Université Larbi Ben Mhidi Oum El Bouaghi

M2 Biochimie appliquée

Contrôle techniques d’analyse en biologie moléculaire:

Nom :…………………………….Prénom :………………………………………..G :…….

Durée : 1h 30

Exercice 1: Un plasmide circulaire possède un site de coupure par l’enzyme XhoI et deux
sites de coupures pour l’enzyme SmaI. Ces deux sites pour l’enzyme SmaI sont situés de part
et d’autre du site XhoI, à égale distance de ce site. Lorsque vous effectuez une électrophorèse
sur gel d’agarose de l’ADN de ce plasmide digéré par l’enzyme XhoI ou par SmaI en présence
de bromure d’éthidium, on estime la taille des fragments obtenus à 3 kb ou à 1.5 kb
respectivement. Lorsque vous effectuez la double digestion XhoI et SmaI, la somme des
fragments obtenus fait 2.25 kb. Tracer la carte de restriction de ce plasmide en positionnant
les sites XhoI et SmaI.

Exercice 2 : Le séquençage d'un ADN monobrin est effectué par la technique de Sanger, avec
une amorce sens. En examinant le schéma représentant une partie de l'autoradiogramme du
gel de migration, écrire :

- la séquence nucléotidique lue directement sur ce schéma du film.

- la séquence réelle du segment d'ADN monobrin correspondant.

Exercice 3 : Un laboratoire hospitalier spécialisé dans l'étude et le diagnostic moléculaire de

maladies génétiques humaines graves a identifié, par la méthode de séquençage de Sanger,
une lésion génomique potentiellement associée à une maladie héréditaire monogénique
(transmission mendélienne autosomique récessive). L’identification de cette lésion découle
d’une analyse comparative des profils de séquençage (et des séquences déduites) d’un gène
lorsque ce séquençage est effectué à partir d’un ADN génomique extrait de cellules diploïdes
prélevées chez des individus sains (N/N ou N/M) ou malade (M/M). Les profils de
séquençage (et les séquences déduites orientées 5’->3’) dans la région génique où siège la
lésion sont les suivants pour des individus homozygotes sain ou malade:

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Dr Karouche Bon courage
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On vous demande de mettre au point un test PCR qui permettrait de mettre en évidence cette
mutation sur le génome humain, suite à l'amplification génique des 1200pb que compose le
gène à l’aide d’un couple d’amorces qui s'hybrideraient aux extrémités du gène dont les
séquences sont indiquées ci-dessous:
5’-CTACATGCATCATACGCGAC-----------------------AGTCAGTAACCGATGGAATA-3’
3’-GATGTACGTAGTATGCGCTG------------------------ TCAGTCATTGGCTACCTTAT-5’
1- Donnez la séquence des 2 amorces qui permettront d’amplifier ce gène par PCR entre ses 2
extrémités ?
2 À quelle température réglerez-vous l'étape d'hybridation du programme PCR afin
d’amplifier le plus spécifiquement possible ce gène (justifier votre réponse) ?
Exercice 4 : On vous charge de cloner un gène qui possède deux extrémités cohésives (EcoRI
et XhoI), dans un vecteur plasmidique (schématisé ci-dessous). Pour ce faire, le vecteur a été
préalablement digéré au niveau du site de clonage multiple (SCM) par EcoRI/XhoI (les sites
de restriction EcoRI et XhoI sont G/AATTC et C/TCGAG, respectivement). Ce plasmide
possède également le gène lacZa (dans lequel est inséré le SCM), une région promotrice (p) et
une région opératrice (o) situées en amont du gène lacZa, un gène de résistance à l’ampicilline
(AmpR) et une origine de réplication (ori).

