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Utilisation de la chromatographie de partage centrifuge pour la purification de


la Galanthamine

Article · June 2006

CITATIONS READS

0 784

4 authors, including:

Jean-Hugues Renault Jean-Marc Nuzillard


Université de Reims Champagne-Ardenne French National Centre for Scientific Research
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Alexandre Maciuk
Université Paris-Saclay
129 PUBLICATIONS   1,265 CITATIONS   

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Centrifugal Partition Chromatography : usefull process for extraction and purification View project

Molecular properties of liquids supersaturated with carbon dioxide: The case of champagne wines. View project

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(19)
&   
(11) EP 1 824 857 B1
(12) FASCICULE DE BREVET EUROPEEN

(45) Date de publication et mention (51) Int Cl.:


de la délivrance du brevet: C07D 491/04 (2006.01)
01.12.2010 Bulletin 2010/48
(86) Numéro de dépôt international:
(21) Numéro de dépôt: 05824656.2 PCT/FR2005/003046

(22) Date de dépôt: 06.12.2005 (87) Numéro de publication internationale:


WO 2006/064105 (22.06.2006 Gazette 2006/25)

(54) UTILISATION DE LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE POUR LA


PURIFICATION DE LA GALANTHAMINE
ANWENDUNG VON ZENTRIFUGALER VERTEILUNGSCHROMATOGRAPHIE ZUR
AUFREINIGUNG VON GALANTHAMINE
USE OF CENTRIFUGAL PARTITION CHROMATOGRAPHY FOR PURIFYING GALANTHAMINE

(84) Etats contractants désignés: • MACIUK, Alexandre


AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR 68000 Colmar (FR)
HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI • ZECHES-HANROT, Monique
SK TR 51430 Bezannes (FR)

(30) Priorité: 16.12.2004 FR 0413425 (74) Mandataire: Grosset-Fournier, Chantal Catherine


Grosset-Fournier & Demachy
(43) Date de publication de la demande: 54, rue Saint-Lazare
29.08.2007 Bulletin 2007/35 75009 Paris (FR)

(73) Titulaires: (56) Documents cités:


• Centre National de la Recherche Scientifique WO-A-00/58722 US-A1- 2002 028 802
75794 Paris Cedex 16 (FR) US-B1- 6 346 618 US-B1- 6 407 229
• Université De Reims Champagne-Ardenne
51100 Reims (FR) • DATABASE WPI Section Ch, Week 200447
Derwent Publications Ltd., London, GB; Class
(72) Inventeurs: E13, AN 2004-488415 XP002336902 & CN 1 490
• RENAULT, Jean-Hugues 319 A (YIXIN PHARM CO LTD ZHEJIANG PROV)
51100 Reims (FR) 21 avril 2004 (2004-04-21)
• NUZILLARD, Jean-Marc
51390 Courmas (FR)
EP 1 824 857 B1

Il est rappelé que: Dans un délai de neuf mois à compter de la publication de la mention de la délivrance du brevet
européen au Bulletin européen des brevets, toute personne peut faire opposition à ce brevet auprès de l'Office européen
des brevets, conformément au règlement d'exécution. L'opposition n'est réputée formée qu'après le paiement de la taxe
d'opposition. (Art. 99(1) Convention sur le brevet européen).

Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR)


1 EP 1 824 857 B1 2

Description à une vélocité fonction du rapport stoechiométrique entre


la concentration en reteneur (composé destiné à main-
[0001] La présente invention a pour objet l’utilisation tenir l’analyte dans la phase stationnaire) et la concen-
de la chromatographie de partage centrifuge pour la pu- tration en déplaceur (Maciuk et al., 2004 ; Intes et al.,
rification de la galanthamine. 5 2001). Les profils de concentration des espèces émer-
[0002] La chromatographie de partage centrifuge gentes sont alors rectangulaires et présentent des zones
(CPC) est une technique de chromatographie liquide- de transition abruptes appelées "schock layers". Ce der-
liquide sans support solide (Foucault, 1994 ; Berthod, nier mode est particulièrement adapté aux applications
2002), qui requiert l’utilisation d’un système biphasique préparatives. Une variante propre à la chromatographie
élaboré à partir d’au moins deux solvants et/ou solutions. 10 liquide-liquide sans support solide similaire dans son
Les colonnes utilisées sont de deux types : soit elles sont principe au "pH-zone refining" revendiqué en Chromato-
constituées d’un cylindre creux dont la paroi est creusée graphie à Contre-Courant (chromatographie liquide-li-
de cellules de partage distribuées radialement et reliées quide sans support solide en mode hydrodynamique)
entre elles par des conduits de section inférieure à celle (brevets américains US 5,332,504, US 5,354,473 et US
des cellules de partage (voir demande de brevet français 15 5,449,461 ; Weisz et al., 1994) est obtenue en mettant
2,802,104 ou demande internationale WO 2004/079363 à profit des équilibres acido-basiques entre les analytes.
au nom de Partus Technologies) ; soit elles sont consti- Les composés séparables par ce mode chromatographi-
tuées de disques empilés gravés de cellules de partage que doivent être ionisables et les formes neutres et ioni-
reliées entre elles par des conduits de section inférieure sées doivent présenter des différences de polarité suffi-
où l’étanchéité entre les disques est assurée par des 20 sante pour inverser leurs constantes de distributions
joints en Téflon® de même diamètre que les disques (de- dans le système biphasique sélectionné (Ito et al., 1996 ;
mande internationale WO 00/58722 au nom de Kromaton Ito et al., 1995 ; Renault et al., 1999).
Technologies). Le champ de force centrifuge constant [0004] Outre les avantages connus et fréquemment
généré, par la rotation de la colonne maintient une des cités de la CPC tels que l’absence d’adsorption irréver-
phases stationnaire dans cette dernière, l’autre phase 25 sible des solvants, la consommation réduite de solvants,
étant pompée au travers et jouant le rôle de phase mo- l’obtention de sélectivités élevées, il apparaît que cette
bile. La réalisation d’une séparation par CPC est princi- technique possède d’indéniables qualités préparatives
palement caractérisée par la sélection d’un système de (Margraff et al., 1994 ; Renault et al., 1999).
solvants adapté à une séparation particulière (Renault [0005] La (-)-galanthamine naturelle (C17H21NO3 ; M=
et al., 2002). 30 287,2) est une amine répondant à la formule suivante :
[0003] Un autre élément essentiel d’une séparation
par CPC est le choix du mode de développement chro-
matographique. L’élution est un mode commun à la chro-
matographie liquide haute performance (CLHP) et à la
CPC, où les analytes ne sont soumis qu’aux lois thermo- 35
dynamiques des équilibres de partage entre solvants.
Ce mode se caractérise idéalement par l’élution des ana-
lytes selon un profil de concentration gaussien. Un autre
mode, appelé déplacement, et décrit pour la première
fois par Tiselius (Tiselius, 1943), est fondé sur la com- 40
pétition des analytes entre eux lors de la chromatogra-
phie. Deux conditions doivent être remplies pour que ce
phénomène soit observé : le comportement non linéaire [0006] La (+)-galanthamine, accessible par synthèse,
de chacun des analytes et la phase mobile ne peut pas est l’énantiomère 12a(R),4a(R),3(S) de la galanthamine,
mobiliser seule les analytes. Il faut pour cela introduire 45 et n’a pas d’activité biologique.
en solution dans la phase mobile un déplaceur qui pré- [0007] La(-)-galanthamine est un inhibiteur compétitif
sente une interaction avec la phase stationnaire plus for- de l’acétylcholinestérase dans le traitement des symptô-
te que tous les analytes. Un exemple est constitué par mes de la maladie d’Alzheimer. Les traitements disponi-
la chromatographie d’échange d’ions en CPC ou sur sup- bles à l’heure actuelle sont seulement symptomatiques
port solide (Maciuk et al., 2004). La phase stationnaire 50 et se basent tous sur l’hypothèse cholinergique de la ma-
contient alors un échangeur (cationique ou anionique, ladie. Parmi les molécules sur le marché actuellement,
fort ou faible) et les analytes progressent dans la colonne la galanthamine est la seule substance naturelle, pré-
sous l’action du déplaceur. Les composés s’organisent sente dans les bulbes et/ou les parties aériennes de cer-
dans la colonne en une succession de zones dans les- taines plantes de la famille des Amaryllidaceae. Elle est
quelles les concentrations sont constantes, l’ordre 55 notamment commercialisée par les laboratoires Jans-
d’émergence des composés étant fixé par leurs constan- sen-Cilag (Réminyl® qui est un sel bromhydrate de (-)-ga-
tes d’association avec l’échangeur. Ce train de compo- lanthamine), mais sa production par Sanochemia. Phar-
sés, appelé train isotachique, progresse dans la colonne mazeutica AG (Vienne, Autriche) est assurée par la voie

