice ţesut)
depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al
• Izolarea nucleilor (opţional) prin lezarea celulelor în
bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);
soluţii hipotonice
identificarea polimorfismului individual →
• Lezarea celulelor (nucleilor) prin acţiunea detergenţilor
dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei);
depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul • Deproteinizarea: prin acţiunea proteazelor, urmată de
bolilor infecţioase şi gradului de infectare. prelucrarea cu solvenţi organici (fenol, cloroform)
Analiza ARNm:
• Precipitarea acizilor nucleici în prezenţa alcoolilor şi a
analiza expresiei genice ţesut-specifică; sărurilor (70% etanol)
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.

Izolarea ARNm
•Colectarea materialului din ţesutul de interes la stadia de
interes

•Lezarea celulelor în prezenţa detergenţilor şi a inhibitorilor ADN

de ARN-aze ADN recombinant – recombinant
moleculă de ADN obţinută
•Deproteinizarea cu utilizarea solvenţilor organici
din segmente de origine
•Precipitarea selectivă a ARN în prezenţa sărurilor (LiCl, diferită, capabilă să
CH3COONa) funcţioneze

•Precipitarea ARN în prezenţa alcoolului.

1
 12/11/2009

Scopul tehnologiei ADN rec Etapele obţinerii ADN recombinant

1. Izolarea ADN de cercetat şi a vectorilor de clonare
Clonarea genei/secvenţei de interes cu scop de: 2. Clivare enzimatică a ADN de cercetat şi vectorului
de clonare
multiplicare;
3. Ligarea fragmentului de ADN de interes cu vectorul
izolare şi formare a bibliotecilor de ADNrec; de clonare – obţinerea ADN recombinant
analiză moleculară.
4. Introducerea ADN recombinant într-o gazdă de
clonare - transformare
Expresia genică cu scop de:
5. Clonarea genei de intres prin replicarea vectorului
analiză a funcţiei genei clonate;
obţinerea produsului proteic. 6. Expresia genei de intres prin sinteza proteinei
7. Selecţia celulelor transformate prin tratare cu
antibiotice şi utilizînd marcherei radioactivi sau
fluorescenţi

Etape necesare pentru manipularea Componentele necesare pentru

ACIZILOR NUCLEICI tehnologia AND rec = clonarea ADN in vivo
vivo::
- Cum se izolează ADN sau ARN dintr-o celulă?
- Cum se obţin fragmente de ADN de cercetat?
- FR (ER, SR, RFLPs, hărţi de restricţie) -ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc
- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm); -Vector de clonare:
- Cum se separă fragmentele de AN şi cum se apreciază
lungimea → comparare a ADN la diferite persoane
- mol ADN capabilă să insereze ADN străin
- să transfere ADN de clonat într-o cel
(electroforeza AN)?;
- să se replice independent de replicarea ADN cel gazdă
- Cum se vizualizează ADN, având dimensiuni
submicroscopice? - Enzime de restricţie = restrictaze
- Principiile clonării ADN in vivo (vectori de clonare,
gazde de clonare) şi clonării ADN in vitro; - Gazdă de clonare compatibilă cu vectorul
- Denaturarea ADN in vitro
- Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN) - Sistem de selecţie a clonelor analizate
- Set de enzime pentru manipularea ADN

Dimensiunile inserţiilor clonate în diferiţi

vectori
Vectorul Dimensiunile fragmentului
inserat
Gazda de
clonare
Celula bacteriană
Plasmide Până la 10 kb (ADN Bacterii,
genomic, ADNc) Drojdii
Bacteriofagi Până la 25 kb (ADN Bacterii
genomic, ADNc)
Cosmide 30-45 kb (ADN genomic) Bacterii

BAC (Cromozom artificial Până la 300 kb (ADN Bacterii

al bacteriilor) genomic)
YAC (Cromozom artificial 0,2-2.0 Mb (ADN genomic) Drojdii
al drojdiilor)

Vectorul:
-se replică autonom în celula gazdă (conţine punct ori)
-are capacitate să insereze şi să transfere ADN străin (conţine situsuri de
restricţie)
-conţine gene de rezistenţă la antibiotice (capacitate de a fi selectate)

2
 12/11/2009

Ligarea inserţiilor în vector

Cromozom artificial
Vector plasmidic al drojdiilor (YAC)

Obţinerea
Ob ţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)

