METHODES

SPECTRSCOPIQUES

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PLAN

I – Introduction, quelques rappels utiles…

II – Spectroscopie d’absorption dans l’UV-Visible

III – Spectroscopie de vibration dans l’infrarouge

IV – Spectroscopie Résonance Magnétique Nucléaire

V – Spectroscopie de masse
I- Introduction
pourquoi les techniques expérimentales… ?
Des outils de base de la recherche, de l’expertise, du contrôle…

Laboratoires Laboratoires
de recherches Industriels

• développement • contrôle de production

de nouveaux matériaux • expertises
de nouveaux procédés
Techniques
Expérimentales
Spectrométriques

Vie courante

• IRM
• Scanner…
 La démarche analytique

nature du problème
l’échantillon est-il imposé (expertise)?
ou libre?
est-il le résultat d’un étude plus générale ?
nature des informations peut-on le découper ? ...
recherchées
résolutions nécessaires
composition résolutions spatiales
structure et spectrales,
propriétés particulières limite de détection
...
dimensions
quelle(s) technique(s) nature et préparation nature (solide, liquide, poudre…)
employer ? de l’échantillon préparation (polissage, lame mince ..)
contraintes métallisation..
particulières ?

Conditions Pour chaque technique, en fonction

de l ’échantillon, des informations
d’analyse
et de la résolution désirées

traitements
résultats
ANALYSE(S) des données Conclusions
bruts
 réactions Méthodes d’Analyse interactions
chimiques physiques

méthodes méthodes
chimiques physiques

en volume
(globale) localisée
mm3 au cm3
chimie
en profondeur
fluorescence X ponctuelle
spectrométries : profils de concentration
- d’émission SIMS
- d’absorption
en surface
SDL
1 à 10nm RBS
Auger
XPS
microanalyse SIMS
HREELS
environnement
mm3 et liaison
EPMA « nanoanalyse » chimique
MEB-EDS
traces Auger nm3 Infra-rouge
Raman
ppb ppt STEM atomique
RMN
ICP EELS
atome
Abs. atomique sonde atomique
STM-AFM
 METHODES
SPECTROMETRIQUES D'ANALYSE

Spectrométrie de fluorescence X

Spectroscopie d’absorption dans l’UV-Visible : Application quantitative (dosage de l'aspirine par exemple)
Spectroscopie de Vibration dans l’infrarouge : identification des groupes fonctionnels
Spectroscopie Résonance Magnétique Nucléaire : identification des molécules
Spectroscopie de masse : détermination de la masse moléculaire
L’analyse chimique

On analyse l’échantillon M et on dose l’élément A

On prélève un échantillon pour l ’analyse :

- cet échantillon est-il bien représentatif ? (« échantillonnage »)
- cet échantillon est-il homogène (en cas d’analyses locales )

- prélever plusieurs échantillons

- effectuer plusieurs analyses sur le même échantillon

traitements statistiques des résultats

Questions/réponses :

- présence de l’élément A ? analyse qualitative

- si oui, en quelle quantité ? analyse quantitative
- éventuellement, sous quelle forme chimique ?
 Les moyens ?

Les techniques d’analyse chimique par méthodes physiques sont généralement

basées sur la mesure de spectres…

spectres :
distribution discrète (ou pas) de données émises par l’échantillon

spectre de raies spectre de masse

- rayonnements électromagnétiques - émissions d’ions
- d’émission, d’ionisation, d’absorption - pulvérisation
- suite discrète d’énergie - suite discrètes de masses atomiques ou
moléculaires

spectre d’émission X

spectre de masse
spectre d’absorption infra rouge
II- Spectroscopie d’absorption dans l’UV-Visible

La spectroscopie d’absorption dans l’UV et le visible est une méthode très

commune dans les laboratoires. Elle est basée sur la propriété des
molécules d’absorber des radiations lumineuses de longueur d’onde
déterminée.

Domaine spectral

Le domaine UV-visible s'étend environ de 800 à 10 nm.

visible : 800 nm (rouge) - 400 nm (indigo)
proche-UV : 400 nm - 200 nm
UV-lointain : 200 nm - 10 nm.

- Méthode simple
- Précise
- sensible
- Nécessite peu de matériel (50 ml)
- Non destructive
Principe
Soit une lumière monochromatique traversant
une solution absorbante de concentration C
contenue dans une cuve d’épaisseur l.

Une partie de ce rayonnement

sera absorbée par l’échantillon et
une partie sera transmise.

l'intensité d'une lumière monochromatique traversant un milieu où elle est

absorbée décroît de façon exponentielle

loi de Beer-Lambert :
A = - log T = ɛ l C
 Le spectrophotomètre UV-Visible

C'est un des appareil les plus utilisé en laboratoire

Cuve de référence

principe
IO

It

Source polychromatique. Monochromateur

Permet de Tampon
Lampe à incandescence visible
sélectionner la +
Lampe à Xénon (UV)
longueur d'onde échantillon
Déterminer λmax Tracé de la gamme d’étalonnage

gamme colorimétrique
A la fin on représente A = log(IO/It) en fonction de la longueur d'onde