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de la synthèse chimique, notamment selon les procédés [0018] Le composé purifié obtenu, correspondant à la
décrits dans la demande internationale WO 97/45431 ou galanthamine ou à l’un de ses dérivés, présente une pu-
dans le brevet américain US 6,407,229. reté supérieure à environ 99%, et avantageusement su-
[0008] Dans le cadre de ces procédés, l’obtention de périeure à environ 99,2%.
galanthamine optiquement pure implique l’utilisation de 5 [0019] Le procédé de l’invention permet d’accéder à
réactifs chiraux et/ou d’une cristallisation fractionnée à des sélectivités chromatographiques très élevées et à
partir d’un sel d’acide organique optiquement pur (acide des rendements de purification dépassant 90%. De plus,
tartrique). Il est également parfois nécessaire d’avoir re- l’utilisation de la CPC permet de réduire la quantité de
cours à de la chromatographie sur support solide (gel de solvant d’un facteur compris entre 5 et 10 comparative-
silice). De tels procédés sont donc longs et relativement 10 ment à la chromatographie liquide CLHP, généralement
coûteux à mettre en oeuvre. utilisée pour ce type de purification. Cette économie de
[0009] Par ailleurs, les brevets américains US solvant est directement imputable à la forte proportion
6,573,376, US 6,617,452 et US 6,194,404 concernent de phase stationnaire entièrement accessible dans la co-
un procédé d’isolement de la galanthamine, comprenant lonne (classiquement entre 30 et 80% du volume total
une étape d’extraction et une étape de purification par 15 de la colonne), ce qui limite la dilution des analytes. De
recristallisation. Les procédés de cristallisation de l’art plus, il faut souligner que l’absence de phase solide per-
antérieur, notamment mis au point pour un extrait de Nar- met une reproductibilité élevée en évitant les problèmes
cissus pseudonarcissus "Carlton", nécessitent a priori de compactage progressif du support chromatographi-
une extraction très sélective afin d’enrichir au maximum que. Enfin, comparativement à la cristallisation, le pro-
l’extrait en galanthamine. De plus, de tels procédés peu- 20 cédé est plus adaptable aux différentes sources de ga-
vent s’avérer inefficaces dans le cas d’un extrait obtenu lanthamine potentielles (plantes différentes, synthèse,
à partir d’une plante différente. Enfin, le rendement d’ex- biotechnologies), et donne de bien meilleurs rende-
traction est particulièrement faible (0,01% à partir des ments, en moyenne supérieurs à 90%.
bulbes secs) à partir d’une drogue titrant entre 0,2 et [0020] Le procédé de l’invention permet une flexibilité,
0,3%. 25 dans la mesure où le composé purifié peut être obtenu
[0010] Ces procédés de purification sont des procédés sous la forme d’une base ou d’un sel, selon l’utilisation
lourds et difficiles à mettre en oeuvre et présentent un ultérieure souhaitée.
coût élevé. [0021] Dans le cadre de l’utilisation de la galanthamine
[0011] Ces procédés de purification sont limités par dans des médicaments, la galanthamine est sous forme
l’utilisation de supports chromatographiques solides, ce 30 bromhydrate. Ainsi, lorsque le composé est obtenu sous
qui affecte les rendements en produits isolés, et par l’uti- la forme d’une base, il est nécessaire de le transformer
lisation de quantités importantes de solvants par rapport en bromhydrate et cette étape supplémentaire permet
aux masses produites, d’améliorer la pureté de la galanthamine car elle permet
[0012] Le brevet CN 1 490 319 concerne un procédé la perte d’impuretés supplémentaires.
d’isolement de la galanthamine par CCC. 35 [0022] La présente invention concerne l’utilisation telle
[0013] La présente invention a pour but de fournir un que définie ci-dessus, à partir d’une composition de dé-
procédé de purification de la galanthamine ou de ses part, contenant au moins 20% de galanthamine ou de
dérivés, conduisant à l’obtention de composés dans un ses dérivés, ledit procédé comprenant une étape de cen-
état de pureté compatible avec les exigences de l’indus- trifugation d’une combinaison d’au moins deux solvants
trie pharmaceutique, et avec des coûts de production 40 et de ladite composition de départ, pendant un temps
inférieurs à ceux obtenus lors de l’utilisation de techni- suffisant pour purifier la galanthamine ou ses dérivés,
ques de chromatographie sur support solide. lesdits solvants étant tels qu’ils forment deux phases non
[0014] La présente invention a pour but de fournir un miscibles, à savoir une phase aqueuse et une phase or-
procédé de purification de la galanthamine reproductible ganique, la phase aqueuse servant de phase mobile ou
et d’industrialisation aisée. 45 de phase stationnaire, et la phase organique servant res-
[0015] La présente invention concerne l’utilisation d’un pectivement de phase stationnaire ou de phase mobile.
procédé de chromatographie de partage centrifuge en [0023] Le procédé de la présente invention comprend
mode déplacement, pour la mise en oeuvre d’un procédé une étape dans laquelle on centrifuge d’une part la com-
de purification de la galanthamine ou de ses dérivés. position de départ telle que définie ci-dessus et d’autre
[0016] L’expression "mode déplacement" correspond 50 part une combinaison d’au moins deux solvants, telle que
à un mode de CPC différent du mode d’élution. Ce mode définie ci-dessus.
est proche dans son principe de l’échange d’ions. [0024] La combinaison de solvants comprend toujours
[0017] L’expression "galanthamine ou ses dérivés" dé- au moins deux solvants, dans la mesure où le procédé
signe la galanthamine ou les dérivés de la galanthamine de l’invention nécessite la présence de deux phases, à
tels que : la sanguinine, la galanthaminone (ou narwedi- 55 savoir une phase organique et une phase aqueuse, ce
ne), la galanthaminone, la norgalanthamine, la 11-hy- qui n’est pas possible en cas d’utilisation d’un solvant
droxygalanthamine, lycoramine, lycorine, assoanine, unique.
etc. [0025] Dans le cadre de l’étape de centrifugation, le