Situsuri recunoscute de enzime de restricţie

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z

3
 12/11/2009

-
ER – edonuclează situs specifică de origine bacteriană 12 kb
care recunoaşte un SR şi clivează ADN bicatenar
10 kb 10 kb
SR – secvenţă palindromică de nucleotide, recunoscută
şi clivată de enzimele de restricţie 8 kb

FR – fragment ADN bicatenar obţinut prin clivare cu 2,5 kb

6 kb 6 kb
ajutorul restrictazelor 5 kb
10 kb

6 kb 4 kb
RFLPs – Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de 5 kb
Restricţie, ce identifică diferenţele individuale ale 2,5 kb
2 kb
moleculelor de ADN
+
Hărţi de restricţie – dispunerea relativă a situsurilor de M
restricţie într-o moleculă de ADN

Vizualizarea ADN

Colorarea specifică Vizualizare cu sonde marcate

Fuxnă bazică Fluorescente Radioactive

(in situ) (reci) (calde)

Bromură de
etidiu
(În geluri)
Este necesar de ştiut

Sunt necesare structura secvenţei

cantităţi mari de ADN ADN de cercetat

Clonarea in vivo, într-o cel

Etapele obţinerii ADNc (ADN
bactreriană, a unei gene
complementar)
umane
Probleme: •Izolarea ARN+ poli(A)
 Genele umane sunt mari;
 Conţin secvenţe •Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)
reglatoare diferite de cele
a bacteriilor; •Sinteza ADNc cu ajutorul
 Conţin introni ce nu pot fi revertazei
înlăturaţi ce celula
bacteriană. •Hidroliza ARN

•Sinteza ADN bicatenar cu

ajutorul ADN-polimerazei
Soluţie:
Obţinerea unui ADNc pe baza
ARNm caracteristic genei
ţintă

4
 12/11/2009

Rolul practic al tehnicilor de analiză a

acizilor nucleici:

1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de Molecule de ADN

gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor. Amplificare ADN (clonare) Analizã molecularã
2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii - prenatal
sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu Clonare in vivo Clonare in vitro (PCR) Hibridizare molecularã
anomalii genetice sau manifestării unor patologii severe.
3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea
vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în
diagnosticul bolilor infecţioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza
filiaţiei, în criminalistică.

Clonarea ADN
= multiplicarea unei mol ADN prin replicare
repetată
In vivo
 Tehnologia ADN rec
 Utilizarea celulei –
gazdă de clonare
 Replicarea într-un
vector de clonare cu
utilizarea aparatului
de replicare a celulei
gazdă
 Cu posibilitatea
obţinerii produsului
proteic
Clonarea in vitro – PCR
(reacţia ciclică de polimerizare a
In vitro noilor copii de ADN)
• Tehnica PCR
• Este relizată în
eprubetă
• Replicarea unei
secvenţe de interes
cu ajutorul unui
aparat de replicare
artificial

Componentele necesare pentru

clonarea in vitro (PCR):
Etapele tehnicii PCR
- ADN de cercetat A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
- Primeri specifici secvenţei de clonat – B. Repetarea automată a procedurelor de denaturare-
complimentari secvenţelor flancante renaturare-elongare de 30-35 ori
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă •Denaturarea ADN la 96oC
•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
- Dezoxinucleozidtrifosfaţi (dNTP) •Elongarea catenelor ADN la 72oC
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii: C. Analiza produşilor PCR
- electroforeza
- tº de denaturare ADN - colorarea
- tº de renaturare (ADN+primer) - interpretarea rezultatelor
- tº de polimerizare (elongarea catenelor
noi de ADN)

5
 12/11/2009

Biblioteci de gene
•Biblioteci genomice – conţin secvenţe de ADN
genomic, obţinut prin digestie enzimatică

•Biblioteci ADNc – conţin secvenţe de ADNc,

obţinute în baza setului de ARNm

•Biblioteci cromozomiale – conţin secvenţe

caracteristice unui cromozom

Etapele obţinerii Etapele obţinerii bibliotecii ADNc

bibliotecii genomice
•Izolarea ARNm
•Izolarea ADN genomic
•Sinteza ADNc
•Restricţia ADN genomic
şi vectorial •Ligarea linkerilor
la capetele ADNc
•Ligarea ADN vectorial cu
fragmente ADN genomic •Restricţia ADNc şi
a vectorului
•Introducerea moleculelor •Ligarea ADNc -
recombinate în gazdă vector
•Selecţia clonelor •Transformarea
gazdei potrivite
•Selecţia clonelor