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UNIVERSITE ABDELMALEK ESSAADI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE TANGER


DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Filière : Biotechnologie Animale

PROJET DE FIN D’ETUDES


INTITULE :

Caractérisation phénotypique des bactéries genre


Rhizobium Nodulant Trigonella foenum-graecum

Réalisé Au laboratoire de l’Equipe de Recherche Valorisation des Microorganismes,


Génomique et Bio-informatique du Département des Sciences de la Vie à la FST de Tanger

Présenté par : Encadré par :

Mlle BARRY Adama Pr. Barrijal Said M.


BUGINGO Pacifique Mme Najlae Belkadi

Membres de jury :
Nom et Prénom Etablissement Qualité
Pr. Lairini Khalid FST-Tanger Président
Pr. Essalmani Haiat FST-Tanger Examinatrice
Mme. Belkadi Najlae FST-Tanger Coencadrante
Pr. Barrijal Said FST-Tanger Encadrant

Année Universitaire 2016/2017


Dédicaces

Tous les mots ne sauraient exprimer, ma gratitude, mon amour,


mon respect à votre égard.
C’est avec une profonde affection et reconnaissance que je vous dédie ce travail.

A mes très chers parents


A l’homme bénit, digne, battant, respectueux, modèle, le pilier de ma famille ;
Papa que j’adore.
A la lumière de mes jours, la source de mes efforts, la flamme de mon cœur, ma
vie et mon bonheur ; maman que j’adore.
En témoignage d’affection et du grand respect que je leur porte, pour les efforts
et les sacrifices qu’ils ont consentis pour parvenir à mon éducation et ma
formation. Que Dieu vous garde et vous donne santé et longue vie.
A mon merveilleux Frère en or BARRY AMADOU OURY et sa
magnifique femme Diallo Fatoumata Binta ; mes références aucune
expression ne suffira pour exprimer ma sincère reconnaissance pour tous
ce que vous sacrifiez pour me donner le meilleur de tout.

A mes chers frères et sœurs

A mes adorables frères Barry Ibrahima, Barry Mamadou Billo ;


A Mes sœurs adorées Barry Mariama, Diallo Oumou Koultoumy,
Diallo kadiatou,Camara Aminata,Diallo Adama Toulbho;
à mes merveilleuses nièces ; Et à tous mes petit(e)s sœurs et frères.
en témoignage des liens solides qui nous unissent et avec tous mes souhaits
de bonheur et de succès dans la vie.

Barry Adama
Remerciements

Nos remerciements s’adressent premièrement à Dieu tout puissant pour nous


avoir donné le pouvoir et la volonté pour arriver là où nous sommes.

Nous exprimons une sincère reconnaissance à M.Barrijal Said de nous avoir


accueilli dans son laboratoire pour la réalisation de ce travail, trouvez ici
l’expression de nos sentiments les plus distingués pour la confiance et l’aide que
vous nous avez accordé tout le long de ce travail.

Notre Profonde Gratitude au Pr. Lairini Khalid et la doctorante Mme Najlae


Belkadi pour leurs qualités humaines et scientifiques suscitant un grand respect
pour leur valeureux conseils et temps durant la réalisation de ce travail.

Nos remerciements s’adressent aussi au doyen, au vice doyen ainsi qu’à tous
les enseignants de la Faculté de Sciences et techniques de Tanger pour leurs
qualités humaines et scientifiques dont nous avons bénéficiés durant notre
formation.

Vous nous faites honneur professeurs et membres de jury de juger ce modeste


travail.

Nos remerciements vont à tous les étudiants de la licence du département de la


biologie, vous trouverez ici l’expression de nos sentiments les plus distingués. Nos
remerciements vont à toute personne ayant contribué de près ou de loin à la
réalisation de ce modeste travail.
Résumé
Les légumineuses, telles que le Trigonella foenum-graecum, peut developper des nodules
fixateurs d’azote sur les racines en formant la relation symbiotique mutualiste avec des bactéries
fixatrices d’azote rhizobiennes qui fournissent les conditions necessaires à la fixation de l’azote.
Notre travail consiste à réaliser une étude d’identification des bactéries type rhizobium nodulant
la plante Fenugrec (Trigonella foenum-graecum) par la caractérisation phénotypique
(physicochimiques, physiologiques et biochimique) de nos 46 isolats obtenus. Nous avons
réussi à évaluer la tolérance de ces isolats à différentes concentrations de sel (71 ; 85.5; 171;
256.67; 342 et 513 mM); tolérance au pH (3; 3.5; 4; 5; 6.8; 9 et 10) et à la température (4°C;
28°C; 37°C et 40°C). A partir de ces isolats nous avons aussi réalisé les tests tels que : la
Coloration de Gram, la Croissance de nos différents isolats sur le milieu Peptone-Glucose-Agar
(PGA), le Test du Bleu de Bromothymol, l’hydrolyse de l’urée, la résistance aux antibiotiques,
la résistance aux métaux lourds. Les résultats obtenus ont montré l’existence d’une diversité
phénotypique au sein des isolats étudiés.