Suite à la ligature de cet ADN au vecteur, vous effectuez l’étape de transformation dans une
souche appropriée d’Escherichia coli (de génotype lac- et dans laquelle est présent un
plasmide qui porte le gène lacI). Vous effectuez ensuite une culture liquide des bactéries
pendant une heure à 37°C. Enfin, ces bactéries sont cultivées, pendant 1 nuit à 37°C, sur
milieu solide LB dans une boîte de pétri contenant de l’ampicilline, de l’X-gal et de l’IPTG.
Le lendemain matin, vous observez des colonies bactériennes bleues (90) ou blanches (10) sur
votre boite. Une même quantité de bactéries cultivées sur milieu solide LB dans une boîte de
pétri ne contenant aucun de ces réactifs indique la présence d'un million de clones bactériens.
1- Schématiser la région de clonage EcoRI/XhoI du vecteur recombinant: pour chacun des
sites de restriction, indiquez en lettres majuscules les bases issues du vecteur et en minuscules
celles issues de l'ADN cloné.
2- Expliquez, en vous aidant de schémas, le principe de la sélection colorimétrique des
bactéries qui ont intégré un vecteur recombinant (indiquer à quoi correspondent les deux
phénotypes observés, le rôle de l’ampicilline, de l’IPTG et de l’Xgal).
3- Pourquoi n’avez-vous pas fait une culture des bactéries sur milieu solide
LB/Amp/Xgal/IPTG, immédiatement après l’étape de transformation ?
4- Quelles sont les efficacités de la transformation et de la ligature dans votre expérience de
clonage? Le pourcentage de bactéries avec vecteur recombinant est-il suffisant ?

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Dr Karouche Bon courage
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Question :
a- Citer les applications de l’electrophorese ?
b- Expliquer la nomenclature des enzymes de restriction suivants : Eco RI et TaqI ? et quelle
est le type de la coupure réalisée par ces deux enzymes ?
c- Definir la notion d’isoschizomères ?
d- Quelles sont les inconvénients d’utiliser l’E.coli comme cellule hôte dans le clonage ?
e- Donnez le nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme procaryote couramment
utilisé au laboratoire comme hôte d’expression.
f- Donnez également le nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme eucaryote
unicellulaire couramment utilisé au laboratoire ou dans l’industrie.
g- La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région
spécifique d'un acide nucléique donné, pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut
agir en trois étapes. Expliquer ?
h- Définir précisément le rôle des quatre parties du vecteur indiquées par les flèches dans la
figure ci-dessous ?

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Corrigé type :

a- Applications de l’électrophorèse : (0.75pts)

 Séparation de fragments ADN digérés (0.25pts)

 Estimation du poids moléculaire de fragment d'ADN après une digestion par des
enzymes de restriction (0.25pts)
 Analyse d'ADN après une amplification par PCR (0.25pts)

b- la nomenclature des enzymes de restriction suivants : Eco RI l’ordre de caractérisation

(type de l’enzyme)

la souche : RYB

genre de la bactérie : Escherichia l’espèce : coli (1pts)

TaqI : (T) : le genre de la bactérie : Thermus

(aq) : l’espèce : aquaticus (1pts)

(I) : type d’enzyme

Le type de la coupure réalisée par ces deux enzymes est cohésive (à bout collant) (0.25pts)

c- Notion d’isoschizomères : Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des

mêmes sites spécifiques, on les appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent
souvent après clivage enzymatique des fragments dont les extrémités sont différentes. (1pts)
d- les inconvénients d’utiliser l’E.coli comme cellule hôte dans le clonage sont :
(0.75pts)

 sécrétant mal les protéines, il est souvent nécessaire de "casser" la bactérie afin de
récupérer la protéine (ce qui induit des problèmes de purification, ou de solubilisation
et de renaturation..., quelquefois au détriment des rendements). (0.25pts)
 Autre inconvénient majeur : E. coli n'effectue pas les modifications post-
traductionnelles des protéines (en particulier la glycosylation, la carboxylation, etc.),
qui constituent souvent une condition principale d'activité de la protéine. (0.25pts)
 Enfin E. coli étant une entérobactérie, il est donc nécessaire de s'assurer de l'absence
d'endotoxines dans les protéines purifiées. (0.25pts)

e- le nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme procaryote couramment utilisé au

laboratoire comme hôte d’expression : Escherichia coli (1pts)
f- le nom scientifique (genre et espèce) d’un organisme eucaryote unicellulaire couramment
utilisé au laboratoire ou dans l’industrie : Saccharomyces cerevisiae (1pts)
g- pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes : (3pts)

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1- Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin : dénaturation est
réalisée à environ 95°C. (1pts)

2- Borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides

amorces spécifiques : hybridation se fait à une température qui sera définie selon la
nature des amorces (cette température varie de 50 à 60°C). (1pts)

3- Réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle,

les produits sont sous forme d'ADN double brin : polymérisation à environ 72°C.
Température de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette
étape, les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre
des amorces hybridées. (1pts)

h- le rôle des quatre parties du vecteur indiquées par les flèches dans la figure : (2pts)

- gène de résistance : gène induisant la résistance à un agent de sélection placé dans le

milieu de culture comme un antibiotique. Le gène peut coder une enzyme dégradant
l’antibiotique en question : AmpR code pour une protéine qui dégrade l’ampicilline.
(0.5pts)
- site multiple de clonage : région d’ADN contenant un grand nombre de sites de
restriction propices au clonage du gène d’intérêt. (0.5pts)
- Promoteur : séquence permettant l’activation de la transcription du gène placé en
aval, contenant notamment les sites de fixation du complexe ARN polymérase.
(0.5pts)
- ORI : origine de réplication permettant la fixation de l’ADN polymérase de E.coli et
la réplication autonome du vecteur in vivo. (0.5pts)

Réponse 4 :

1- Schéma de la région de clonage EcoRI/XhoI du vecteur recombinant : (1.25pts)

Sites de restriction d’EcoRI et XhoI sont : G/AATTC C/TCGAG

CTTAA/G GAGCT/C

Vecteur recombinant Gaattc cTCGAG

CTTAAg gagctC

2- le principe de la sélection colorimétrique des bactéries qui ont intégré un vecteur

recombinant : (2pts)

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Un système enzymatique appartenant à l’opéron lactose est utilisé dans ce cas. L’insertion du
fragment d’ADN dans le plasmide aboutit à l’inactivation du gène LacZa qui code pour la b-
galactosidase. Pour vérifier la présence ou l’absence de l’activité enzymatique b-
galactosidase, on utilise un galactoside dont la couleur passe de l’incolore au bleu quand il est
clivé par la b-galactosidase, ce composé s’appelle X-gal. Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la
cellule doit être exposée à un inducteur, cet inducteur est l’IPTG (isopropylthio-b-D-
galactoside).

En culture et en présence d’IPTG et de X-gal, les bactéries résistantes à l’ampicilline et

transformées par les plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies blanchâtres
car elles ont perdu la capacité de clivage de l’équivalent coloré du lactose (le X-gal) par la b-
galactosidase. Par contre, les bactéries résistantes à l’ampicilline et non transformées par les
plasmides recombinants se présentent sous forme de colonies bleues. La sélection visuelle des
bactéries transformées par les plasmides recombinants est donc possible.

B-galactosidase

X-gal+ IPTG produit bleu qui s’accumule dans les cellules

Sélection des bactéries transformées portant un plasmide recombiné

3. On a fait une culture bactérienne dans un milieu liquide pour donner le temps nécessaire à
l’intégration du vecteur recombinant avec les cellules hôtes (l’étape de transformation
bactérienne) (0.5pts)

4. Le taux de transformation est très faible (0.5pts) et le pourcentage des bactéries avec
vecteurs recombinant n’est pas suffisant. (0.5pts)

Réponse 3 :
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1- la séquence des 2 amorces qui permettront d’amplifier ce gène par PCR entre ses 2
extrémités sont :

5’- TATTCCATCGGTTACTGACT-3’ pour amplifier le brin sens (0.5pts)

5’- CTACATGCATCATACGCGAC-3’ pour amplifier le brin antisens (0.5pts)

2- température de d'hybridation du programme PCR afin d’amplifier le plus

spécifiquement possible ce gène :

Cette température d’hybridation dépend de la composition en bases des oligonucléotides

amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de
demi-dénaturation.

Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation

suivante :

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) (Où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de

ces bases dans l’oligonucléotide).

Pour l’amorce du brin sens :

Tm= 2(4+8)+ 4(5+3)= 56°C donc Th 1= 56- 5= 51°C (0.5pts)

Pour l’amorce du brin antisens :

Tm= 2(6+4)+ 4(7+3)= 60°C donc Th2= 60-5= 55°C (0.5pts)

La température de d'hybridation du programme PCR est 55°C (0.5pts)

Réponse 2 :

- la séquence nucléotidique lue directement sur l’autoradiogramme :

5’- AAGATTTCT-3’ (0.25pts)

- la séquence nucléotidique réelle d’ADN monobrin est :

3’-TTCTAAAGA-5’ (0.25pts)

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