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5 EP 1 824 857 B1 6

champ de force centrifuge créé permet de maintenir une vention est caractérisé en ce que la composition de
phase stationnaire dans la colonne. De manière géné- départ est un extrait de plante ou de la matière biologique
rale, l’opérateur aura intérêt à générer une rotation la produisant de la galanthamine ou ses dérivés, telle que
plus élevée possible car cela améliore le transfert de ma- des cellules de plantes, ou un mélange de composés
tière en augmentant la surface d’échange entre la phase 5 obtenu par synthèse organique contenant notamment de
mobile et la phase stationnaire. La limite supérieure est la galanthamine et/ou ses dérivés.
fonction de la tolérance de l’appareillage à la perte de [0033] Les composés obtenus par synthèse organique
charge (cette dernière augmente avec la rotation ; le nécessitent également une étape de purification, qui peut
maximum est de 60 bars sur les appareils de laboratoire être dans certains cas une étape de chromatographie.
classiques et de 150 bars sur l’appareil industriel com- 10 De plus, si on sépare par le procédé de l’invention un
mercialisé par Partus). Classiquement, le champ de force mélange racémique, on obtient le racémate purifié des
appliqué est au minimum de 100 g. autres impuretés.
[0026] L’expression "pendant un temps suffisant pour [0034] Afin d’être introduit en tête de colonne, ledit ex-
purifier la galanthamine ou ses dérivés" correspond à trait de plante ou ladite matière biologique ou ledit mé-
une durée d’environ 20 minutes à plusieurs heures. 15 lange est dissous dans la phase mobile ou la phase sta-
[0027] L’expression "composition de départ" désigne tionnaire.
une composition contenant au moins le composé à pu- [0035] Le choix pour la phase qui servira à dissoudre
rifier, à savoir la galanthamine ou l’un de ses dérivés, la composition de départ est guidé par deux critères :
c’est-à-dire contenant au moins un composé alcaloïdi-
que. Cette composition de départ correspond à la com- 20 - la solubilité : on choisira de solubiliser la composition
position soumise au procédé de purification, avant l’éta- de départ dans la phase où elle présente la meilleure
pe de centrifugation. solubilité pour des raisons évidentes de productivité,
[0028] Selon un mode de réalisation avantageux de la - l’influence de la composition de départ sur l’équilibre
présente invention, la composition de départ contient le du système biphasique : il arrive que la dissolution
composé à purifier, sous forme de sel ou d’amine, dis- 25 dans une phase conduise à une déstabilisation
sous dans la phase stationnaire ou la phase mobile, ladite moindre du système biphasique, ce qui conduira à
composition de départ étant saturée ou non respective- un meilleur profil d’injection et donc à une meilleure
ment par l’ajout de phase mobile ou de phase station- rétention de phase stationnaire et donc une meilleu-
naire. re séparation (Marchal et al., 2003).
[0029] Selon un mode de réalisation avantageux, le 30
composé à purifier est récupéré danse la phase organi- [0036] Les composés obtenus par synthèse organique
que, dans la mesure où il sera plus facile à récupérer nécessitent également une étape de purification, qui peut
dans cette phase susceptible de s’évaporer plus facile- être dans certains cas une étape de chromatographie.
ment que la phase aqueuse. [0037] Si on sépare par le procédé de l’invention un
[0030] Dans le cadre du procédé de l’invention, lors- 35 mélange racémique, on obtient le racémate purifié des
que la phase stationnaire est la phase aqueuse, la phase autres impuretés.
mobile est la phase organique. Inversement, lorsque la [0038] Un procédé particulièrement avantageux selon
phase stationnaire est la phase organique, la phase mo- la présente invention est caractérisé en ce que les deux
bile est la phase aqueuse. phases liquides non miscibles correspondent à une com-
[0031] La présente invention concerne un procédé de 40 binaison d’au moins deux solvants, à savoir de l’eau et
purification de la galanthamine ou de ses dérivés à partir un solvant non miscible ou partiellement miscible à l’eau,
d’une composition de départ, contenant au moins 20% et forment ainsi une phase aqueuse et une phase orga-
de galanthamine ou de ses dérivés, par chromatographie nique.
de partage centrifuge en mode déplacement, ledit pro- [0039] L’expression "solvant partiellement miscible à
cédé comprenant une étape de centrifugation 45 l’eau" désigne un solvant qui n’est pas totalement mis-
cible à l’eau.
- d’une combinaison d’au moins deux solvants, et de [0040] Ainsi, par exemple, le système butanol/eau est
préférence d’au moins trois solvants, et un système biphasique dans lequel une importante quan-
- de ladite composition de départ tité de butanol est présente dans la phase aqueuse et
50 dans lequel une importante quantité d’eau est présente
pendant un temps suffisant pour purifier la galanthamine dans la phase organique.
ou ses dérivés, [0041] La phase aqueuse correspond à une phase ri-
lesdits solvants étant tels qu’ils forment deux phases non che en eau, c’est-à-dire essentiellement constituée
miscibles, à savoir une phase aqueuse et une phase or- d’eau. Elle contient également une petite quantité de sol-
ganique, la phase aqueuse servant de phase mobile ou 55 vant(s) non miscible(s) ou partiellement miscible(s) à
de phase stationnaire, et la phase organique servant res- l’eau.
pectivement de phase stationnaire ou de phase mobile. [0042] La phase organique correspond à une phase
[0032] Un procédé avantageux selon la présente in- riche en solvant(s) partiellement ou non miscible(s) à

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l’eau, c’est-à-dire essentiellement constituée de solvant qu’une constante diélectrique et un moment dipolaire in-
(s) non miscible(s) ou partiellement miscible(s) à l’eau. férieur à l’eau (recouvrant la notion de solvant apolaire)
Elle contient également une petite quantité d’eau. susceptible de permettre la dissolution préférentielle des
[0043] La présente invention concerne un procédé tel alcaloïdes (forme basique).
que défini ci-dessus, caractérisé en ce que les deux 5 [0050] La présente invention concerne un procédé tel
phases liquides non miscibles correspondent à un mé- que défini ci-dessus, caractérisé en ce que le solvant
lange d’au moins trois solvants, à savoir de l’eau, un sol- "pont" est choisi parmi : les alcools légers dont la chaîne
vant non miscible ou partiellement miscible à l’eau et un carbonée comprend moins de 4 atomes de carbone tels
"solvant pont", ledit solvant pont étant un solvant partiel- que le méthanol, l’éthanol, les propanols, l’acétonitrile,
lement ou totalement soluble dans l’eau et dans le solvant 10 l’acétone, le tétrahydrofuranne, le diméthylsulfoxyde et
non miscible ou partiellement miscible à l’eau, le diméthylformamide.
lesdits solvants étant tels qu’ils forment un système bi- [0051] Ces solvants sont de "bons solvants" des alca-
phasique comprenant une phase aqueuse et une phase loïdes (forme sel et forme base) facilitant la solubilisation
organique. générale et également le transfert de matière entre les
[0044] L’expression "solvant pont" est un terme utilisé 15 deux phases.
dans le cadre de la présente invention afin de désigner [0052] La présente invention concerne un procédé tel
un solvant à la fois miscible dans la phase organique et que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la phase
dans la phase aqueuse. Il est donc présent à la fois dans mobile contient un déplaceur qui est un acide ou une
les deux phases. base.
[0045] L’expression "solvant partiellement soluble 20 [0053] En mode déplacement en général, les solvants
dans l’eau et dans le solvant non miscible ou partielle- constituant la phase mobile ne sont pas éluants à eux
ment miscible à l’eau" désigne un solvant présent à la seuls. Ils sont incapables de mobiliser les composés à
fois dans la phase organique et dans la phase aqueuse. purifier présents dans la composition de départ.
[0046] L’expression "système biphasique" désigne un [0054] Une espèce supplémentaire, introduite dans le
système présentant deux phases, qui sont toutes les 25 système par la phase mobile, déplace les composés à
deux liquides dans le cas de la présente invention. purifier présents dans la composition de départ de leur
[0047] Selon un mode de réalisation avantageux de la fixation sur la phase stationnaire : c’est le déplaceur, ou
présente invention, le procédé tel que défini ci-dessus développeur. Tout comme le reteneur, il présente le mê-
est caractérisé en ce que le solvant non miscible ou me type d’interaction avec la phase stationnaire que les
partiellement miscible à l’eau est choisi parmi : 30 composés à purifier, mais avec une constante d’asso-
ciation avec l’échangeur plus grande que ces derniers.
- les éthers tels que l’éther de méthyle et de tertiobu- C’est le déplaceur qui est à l’origine de la force motrice
tyle (MTBE) et l’éther d’éthyle et de tertiobutyle, de la chromatographie.
- les cétones non miscibles à l’eau telles que la mé- [0055] En mode "pH-zone-refining", le déplaceur est
thyléthylcétone (MEK) et la méthylisobutylcétone 35 une espèce présente dans la phase mobile, qui force le
(MIBK), composé à purifier à passer dans la phase mobile, en
- les hydrocarbures aromatiques tels que le toluène, faisant changer son état d’ionisation par des réactions
- les hydrocarbures aliphatiques tels que l’hexane, acido-basiques. Dans le cas d’une séparation d’alcaloï-
l’heptane et les cyclohexanes, des, si la phase mobile est organique, le déplaceur doit
- les éthers de pétrole, 40 être une base forte liposoluble capable de neutraliser les
- les alcools lourds dont la chaîne carbonée comprend composés à purifier et de diminuer leur KD (constante de
au moins 4 atomes de carbone, tels que le n-butanol, distribution). Si la phase mobile est aqueuse, le dépla-
le 2-butanol et l’isobutanol, ceur doit être un acide fort hydrosoluble capable de pro-
- les siloxanes non miscibles à l’eau tels que l’hexa- tonner les composés à purifier et d’augmenter leur KD.
méthyldisiloxane, 45 Le déplaceur est nécessairement ajouté à la phase mo-
- les solvants halogénés non miscibles à l’eau, tels bile, il ne peut pas être injecté avec l’échantillon. C’est
que le chloroforme, le dichlorométhane et le di- sa concentration qui détermine la vélocité des composés
chloro-1,2-éthane, ou à purifier dans la colonne.
- les esters tels que l’acétate d’éthyle et l’acétate de [0056] Selon la présente invention, le déplaceur est un
butyle. 50 composé acido-basique présent dans la phase mobile
aqueuse ou organique.
[0048] Parmi tous ces solvants, les solvants halogé- [0057] Un procédé avantageux selon la présente in-
nés sont les seuls à être plus lourds que l’eau. vention est un procédé tel que défini ci-dessus, carac-
[0049] Les familles susmentionnées de solvants sont térisé en ce que la phase stationnaire correspond à la
des familles de solvants non- ou partiellement miscibles 55 phase aqueuse et la phase mobile correspond respecti-
à l’eau. Ces solvants génèrent donc une phase moins vement à la phase organique, et en ce que le déplaceur
polaire que la phase aqueuse. Cette phase organique contenu dans la phase mobile organique est une base.
présente donc des propriétés physico-chimiques telles [0058] Selon ce mode de réalisation, le composé al-