Mots clés : Trigonella foenum-graecum, Rhizobium, Isolement,


Identification Phénotypique.

Abstract
Legumes, such as Trigonella foenum-graecum, form mutualistic symbiotic relationship with
nitrogen-fixing rhizobial bacteria. This occurs within specialized root organs-nodules- that
provide the conditions required for nitrogen fixation.
Our work entails the carrying out of an identification study of rhizobium-like bacteria
nodulating the Fenugreek (Trigonella foenum-graecum) plant by the phenotypic
characterization (physicochemical, physiological and biochemical) of our 46 isolates obtained.
We were able to evaluate the tolerance of these isolates at different salt concentrations (71, 85.5,
171, 256.67, 342 and 513 mM); pH tolerance (3, 3.5, 4, 5, 6.8, 9 and 10) and temperature (4 °
C, 28 ° C, 37 ° C and 40 ° C). From these isolates we also carried out tests such as: Gram
staining, growth of our various isolates on the Peptone-Glucose-Agar medium (PGA), the
Bromothymol blue test, Urea, resistance to antibiotics and resistance to heavy metals. The
results obtained showed the existence of a phenotypic diversity within the studied isolates.
Key words: Trigonella foenum-graecum, Rhizobium, Isolation, Phenotypic Identification

Liste des abréviations

BBT : Bleu de Bromothymol


Cm : centimètre g/l :
gramme par litre
H2O : eau
L : litre
m : mètre mm :
millimètre ml :
millilitre N2 :
Azote
NH3: Ammoniac
NH4+: ion ammonium
NH4CL: chlorure d’ammonium
NO2-: Nitrite
NO3- : Nitrate
PGA: Peptone Glucose Agar
t/min: tour par minute µm:
micromètre µl: microlitre
Y.E.M: Yeast Extract Mannitol
LISTE DES FIGURES

Figure 1 : La transformation d’azote par les bactéries nitrifiantes...............................................4


Figure 2 : Plantule de fenugrec………………………………...……………………. ………..7
Figure 3 : Rhizobium leguminosarum, cellule mobile flagellée et bacteroïdes...………....…..14
Figure 4 : Nodules formés sur les racines………..…………...……………………..………...16
Figure 5 : Dialogue moléculaire entre les rhizobia et les légumineuses……………….….......17
Figure 6 : Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place d’une
association symbiotique fixatrice d’azote……………………………………………………..18
Figure 7 : Préparation des tubes de conservations des nodules…………………………...…...20
Figure 8 : Milieu de culture YEM liquide…………………………………………..………...21
Figure 9 : Les étapes de coloration du frottis…………………………..……………………...24
Figure10: Boites de pétri contenant des colonies types rhizobiums nodulant le
fenugrec…………………………………………………………………………………..…...28
Figure 11 : Observation.au microscope optique des isolats à la coloration de Gram………..28
Figure 12 : Graphe qui montre la répartition des isolats selon le test de Gram………….…..29
Figure 13 : Graphe qui montre les résultats des différents isolats selon le test du PGA……….29
Figure 14a : Test du Bleu de Bromothymol (BBT)…………………..…….............…………30
Figure 14b : Graphe du BBT…………………………..…………………………..………….30
Figure 15 : Graphe montrant la tolérance des souches au pH……………………..……..........31
Figure 16 : Graphe montrant la tolérance des souches à la température………………….…..32
Figure 17 : Tolérance des isolats aux différentes concentrations de NaCl………………….....33
LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Description botanique du Trigonella foenum-graecum……………………..…......7

Tableau II : classification scientifique du Trigonella foenum-graecum………….……...…….8

Tableau III : Classification des bactéries symbiotiques fixatrices d’azote de la famille des
Rhizobiaceae…………………………………….……………………………...…………….12
Tableau IV : Classification des rhizobia………………….……………………………..…...13

Tableau V : Les étapes de coloration du frottis…………….…………………………………23

Tableau VI : Résultats des différents isolats selon le test de Gram et PGA…………………...44

Tableau VII : Comportement des isolats vis-à-vis du Bleu de Bromothymol et d’uréase…….45