Ou bien l'absorption à une longueur d'onde (en fonction du temps)

Ex absorption à 340 nm pour suivre la

A formation du NADH

t
Certains acides aminés

Trp, Phe, tyr sont des

systèmes conjuguès
L'absorption UV à 280 nm permet de déterminer la concentration de protéine. L'absorption
est proportionnel à la concentration
Loi de Beer Lambert : A =e
l.l.C

L'absorption UV à 280 nm permet aussi de suivre les protéines (qui sont transparentes
à l'œil) par exemple lors d'une purification
Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est un coenzyme d'oxydoréduction

Le NAD est capable de fixer 2

électron et un proton, soit un
ion hydrure H-

En fixant l'électron et le proton la résonance du cycle. On change donc les longueur

d'absorption

En suivant l'absorbance à 340 nm, on

pourra suivre l'évolution de la réaction
enzymatique. Formation de NADH
(réduction) ou disparition de NAD+
(Oxydation)
 Les bases d'ADN ou d'ARN

Adénine Guanine Thymine cytosine

A cause de leurs systèmes de conjugaisons, ces bases absorbe dans l'UV.

L'ADN et L'ARN absorbe à 260nm (280 nm pour les protéine)

L'absorption UV à 260 nm permet aussi de suivre les l'ADN ou l'ARN

III – Spectroscopie de vibration dans l’infrarouge
 Les mouvements des atomes d’une molécule peuvent être classés en trois
catégories:
- les translations
- les rotations
- les vibrations
 Spectroscopie vibrationnelle :
Etude des vibrations moléculaires

Transitions dans la gamme 10-13000 cm-1 ≈

Les deux spectroscopies infrarouge (IR) et Raman étudient les vibrations des molécules
lorsqu’elles sont irradiées par une onde électromagnétique de fréquence adéquate.
Le domaine de l’infrarouge se subdivise en 3 régions :
 Proche-IR 0,8-2,5  13300-4000 cm-1
 IR moyen 2,5-25  4000-400 cm-1
 IR-lointain 25-1000  400-10 cm-1

Molécule soumise à une radiation infrarouge

se met à vibrer

modification des
* distances interatomiques
* angles

L’absorption d’une radiation infrarouge provoque des

vibrations au sein des molécules
Allure d’un spectre IR
 Spectre IR = Suite de bandes d’absorption
 Abscisse : cm-1, Ordonnée : Transmittance (%T) ou
Absorbance A = log(1/T)

Les groupes fonctionnels donnent lieu à des absorptions infrarouge

caractéristiques
 IV – Spectroscopie Résonance Magnétique Nucléaire

C’est une technique qui exploite les propriétés magnétiques de certains noyaux
atomiques. Elle est basée sur le phénomène de résonance magnétique nucléaire, utilisé
également en imagerie médicale sous le nom d’IRM.

PRINCIPE DE BASE
Interaction du moment dipolaire magnétique de la matière avec la composante magnétique de la
radiation électromagnétique

 La résonance magnétique nucléaire (RMN) désigne

une propriété de certains noyaux atomiques
possédant un spin nucléaire (par exemple 1H, 13C,
17O, 19F, 31P, 129Xe…), placés dans un champ

magnétique.

 Lorsqu'ils sont soumis à un rayonnement

électromagnétique les noyaux peuvent absorber
l'énergie du rayonnement puis la relâcher lors de la
relaxation.

 L'énergie mise en jeu lors de ce phénomène

correspond à une fréquence très précise.

 Seuls les atomes dont les noyaux possèdent un

moment magnétique donnent lieu au phénomène
de résonance.
 Un noyau peut être étudié par RMN si son
spin nucléaire I est non nul.

I=1/2 1H, 19F, 13C, 31P

I est un demi entier I=3/2 11B, 23Na

I=5/2 17O, 27Al

I=1 2H, 14N

I est un entier
I=3 10B

I est nul I=0 12C, 16O

Interaction spin nucléaire - champ magnétique

 En l’absence de champ magnétique externe, les moments

magnétiques de spin sont orientés au hasard.

 Plongés dans un champ magnétique

Moments magnétiques alignées selon
direction du champ imposé
Echantillonnage

 RMN1H: quantité de produit nécessaire de 10 à 50 mg

 Placé dans une tube en verre (probe) mis en rotation au centre d'une bobine
magnétique afin d'homogénéiser le champ dans l’échantillon

longueur du tube : 18 cm
diamètre externe: 5 mm
diamètre interne : 4 mm
Solvants

 Solvant choisi pour l'étude des spectres dépourvu d'atomes

d’hydrogène
 Solvant le plus courant : chloroforme deutérié (CDCl3)

AUTRES SOLVANTS :
tétrachlorure de carbone CCl4
acétone-d6
méthanol-d4
pyridine-d5
eau lourde (D2O)...
 Description simple
 Un aimant fournissant le champ H0 sépare les états d’énergie du spin
nucléaire.
 L'échantillon à analyser est placé au centre de l’aimant, dans une sonde qui
contient une bobine émettrice et une bobine réceptrice.