5
9 EP 1 824 857 B1 10

caloïdique purifié, à savoir la galanthamine ou l’un de dé de l’invention est caractérisé en ce qu’on ajoute dans
ses dérivés, est élué dans la phase mobile, c’est-à-dire la composition de départ ou dans la phase stationnaire
dans la phase organique ; il est donc sous sa forme ba- un reteneur, qui est un acide.
sique, c’est-à-dire sous une forme amine. Ainsi, le com- [0066] Selon ce mode de réalisation, la phase mobile
posé alcaloïdique à purifier est initialement sous sa forme 5 organique contient un déplaceur basique et la phase sta-
acide, à savoir sous la forme d’un sel d’ammonium. tionnaire est la phase aqueuse, dans laquelle on ajoute
[0059] Un procédé avantageux selon la présente in- un reteneur acide possédant une constante d’acidité plus
vention est un procédé tel que défini ci-dessus, carac- forte que celles des formes protonées des composés al-
térisé en ce que la phase stationnaire correspond à la caloïdiques à purifier.
phase organique et la phase mobile correspond respec- 10 [0067] Selon un mode de réalisation préféré, le procé-
tivement à la phase aqueuse, et en ce que le déplaceur dé de l’invention est caractérisé en ce qu’on ajoute dans
contenu dans la phase mobile aqueuse est un acide. la composition de départ ou dans la phase stationnaire
[0060] Selon ce mode de réalisation, le composé pu- un reteneur, qui est une base.
rifié, à savoir la galanthamine ou l’un de ses dérivés, est [0068] Selon ce mode de réalisation, la phase mobile
élué dans la phase mobile, c’est-à-dire dans la phase 15 aqueuse contient un déplaceur acide et la phase station-
aqueuse ; il est donc sous sa forme acide, c’est-à-dire naire est la phase organique, dans laquelle on ajoute un
sous sa forme de sel d’ammonium. Ainsi, la forme initiale reteneur basique possédant une constante d’acidité plus
du composé à purifier est sa forme basique, à savoir la faible que celles des composés alcaloïdiques à purifier.
forme amine. [0069] Selon un mode de réalisation avantageux, le
[0061] Un procédé préféré selon l’invention est carac- 20 procédé de la présente invention est caractérisé en ce
térisé en ce qu’un reteneur est : que la composition de départ contient les alcaloïdes sous
forme de sels d’ammonium dissous dans la phase sta-
• soit ajouté dans la composition de départ ou dans la tionnaire aqueuse, la composition de départ étant alors
phase stationnaire, saturée ou non par un ajout de phase mobile organique
• soit est un élément de la composition de départ, 25 sans déplaceur.
[0070] Un des intérêts de la CPC est de pouvoir injecter
ledit reteneur étant un acide ou une base. en phase mobile ou en phase stationnaire. Trois aspects
[0062] L’expression "reteneur" désigne un composé sont à considérer :
soumis au processus de purification ayant la plus grande
différence de pKa avec le déplaceur tel que défini ci- 30 - la solubilité de la composition de départ (il faut en
dessus. dissoudre le plus possible pour être productif...),
[0063] On donne le nom de reteneur à une espèce de - l’influence de la composition de départ sur le carac-
même caractère acido-basique que le composé à puri- tère biphasique du système de solvant, et dans ce
fier, mais montrant une plus grande différence de pKa cas une des deux phases peut présenter une
avec le déplaceur que toutes les espèces présentes. Le 35 meilleure affinité que l’autre (Marchal et al., 2003),
reteneur maintient le composé à purifier dans la phase - la qualité finale de la séparation.
stationnaire. Le reteneur peut être présent dans la phase
stationnaire, soit être injecté avec l’échantillon (un cas [0071] Il a été montré qu’une des conditions de réus-
particulier est alors de considérer que le composé de la site d’une séparation était le contrôle du caractère saturé
composition de départ présentant la plus grande diffé- 40 en phase conjuguée (phase organique ou phase aqueu-
rence de pKa avec le déplaceur joue ce rôle). Dans le se) de la phase dans laquelle l’échantillon a été dissous
cas d’un composé à purifier basique, si la phase station- (respectivement phase aqueuse ou phase organique)
naire est aqueuse, le reteneur doit être un acide fort hy- (Marchal et al., 2003). C’est pourquoi une quantité de
drosoluble, capable d’ioniser le composé à purifier afin phase conjuguée "vierge" (phase organique ou phase
de favoriser son partage dans la phase stationnaire (en 45 aqueuse) peut-être ajoutée afin de resaturer le volume
augmentant sa constante de distribution KD qui doit être d’injection.
>> 1). Si la phase stationnaire est organique, le reteneur [0072] Selon un autre mode de réalisation avanta-
doit être une base forte liposoluble capable de neutraliser geux, le procédé de la présente invention est caractérisé
le composé à purifier et d’augmenter sa constante de en ce que la composition de départ contient les alcaloï-
distribution qui doit être << 1). 50 des sous forme de bases neutres dissoutes dans la pha-
[0064] Le procédé de l’invention permet donc de con- se mobile aqueuse, la composition de départ étant alors
trôler le couple pureté / temps de purification, dans la saturée ou non par un ajout de phase stationnaire orga-
mesure où les quantités de déplaceur et de reteneur - nique sans reteneur.
régissant la vitesse de progression du train isotachique [0073] Selon un autre mode de réalisation avanta-
de composés - peuvent être modulées de façon à obtenir 55 geux, le procédé de la présente invention est caractérisé
un temps d’émergence des composés juste suffisant en ce que la composition de départ contient les alcaloï-
pour obtenir la pureté désirée. des sous forme de bases neutres dissoutes dans la pha-
[0065] Selon un mode de réalisation préféré, le procé- se stationnaire organique, la composition de départ étant

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11 EP 1 824 857 B1 12

alors saturée ou non par un ajout de phase mobile aqueu- tentions comprises entre 30 et 85%.
se sans déplaceur. [0078] Le procédé de l’invention tel que défini ci-des-
[0074] Selon un autre mode de réalisation avanta- sus est caractérisé en ce que le déplaceur est choisi
geux, le procédé de la présente invention est caractérisé parmi :
en ce que la composition de départ contient les alcaloï- 5
des sous forme de sels d’ammonium dissous dans la - les acides minéraux tels que HCl ou H2SO4,
phase mobile organique, la composition de départ étant - les acides organiques tels que l’acide méthane-sul-
alors saturée ou non par un ajout de phase stationnaire fonique, l’acide trifluoroacétique, l’acide acétique,
aqueuse sans reteneur. l’acide tartrique ou l’acide citrique,
[0075] La présente invention concerne également un 10 - les bases minérales telles que l’ammoniac ou la sou-
procédé tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de, ou
suivante : - les bases organiques telles que la triéthylamine.