Tableau VIII : Résultats des diffèrent tests physiologiques………………...………………..47

Tableau IX. Liste des différents sites géographiques de prélèvement et le nombre de souches
obtenir à partir de chaque région………………………………………………………………48
TABLEAU DE MATIERE

Introduction Générale…………………………………………………..…..…………………..1

Objectif…………………………………………………………………………………………2

Revue Bibliographique

I. Importance de l’azote dans la nutrition des légumineuses………….……………………..3


I.1. Rôle de l’azote dans la nutrition des plantes……………………….……………….....3
I.2. Rôle de la fixation biologique de l’azote dans la nutrition des plantes……….………...3

II. Les légumineuse……………..…………………………………………………………....5


II.1. Généralités……………......…………………………………………..……...…5
II.2. Fenugrec ou Trigonelle fenugrec (Trigonella foenum-graecum)………......…..6
II.2.1Aperçu historique…………………………………………………………...............6
II.2.2. Description botanique du fenugrec……………………………………………….…...6
II.2.3. Taxonomie……………………….……………………………………..…..8
II.2.4. Distribution……………………………………………………………...….8
II.2.5. Intérêt de culture…………………………….………………………......….8
II.2.6. Adaptation aux conditions des sols et du climat………….………….…….9
II.2.7. Mode de reproduction et pollinisation chez le Trigonella foenum-
graecum…………………………………………………………………....9

III. Rhizobiaceae
III.1. Description……………………………………….………………...…………10
III.2. Taxonomie des rhizobium…………..……………….………...………...……10
III.3. Classification des Rhizobia……….……………………………………13
III .4. Caractéristiques qui distinguent les six genres de
rhizobium………….…..…..14

IV. Symbiose rhizobium-légumineuses…………...…………………..……...…………15


IV.1. Les effets des rhizobiums lors de la symbiose …….………………………………….15
IV.2. La spécificité de la symbiose rhizobium-légumineuses ………….…….……………..16
IV.3. Processus de nodulation………………………..………………..…………………….17

V. Inoculation des légumineuses……………………………...……….…………………...19


V.1.Caracteristiques du bon inoculum……………………………………….………………..……………….19

Matériel et Méthodes

I. Isolement des rhizobiums à partir des nodosités……………………………….……………20

I.1. Protocole de prélèvement et conservation des nodosités………………..………..20


I.1.1. Préparation des tubes de conservation………………..……………………20
I.1.2. Récolte des nodosités…………………………..……..…………………….21
I.2. Stérilisation des nodosités…………………...…...……….………………………21
I.3. Ecrasement des nodosités…………………………….…………..……………….21
I.4. Préparation du milieu de culture……………………………......……….………...21
I. 5.Isolement des rhizobiums…………………………...………………………………..….22

II. Identification des rhizobiums………………………………..……………………………..22


II.1. Critères morphologiques…………………………………..……...……………...22
II.1.1. Coloration de Gram……………………………………………………22
II.1.2. Test de peptone Glucose Agar………………………………………...24
II.2. Tests biochimiques…………………………….....……………………………..24
II.2.1. Test du Bleu de Bromothymol………………………....……......24
II.2.2. Hydrolyse de l’urée …………………………………………………………..25
II.3. Tests physiologiques……………………………………………...……………25
II.3.1. Tolérance au pH………………………………………………..………………...........26
II.3.2. Tolérance au NaCl……………………………………………………..26
II.3. 3.. Tolérance aux températures………………………...………...…………………..26
II.3.4. Résistance aux métaux lourds………………………………….……..........27
II.3.5. Résistances aux antibiotiques……………………………… ……………...27

Résultants et Discussion
I. Isolement des rhizobiums à partir de nodosités…………………………………………...28
II. Critères morphologiques…………………………………...……………………… .…..28
II.1. Coloration de Gram………………………………...……………………….….28
II.2. Test Peptone-Agar-Glucose (PGA)……………………..………………………29

III. Tests biochimiques………………………………………………..………………………30


III.1. Test du Bleu de Bromothymol………………………………...………………30
III.2. Hydrolyse de l’urée………………………………………………..…………..30

IV. Tests physiologiques……………………………..………….…………………………...31


IV.1. Tolérance au pH……………………………………...…..……………………31
IV.2. Tolérance à la Température……………………………..…...…………………..32
IV.3. Tolérance à la salinité ………………………………..……………..…………32
IV.4. Résistance aux métaux lourds…………………………………………………..33
IV.5. Résistances aux antibiotiques………………..………………………………..33

Conclusion Générale……………………………………….……………………...………….34
Perspispectives………………………………………………….……………………...……..35
Références bibiographiques……………………………………….…………………...……..36
Webographie……………………………………………...…………………………………..42
Annexes…………………………………………………….………………………..……….44