 La bobine émettrice fournit le champ oscillant H1 à la fréquence de Larmor pour le noyau

considéré.
 On fait varier la fréquence jusqu'à la résonance : basculement du spin nucléaire de l'état
 à l'état .
 On mesure au moment de la résonance une augmentation de courant qui traduit l'énergie
absorbée E par l'intermédiaire de la bobine réceptrice.

 Ce signal, très amplifié, se traduit par un "pic" sur l'enregistreur.

Exemples de déplacement chimique :
 Intégration des signaux RMN

Surface d’un signal proportionnelle

au nombre de H correspondants

Dispositif appelé intégrateur lié à

l’enregistreur
 mesure de l’aire des signaux
 série de paliers dont les hauteurs
reflètent les ≠ valeurs des intégrations

Exemple 1 : p-xylène
 Exemple 2 : (CH3)3-CH2-OH

3 signaux de surface relatives intégrant 9, 2, 1 H

  = 1,4 ppm ; 9 H ; groupe tertiobutyle

  = 3,9 ppm ; deux protons du groupe CH2
  = 4,3 ppm ; proton du groupement O-H
Spectre du 1,1,2-trichloroéthane
Spectre du 2-chloroéthanoate d’éthyle
 Spectre 1D.
A chaque pic correspond un proton

Le lysozyme est une protéine

globulaire formée de 130 acides
aminés

Spectre 2D. Couplage scalaire, dipolaire.

Attribution + géométrie. Plusieurs spectres sont

nécessaires
Imagerie Résonance Magnétique (IRM)

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique d'imagerie médicale
permettant d'obtenir des vues en deux ou en trois dimensions de l'intérieur du corps de
façon non invasive avec une résolution en contraste1 relativement élevée.
L'IRM repose sur le principe de la résonance magnétique nucléaire (RMN)

Déroulement de l'IRM

L’appareil comporte un aimant de grande puissance, d’où le terme « magnétique ». La technique consiste à
faire vibrer les noyaux d’hydrogène qui composent les tissus de l’organisme. Ces noyaux renferment en effet
des protons qui vont agir comme autant de petits aimants.
En vibrant, ils émettent des signaux qui vont être captés par une antenne puis être transformés en images.
Dans la salle d’examen, le patient est allongé sur un lit. L’antenne est alors disposée sur la zone à examiner,
puis le lit glisse doucement dans le tunnel de l’appareil.
,L’examen dure généralement de 15 à 20 minutes.
 V- Spectroscopie de masse

 Cette technique est applicable pour des composés solides, liquides et gazeux.

Elle permet :
 Détermination de la masse molaire
 Analyses structurales
 Explication des mécanismes de ruptures de liaisons…
 Analyses quantitatives :
Limites de détection < nanogramme
(parfois < picogramme)

APPLICATIONS PRATIQUES
 Biologie : Détermination de Masses molaires > 100000 (à 1 unité près) pour
des macromolécules comme les proteïnes
 Etudes de pollution de l’environnement
 Détection de dopants chez les sportifs

 Sensibilité
AVANTAGES DE LA TECHNIQUE  Sélectivité
 Rapidité
Principe

Analyse de fragments moléculaires

obtenus par ionisation

impact électronique
ionisation chimique
Spectroscopie de masse sépare les ions moléculaire selon leur masse
  Ionisation : A-B-C + 1e-  A-B-C+. + 2e-
A-B-C+. : ion radical  Fragmentations

ions, radicaux ou molécules neutres

 Accélération des particules chargées par un champ
électrique
 Déviation des particules chargées par un champ magnétique
déviation proportionnelle à masse/charge : m/z
 Analyse : mesure de m/z de chaque fragment moléculaire
Le système d'introduction de l’échantillon
Introduction de l'échantillon dans la source d'ions

GAZ et LIQUIDES VOLATILS

A partir d’un ballon chauffé mis en communication avec source

SOLIDES

Tube avec filament + échantillon dissous dans un solvant organique et chauffé pour être vaporisé

Echantillon dans la source : état gazeux

 Appareillage

collecteur d’ions ou détecteur :

 détecte ions sortants et les
exprime en fonction de leur
 abondance relative

source : lieu
d'ionisation des
molécules et
fragmentation
des ions analyseur : sépare
les ions en fonction
 de m/z


Un vide poussé est fait dans chacun de ces éléments.
 spectromètre de masse chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse

Spectromètre de masse sépare les ions moléculaire selon leur masse

Spectre de masse

 abscisse : m/z
(en impact électronique, z presque toujours égale à 1)

 ordonnée : intensité 
abondance relative des ions

Intensité du pic le plus intense du spectre :

fixée arbitrairement à 100
Les différents types de pics

a - Le pic de base

Pic le plus intense du spectre  Ion le plus abondant

b - Le pic moléculaire ou pic parent

 m/z = masse moléculaire

 Hexane

Pic moléculaire ≠ pic de base

 Ion moléculaire se fragmente facilement
Conclusion

Une bonne utilisation des techniques expérimentales nécessite :

1) une bonne connaissance de la structure des milieux analysés

2) une bonne connaissance des interactions rayonnement-matière

3) pour chaque technique utilisée, la connaissance des performances,

ses limites et ses domaines d’application