- l’injection de la phase stationnaire dans une colonne [0079] Lorsque le déplaceur est un acide, il est plus
de chromatographie de partage centrifuge, ladite 15 acide que les acides conjugués des composés présents
phase stationnaire contenant un reteneur tel que dé- dans la composition de départ, et lorsque le déplaceur
fini ci-dessus, afin d’obtenir une colonne de chroma- est une base, il est plus basique que les composés pré-
tographie de partage centrifuge remplie de phase sents dans la composition de départ.
stationnaire, [0080] Les acides minéraux sont les produits les plus
- l’injection de la composition de départ telle que dé- 20 couramment utilisés en tant que déplaceurs. Dans le cas
finie ci-dessus dans la colonne de chromatographie particulier de la galanthamine, HBr peut être intéressant
de partage centrifuge remplie de phase stationnaire, dans la mesure où la forme pharmaceutique est le
pour obtenir une colonne de chromatographie de bromhydrate de galanthamine. L’acide tartrique est inté-
partage centrifuge chargée avec ladite phase sta- ressant car il est alors possible de sortir les alcaloïdes
tionnaire et ladite composition de départ, et 25 sous forme de tartrates qui peuvent être des sels phar-
- l’introduction par pompage dans la colonne telle maceutiques.
qu’obtenue à l’étape précédente, de la phase mobile [0081] Parmi les bases, les déplaceurs préférés sont
dans laquelle un déplaceur est ajouté telle que dé- les bases organiques car dans ce cas, le déplaceur ba-
finie ci-dessus, afin d’éluer la galanthamine ou ses sique doit montrer une solubilité correcte dans la phase
dérivés. 30 organique.
[0082] Le procédé de l’invention tel que défini ci-des-
[0076] L’expression "colonne de chromatographie de sus est caractérisé en ce que le reteneur est choisi
partage centrifuge remplie de phase stationnaire" dési- parmi :
gne une colonne, correspondant à une succession de
cavités parallélépipédiques ou cylindriques, reliées entre 35 - les bases minérales telles que l’ammoniac ou la sou-
elles par des canaux. Au départ, la colonne est vide. Cha- de, ou
que séparation par CPC commence donc par le remplis- - les bases organiques telles que la triéthylamine.
sage total de la colonne, en général en appliquant une - les acides minéraux tels que HCl ou H2SO4,
rotation faible (100 à 300 rpm). - les acides organiques tels que l’acide méthane-sul-
[0077] Une fois la colonne remplie de phase station- 40 fonique, l’acide, trifluoroacétique, l’acide acétique,
naire, la rotation de travail est appliquée (classiquement l’acide tartrique ou l’acide citrique.
entre 100 et 500 g). L’échantillon est injecté via une bou-
cle d’injection ou via la pompe en étant poussé par la [0083] Lorsque le reteneur est un acide, il est plus aci-
phase mobile. La phase mobile va déplacer un volume de que les acides conjugués des composés présents
de phase stationnaire dans chaque cellule de partage 45 dans la composition de départ et, lorsque le reteneur est
qui dépend du système de solvants, de la rotation, du une base, il est plus basique que les composés présents
débit, jusqu’à l’atteinte d’un équilibre hydrodynamique. dans la composition de départ.
Cet équilibre se caractérise par le rapport volume de pha- [0084] Selon un mode de réalisation avantageux de
se stationnaire/volume total de la colonne (noté Sf et ap- l’invention, le procédé de l’invention comprend l’utilisa-
pelé rétention). Concrètement, au début de l’expérience, 50 tion d’une combinaison des solvants suivants :
on observe la sortie de phase stationnaire, jusqu’à at-
teinte de l’équilibre, détecté par l’apparition (la sortie) de • toluène, heptane, acétone et eau, ou
phase mobile. A cet état d’équilibre, à chaque volume de • éther de méthyle et de tertiobutyle, acétonitrile et
phase mobile pompé il sort le même volume de phase eau, ou
mobile de la colonne. Un système chromatographique 55 • éther de méthyle et de tertiobutyle, acétone et eau,
en CPC est donc en partie caractérisé par le taux de ou
rétention de phase stationnaire dans la colonne. Classi- • méthylisobutylcétone, acétone et eau.
quement, des séparations sont possibles avec des ré-

7
13 EP 1 824 857 B1 14

[0085] La présente invention concerne également un - l’injection de la phase stationnaire aqueuse dans une
procédé tel que défini ci-dessus, comprenant l’utilisation colonne de chromatographie de partage centrifuge,
de la combinaison suivante de solvants : toluène, hep- ladite phase stationnaire contenant un reteneur aci-
tane, acétone et eau, dans des proportions volumiques de tel que défini ci-dessus, afin d’obtenir une colonne
telles que : 5 de chromatographie de partage centrifuge remplie
de phase stationnaire acidifiée,
- le pourcentage volumique du toluène est supérieur - l’injection de la composition de départ, dans laquelle
à celui de l’heptane, la galanthamine ou ses dérivés sont sous forme de
- le pourcentage volumique de l’acétonitrile ne dépas- sels, dans la colonne de chromatographie de parta-
se pas 50%, et 10 ge centrifuge remplie de phase stationnaire acidi-
- le mélange de ces solvants est biphasique, fiée, pour obtenir une colonne de chromatographie
de partage centrifuge chargée avec ladite phase sta-
et notamment dans les proportions volumiques 24:8:10: tionnaire acidifiée et ladite composition de départ, et
34. - l’introduction par pompage de la phase mobile orga-
[0086] La présente invention concerne également un 15 nique à travers la colonne telle qu’obtenue à l’étape
procédé tel que défini ci-dessus, comprenant l’utilisation précédente, dans laquelle un déplaceur basique est
de la combinaison suivante de solvants : éther de mé- ajouté, afin d’éluer la galanthamine ou ses dérivés
thyle et de tertiobutyle, acétonitrile et eau, dans des pro- sous forme basique.
portions volumiques telles que :
20 [0093] Dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé
- le pourcentage volumique de l’acétonitrile ne dépas- susmentionné, juste avant l’injection de la phase mobile
se pas 45%, et organique, la colonne contient en tête, dans les premiè-
- le mélange de ces solvants est biphasique, res cellules de partage, l’échantillon (analyte sous forme
de sel) puis la phase stationnaire aqueuse dans laquelle
et notamment dans les proportions volumiques 4:1:5. 25 le reteneur acide a été ajouté. Ensuite, on injecte la phase
[0087] Selon un mode de réalisation avantageux, le mobile organique contenant le déplaceur basique. Le dé-
procédé de l’invention est caractérisé en ce que la com- placeur basique prend alors le proton du sel de l’analyte
position de départ est un extrait de parties aériennes ou le moins basique de la composition de départ et entraîne
de bulbes d’une Amaryllidaceae, notamment des genres cet analyte (forme amine) dans la phase mobile organi-
Leucojum, Narcissus ou Galanthus, et est de préférence 30 que, qui avance dans la colonne en raison du pompage.
un extrait de feuilles de Leucojum aestivum ou un extrait Ainsi, l’analyte (forme amine) déplacé est protoné par le
de bulbes de Narcissus carlton. reteneur acide lors du contact avec la phase stationnaire
[0088] Selon un mode de réalisation avantageux, le et se retrouve alors sous sa forme de sel dans la phase
procédé de l’invention est caractérisé en ce que la com- stationnaire.
position de départ est un extrait de feuilles de Leucojurn 35 [0094] Le procédé de l’invention correspond donc à un
aestivum et en ce que la combinaison de solvants est la enchaînement de différenties réactions acido-basiques
suivante : toluène, heptane, acétone et eau, dans les pro- qui entraînent le déplacement du composé à purifier en-
portions volumiques 24:8:10:34. tre la phase stationnaire et la phase aqueuse.
[0089] Selon un mode de réalisation avantageux, le [0095] Selon un mode de réalisation avantageux, le
procédé de l’invention est caractérisé en ce que la com- 40 procédé tel que défini ci-dessus, notamment dans le pa-
position de départ est un extrait de bulbes de Narcissus ragraphe ci-dessus, est caractérisé en ce que le rete-
carlton et en ce que la combinaison de solvants est la neur acide est ajouté dans la phase stationnaire.
suivante : éther de méthyle et de tertiobutyle, acétonitrile [0096] La présente invention concerne également un
et eau, dans les proportions volumiques 4:1:5. procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il
[0090] Le procédé de la présente invention peut être 45 comprend les étapes suivantes :
effectué en mode ascendant ou en mode descendant.
Le mode ascendant correspond au cas où la phase mo- - l’injection de la phase stationnaire organique dans
bile est plus légère que la phase stationnaire, tandis que une colonne de chromatographie de partage centri-
le mode descendant correspond au cas où la phase mo- fuge, ladite phase stationnaire contenant un rete-
bile est plus lourde que la phase stationnaire. 50 neur basique tel que défini ci-dessus, afin d’obtenir
[0091] Dans le cadre de la présente invention, la phase une colonne de chromatographie de partage centri-
organique est toujours plus légère que la phase aqueuse, fuge remplie de phase stationnaire alcalinisée,
sauf lorsque la phase organique comprend des solvants - l’injection de la composition de départ, dans laquelle
chlorés, tels que le chloroforme, le dichlorométhane et la galanthamine ou ses dérivés sont sous forme ba-
le dichloro-1,2-éthane. 55 sique, dans la colonne de chromatographie de par-
[0092] La présente invention concerne également un tage centrifuge remplie de phase stationnaire alca-
procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il linisée, pour obtenir une colonne de chromatogra-
comprend les étapes suivantes : phie de partage centrifuge chargée avec ladite pha-

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15 EP 1 824 857 B1 16

se stationnaire alcalinisée et ladite composition de c- Mise en oeuvre de la séparation


départ, et
- l’introduction par pompage de la phase mobile [0101] 2,772 g d’extrait obtenu selon la méthode dé-
aqueuse à travers la colonne telle qu’obtenue à l’éta- crite ci-dessus sont dissous dans 20 ml dé méthanol. La
pe précédente, dans laquelle un déplaceur acide est 5 solution est acidifiée (contrôle au papier pH) par de l’aci-
ajouté, afin d’éluer la galanthamine ou ses dérivés de méthane-sulfonique afin d’ioniser les espèces alca-
sous forme de sels. loïdiques. Le méthanol est ensuite évaporé sous pres-
sion réduite, puis le résidu sirupeux est dissous dans 20
[0097] Selon un mode de réalisation avantageux, le ml de phase stationnaire aqueuse acidifiée et 1 ml de
procédé tel que défini ci-dessus, notamment dans le pa- 10 phase mobile organique neutre.
ragraphe ci-dessus, est caractérisé en ce que le rete- [0102] La colonne est remplie de phase stationnaire
neur basique est ajouté dans la phase stationnaire. (300 tours/min, mode ascendant, 20 ml/min), puis la ro-
tation est fixée à 1700 tours/min. Le volume d’injection
PARTIE EXPÉRIMENTALE est alors introduit dans la colonne via une boucle d’injec-
15 tion, poussé par la phase mobile à 8 ml/min en mode
EXEMPLE 1 - Mode ascendant Leucojum aestivum ascendant. L’élution est poursuivie pendant 2 heures, le
pourcentage de rétention de la phase stationnaire étant
1- Préparation de l’extrait : de 70% et la perte de charge de 68 bars. Aucune fuite
n’est observée. L’effluent est fractionné grâce à un col-
[0098] 1,660 kg de feuilles de Leucojum aestivum 20 lecteur automatique de fractions (SuperFrac Pharma-
broyées (grille 2mm) sont humectés par 1 litre d’ammo- cia). La détection s’effectue en UV (254 nm), et par un
niaque 10% dans l’eau. Le mélange est placé dans un suivi en ligne du pH. La galanthamine est éluée entre les
percolateur puis est mis à macérer dans 30 1 d’acétate fractions 62 et 100. Après évaporation sous pression ré-
d’éthyle pendant 18h. Ensuite, l’acétate d’éthyle est lixi- duite des solvants, on obtient 1,219g de galanthamine
vié jusqu’à épuisement. La solution extractive est extraite 25 base (44% de l’extrait). La pureté avant recristallisation
par 3  3 l puis 3  2l d’eau sulfurique à 3%. La phase a été estimée supérieure à 99% par chromatographie
aqueuse est alcalinisée à pH environ 10 par de l’ammo- sur couche mince (CCM), CLHP puis par RMN 1H et 13C
niaque à 20% dans l’eau. Cette solution aqueuse est (Bruker DRX 500 MHz).
extraite par 2  3l puis 1  2 l de chloroforme. La solution [0103] D’autres composés minoritaires ont été égale-
chloroformique est lavée à l’eau jusqu’à obtenir un pH 30 ment isolés. Il s’agit de : la narwédine, la norgalanthami-
d’environ 7, séchée sur sulfate de sodium puis évaporée ne et de l’ungiminorine.
à siccité sous pression réduite pour obtenir 3,639g d’ex-
trait d’alcaloïdes totaux, soit un rendement de 2,192g/kg EXEMPLE 2 - Mode descendant Leucojum aestivum
de feuilles sèches.
35 a- Système biphasique de solvants:
2- Séparation par Chromatographie de Partage Centri-
fuge, en mode déplacement : [0104] Le système utilisé correspond au mélange to-
luène/heptane/acétone/eau 24:8:10:34 (v/v). Les sol-
a- Appareillage : vants sont agités dans une ampoule à décanter, puis
40 séparés. La phase aqueuse est acidifiée par de l’acide
[0099] L’appareil utilisé est un Chromatographe de méthane-sulfonique (déplaceur) à une concentration de
Partage Centrifuge FCPC Kromaton®, d’une capacité de 8 mM. La phase organique est alcalinisée par de la trié-
200 ml (Kromaton Technologies, Angers, France). thylamine (reteneur) à une concentration de 10 mM. La
phase aqueuse est choisie comme phase mobile, la pha-
b- Système biphasique de solvants : 45 se organique comme phase stationnaire.

[0100] Le système utilisé correspond au mélange to- b- Séparation par CPC


luène/heptane/acétone/eau 24:8:10:34 (v/v). Les sol-
vants sont agités dans une ampoule à décanter, puis [0105] 2,6 g d’extrait obtenu selon la méthode décrite
séparés. La phase aqueuse est acidifiée par de l’acide 50 ci-dessus sont dissous dans 20 ml de phase stationnaire
méthane-sulfonique (reteneur) à une concentration de organique alcalinisée et 1 ml de phase mobile aqueuse
10 mM. La phase organique est alcalinisée par de la trié- neutre.
thylamine (déplaceur) à une concentration de 8 mM. La [0106] La colonne est remplie de phase stationnaire
phase aqueuse est choisie comme phase stationnaire, organique (300 tours/min, mode ascendant, 20 ml/min),
la phase organique comme phase mobile. 55 puis la rotation est fixée à 1700 tours/min. Le volume
d’injection est alors introduit dans la colonne via une bou-
cle d’injection puis poussé par la phase mobile à 8 ml/min
en mode descendant. L’élution est poursuivie pendant 2

9
17 EP 1 824 857 B1 18

heures, le pourcentage de rétention de la phase station- EXEMPLE 4 - Mode descendant Narcissus Carlton
naire étant de 65% et la perte de charge de 67 bars.
Aucune fuite de phase stationnaire n’est observée. L’ef- a- Système biphasique de solvants:
fluent est fractionné grâce à un collecteur automatique
de fractions (SuperFrac Pharmacia). La détection s’ef- 5 [0110] Le système utilisé correspond au mélange
fectue en UV (254 nm), et par un suivi en ligne du pH. éther de méthyle et de tertiobutyle/acétonitrile/ eau 4:1:
L’analyse des fractions par CCM permet de détecter cel- 5 (v/v). Les solvants sont agités dans une ampoule à
les contenant la galanthamine. Elles sont rassemblées, décanter, puis séparés. La phase aqueuse est acidifiée
puis évaporées sous pression réduite. On obtient 1,142g par de l’acide méthane-sulfonique (déplaceur) à une con-
de galanthamine base (44% de l’extrait). La pureté avant 10 centration de 16 mM. La phase organique est alcalinisée
recristallisation a été estimée supérieure à 99% par par de la triéthylamine (reteneur) à une concentration de
CCM, CLHP puis par RMN 1H et 13C (Bruker DRX 500 20 mM. La phase aqueuse est choisie comme phase
MHz). mobile, la phase organique comme phase stationnaire.

EXEMPLE-3 - Mode ascendant Narcissus Carlton 15 b- Séparation par CPC

a- Système biphasique de solvants : [0111] 5 g d’extrait alcaloïdique de bulbes de Narcis-


sus Carlton obtenu selon la méthode décrite ci-dessus
[0107] Le système utilisé correspond au mélange sont dissous dans 20 ml de phase stationnaire organique
éther de méthyle et de tertiobutyle/acétonitrile/ eau 4:1: 20 alcalinisée et 1 ml de phase mobile aqueuse neutre.
5 (v/v). Les solvants sont agités dans une ampoule à [0112] La colonne est remplie de phase stationnaire
décanter, puis séparés. La phase aqueuse est acidifiée (300 tours/min, mode ascendant, 20 ml/min), puis la ro-
par de l’acide méthane-sulfonique (reteneur) à une con- tation est fixée à 1200 tours/min. Le volume d’injection
centration de 20 mM. La phase organique est alcalinisée est alors introduit dans la colonne via une boucle d’injec-
par de la triéthylamine (déplaceur) à une concentration 25 tion, poussé par la phase mobile à 8 ml/min (mode des-
de 16 mM. La phase aqueuse est choisie comme phase cendant). L’élution est poursuivie pendant 2 heures, le
stationnaire, la phase organique comme phase mobile. pourcentage de rétention de la phase stationnaire étant
de 61% et la perte de charge de 47 bars. Aucune fuite
b- Séparation par CPC de phase stationnaire n’est observée. L’effluent est frac-
30 tionné grâce à un collecteur automatique de fractions
[0108] 5g d’extrait alcaloïdique de bulbes de Narcissus (SuperFrac Pharmacia). La détection s’effectue en UV
Carlton obtenu selon la méthode décrite ci-dessus sont (254 nm), et par un suivi en ligne du pH. La galanthamine
dissous dans 20 ml de méthanol. La solution est acidifiée est éluée entre 71 et 127 minutes. Après évaporation
à pH environ 3 (contrôle au papier pH) par de l’acide sous pression réduite des solvants, on obtient 2,650g de
methane-sulfonique afin d’ioniser les espèces alcaloïdi- 35 galanthamine sous forme de méthanesulfonate. La pu-
ques. Le méthanol est ensuite évaporé sous pression reté avant recristallisation a été estimée supérieure à
réduite, puis le résidu sirupeux est dissous dans 20 ml 99% par CCM, CLHP puis par RMN 1H et 13C (Bruker
de phase stationnaire aqueuse acidifiée et 1 ml de phase DRX 500 MHz).
mobile organique neutre.
[0109] La colonne est remplie de phase stationnaire 40 EXEMPLE 5 - Mode ascendant Narcissus Carlton
(300 tours/min, mode ascendant, 20 ml/min), puis la ro- (sans reteneur)
tation est fixée à 1200 tours/min. Le volume d’injection
est alors introduit dans la colonne via une boucle d’injec- a- Système biphasique de solvants :
tion, poussé par la phase mobile à 8 ml/min en mode
ascendant. L’élution est poursuivie pendant 3 heures, le 45 [0113] Le système utilisé correspond au mélange
pourcentage de rétention de la phase stationnaire étant éther de méthyle et de tertiobutyle/acétonitrile/ eau 4:1:
de 66% et la perte de charge de 42 bars. Aucune fuite 5 (v/v). Les solvants sont agités dans une ampoule à
de phase stationnaire n’est observée. L’effluent est frac- décanter, puis séparés. La phase organique est alcalini-
tionné grâce à un collecteur automatique de fractions sée par de la triéthylamine à une concentration de 16
(SuperFrac Pharmacia). La détection s’effectue en UV 50 mM. La phase organique reste neutre. La phase aqueuse
(254 nm), et par un suivi en ligne du pH. La galanthamine est choisie comme phase stationnaire, la phase organi-
est éluée entre 80 et 135 minutes. Après évaporation que comme phase mobile.
sous pression réduite des solvants, on obtient 2,031 g
de galanthamine base (forme amine). La pureté avant b- Séparation par CPC
recristallisation a été estimée supérieure à 99% par 55
CCM, CLHP puis par RMN 1H et 13C (Bruker DRX 500 [0114] 5 g d’extrait alcaloïdique de bulbes de Narcis-
MHz). sus Carlton obtenu selon la méthode décrite ci-dessus
sont dissous dans 20 ml de méthanol. La solution est

10
19 EP 1 824 857 B1 20

acidifiée à pH environ 3 (contrôle au papier pH) par de 1-11,


l’acide methane-sulfonique afin d’ioniser les espèces al- - Weisz, A., Scher, A., Shinomiya, K., Fales, H.M., Ito,
caloïdiques. Le méthanol est ensuite évaporé sous pres- Y. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116, 704-708.
sion réduite, puis le résidu sirupeux est dissous dans 20
ml de phase stationnaire aqueuse acidifiée et 1 ml de 5
phase mobile organique neutre. Revendications
[0115] La colonne est remplie de phase stationnaire
(300 tours/min, mode ascendant, 20 ml/min), puis la ro- 1. Utilisation d’un procédé de chromatographie de par-
tation est fixée à 1200 tours/min. Le volume d’injection tage centrifuge en mode déplacement, pour la mise
est alors introduit dans la colonne via une boucle d’injec- 10 en oeuvre d’un procédé de purification de la galan-
tion, poussé par la phase mobile à 8 ml/min. L’élution est thamine ou de ses dérivés, à partir d’une composi-
poursuivie pendant 110 minutes, le pourcentage de ré- tion de départ, contenant au moins 20% de galanth-
tention de la phase stationnaire étant de 67% et la perte amine ou de ses dérivés, ledit procédé comprenant
de charge de 41 bars. Aucune fuite de phase stationnaire une étape de centrifugation d’une combinaison d’au
n’est observée. L’effluent est fractionné grâce à un col- 15 moins deux solvants et de ladite composition de dé-
lecteur automatique de fractions (SuperFrac Pharma- part, pendant un temps suffisant pour purifier la ga-
cia). La détection s’effectue en UV (254 nm), et par un lanthamine ou ses dérivés,
suivi en ligne du pH. La galanthamine est éluée entre 45 lesdits solvants étant tels qu’ils forment deux phases
et 100 minutes. Après évaporation sous pression réduite non miscibles, à savoir une phase aqueuse et une
des solvants, on obtient 1,660 g de galanthamine base. 20 phase organique, la phase aqueuse servant de pha-
La pureté avant recristallisation a été estimée supérieure se mobile ou de phase stationnaire, et la phase or-
à 99% par CCM, CLHP puis par RMN 1H et 13C (Bruker ganique servant respectivement de phase station-
DRX 500 MHz). naire ou de phase mobile, la phase mobile contenant
un déplaceur qui est un acide ou une base.
RÉFÉRENCES 25
2. Procédé de purification de la galanthamine ou de
[0116] ses dérivés à partir d’une composition de départ,
contenant au moins 20% de galanthamine ou de ses
- Berthod, A. (2002) Ed. Countercurrent chromatog- dérivés, par chromatographie de partage centrifuge
raphy - The support-free liquid phase, Elsevier Sci- 30 en mode déplacement, ledit procédé comprenant
ence B.V., une étape de centrifugation
- Foucault, A.P. (1994) Ed. Centrifugal Partition Chro-
matography - Theory and Practice, Marcel Dekker, - d’une combinaison d’au moins deux solvants,
New York, et de préférence d’au moins trois solvants, et
- Intes, O., Renault, J.H., Sinquin, C., Zèches-Hanrot, 35 - de ladite composition de départ
M., Nuzillard, J.M. (2001) J. Chromatography A.,
918, 47-57, pendant un temps suffisant pour purifier la galanth-
- Ito, Y. (1995) Modern Countercurrent Chromatogra- amine ou ses dérivés,
phy, lesdits solvants étant tels qu’ils forment deux phases
- Ito, Y., Ma, Y. (1996) J. Chromatography A., 753, 40 non miscibles, à savoir une phase aqueuse et une
1-36, phase organique, la phase aqueuse servant de pha-
- Maciuk; A, Renault, J.H., Margraff, R., Trébuchet, se mobile ou de phase stationnaire, et la phase or-
P., Zèches-Hanrot, M., Nuzillard, J.M. (2004) Anal. ganique servant respectivement de phase station-
Chem., 76, 6179-6186; naire ou de phase mobile, la phase mobile contenant
- Marchal L., Intes, O., Foucault, A., Legrand, J., Nuz- 45 un déplaceur qui est un acide ou une base.
illard, J.M., Renault, J.H. (2003) J. Chromatography
A., 1005, 51-62, 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en
- Margraff, R. (1994) Ed. Centrifugal Partition Chro- ce que la composition de départ est un extrait de
matography, Chromatographic Sciences Series, vol. plante ou de la matière biologique produisant de la
68, Marcel Dekker, New York, ch. 12, p. 331-353, 50 galanthamine ou ses dérivés, telle que des cellules
- Renault, J.H., Nuzillard, J.M., Le Crouéour, G., de plantes, ou un mélange de composés obtenu par
Thépenier, P., Zèches-Hanrot, M., Le Men-Oliver, L. synthèse organique contenant notamment de la ga-
(1999) J. Chromatography A., 849, 421-431, lanthamine et/ou ses dérivés, ledit extrait de plante
- Renault, J.H., Nuzillard, J.M., Intes, O., Maciuk, A. ou ladite matière biologique ou ledit mélange étant
(2002) Countercurrent chromatography, Compre- 55 dissous dans la phase mobile ou la phase station-
hensive Analytical Chemistry, vol. 38, Elsevier, Am- naire.
sterdam, ch. 3, p. 49-83,
- Tiselius, A. (1943) Arkiv for Kemi och Geologo, 16A, 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé

11
21 EP 1 824 857 B1 22

en ce que les deux phases liquides non miscibles ganique est une base.
correspondent à une combinaison d’au moins deux
solvants, à savoir de l’eau et un solvant non miscible 9. Procédé selon l’une des revendications 2 à 7, ca-
ou partiellement miscible à l’eau, et forment ainsi ractérisé en ce que la phase stationnaire corres-
une phase aqueuse et une phase organique. 5 pond à la phase organique et la phase mobile cor-
respond respectivement à la phase aqueuse, et en
5. Procédé selon l’une des revendications 2 à 4, ca- ce que le déplaceur contenu dans la phase mobile
ractérisé en ce que les deux phases liquides non aqueuse est un acide.
miscibles correspondent à un mélange d’au moins
trois solvants, à savoir de l’eau, un solvant non mis- 10 10. Procédé selon l’une des revendications 2 à 9, ca-
cible ou partiellement miscible à l’eau et un "solvant ractérisé en ce qu’un reteneur est :
pont", ledit solvant pont étant un solvant partielle-
ment ou totalement soluble dans l’eau et dans le . soit ajouté dans la composition de départ ou
solvant non miscible ou partiellement miscible à dans la phase stationnaire,
l’eau, 15 . soit est un élément de la composition de départ,
lesdits solvants étant tels qu’ils forment un système
biphasique comprenant une phase aqueuse et une ledit reteneur étant un acide ou une base.
phase organique.
11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé 20 ce qu’on ajoute dans la composition de départ ou
en ce que le solvant non miscible ou partiellement dans la phase stationnaire un reteneur, qui est un
miscible à l’eau est choisi parmi : acide.

- les éthers tels que l’éther de méthyle et de ter- 12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en
tiobutyle (MTBE) et l’éther d’éthyle et de tertio- 25 ce qu’on ajoute dans la composition de départ ou
butyle, dans la phase stationnaire un reteneur, qui est une
- les cétones non miscibles à l’eau telles que la base.
méthyléthylcétone (MEK) et la méthylisobutyl-
cétone (MIBK), 13. Procédé selon l’une des revendications 2 à 12, com-
- les hydrocarbures aromatiques tels que le to- 30 prenant les étapes suivantes :
luène,
- les hydrocarbures aliphatiques tels que l’hexa- - l’injection de la phase stationnaire dans une
ne, l’heptane et les cyclohexanes, colonne de chromatographie de partage centri-
- les éthers de pétrole, fuge, ladite phase stationnaire contenant un re-
- les alcools lourds dont la chaîne carbonée 35 teneur tel que défini dans la revendication 10,
comprend au moins 4 atomes de carbone, tels afin d’obtenir une colonne de chromatographie
que le n-butanol, le 2-butanol et l’isobutanol, de partage centrifuge remplie de phase station-
- les siloxanes non miscibles à l’eau tels que naire,
l’hexaméthyldisiloxane, - l’injection de la composition de départ telle que
- les solvants halogénés non miscibles à l’eau, 40 définie dans l’une des revendications 2 à 12
tels que le chloroforme, le dichlorométhane et dans la colonne de chromatographie de partage
le dichloro-1,2-éthane, ou centrifuge remplie de phase stationnaire, pour
- les esters tels que l’acétate d’éthyle et l’acétate obtenir une colonne de chromatographie de par-
de butyle. tage centrifuge chargée avec ladite phase sta-
45 tionnaire et ladite composition de départ, et
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en - l’introduction par pompage dans la colonne tel-
ce que le solvant "pont" est choisi parmi : les alcools le qu’obtenue à l’étape précédente, de la phase
légers dont la chaîne carbonée comprend moins de mobile dans laquelle un déplaceur est ajouté tel-
4 atomes de carbone tels que le méthanol, l’éthanol, le que définie dans la revendication 8 ou 9, afin
les propanols, l’acétonitrile, l’acétone, le tétrahydro- 50 d’éluer la galanthamine ou ses dérivés.
furanne, le diméthylsulfoxyde et le diméthylformami-
de. 14. Procédé selon l’une des revendications 1 à 13, ca-
ractérisé en ce que le déplaceur est choisi parmi :
8. Procédé selon l’une des revendications 2 à 7, ca-
ractérisé en ce que la phase stationnaire corres- 55 - les acides minéraux tels que HCl ou H2SO4,
pond à la phase aqueuse et la phase mobile corres- - les acides organiques tels que l’acide métha-
pond respectivement à la phase organique, et en ce ne-sulfonique, l’acide trifluoroacétique, l’acide
que le déplaceur contenu dans la phase mobile or- acétique, l’acide tartrique ou l’acide citrique,

12
23 EP 1 824 857 B1 24

- les bases minérales telles que l’ammoniac ou Narcissus ou Galanthus, et est de préférence un ex-
la soude, ou trait de feuilles de Leucojum aestivum ou un extrait
- les bases organiques telles que la triéthylami- de bulbes de Narcissus carlton.
ne.
5 20. Procédé selon l’une des revendications 2 à 19, ca-
15. Procédé selon l’une des revendications 10 à 14, ca- ractérisé en ce que la composition de départ est
ractérisé en ce que le reteneur est choisi parmi : un extrait de feuilles de Leucojum aestivum et en ce
que la combinaison de solvants est la suivante : to-
- les bases minérales telles que l’ammoniac ou luène, heptane, acétone et eau, dans les proportions
la soude, ou 10 volumiques 24:8:10:34.
- les bases organiques telles que la triéthylami-
ne. 21. Procédé selon l’une des revendications 2 à 19, ca-
- les acides minéraux tels que HCl ou H2SO4, ractérisé en ce que la composition de départ est
- les acides organiques tels que l’acide métha- un extrait de bulbes de Narcissus carlton et en ce
ne-sulfonique, l’acide trifluoroacétique, l’acide 15 que la combinaison de solvants est la suivante :
acétique, l’acide tartrique ou l’acide citrique, éther de méthyle et de tertiobutyle, acétonitrile et
eau, dans les proportions volumiques 4:1:5.
16. Procédé selon l’une des revendications 2 à 15, com-
prenant l’utilisation d’une combinaison des solvants 22. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en
suivants : 20 ce qu’il comprend les étapes suivantes :

• toluène, heptane, acétone et eau, ou - l’injection de la phase stationnaire aqueuse


• éther de méthyle et de tertiobutyle, acétonitrile dans une colonne de chromatographie de par-
et eau, ou tage centrifuge, ladite phase stationnaire conte-
• éther de méthyle et de tertiobutyle, acétone et 25 nant un reteneur acide tel que défini dans la re-
eau, ou vendication 11, afin d’obtenir une colonne de
• méthylisobutylcétone, acétone et eau. chromatographie de partage centrifuge remplie
de phase stationnaire acidifiée,
17. Procédé selon la revendication 16, comprenant l’uti- - l’injection de la composition de départ, dans
lisation de la combinaison suivante de solvants : to- 30 laquelle la galanthamine ou ses dérivés sont
luène, heptane, acétone et eau, dans des propor- sous forme de sels, dans la colonne de chroma-
tions volumiques telles que : tographie de partage centrifuge remplie de pha-
se stationnaire acidifiée, pour obtenir une colon-
- le pourcentage volumique du toluène est su- ne de chromatographie de partage centrifuge
périeur à celui de l’heptane, 35 chargée avec ladite phase stationnaire acidifiée
- le pourcentage volumique de l’acétonitrile ne et ladite composition de départ, et
dépasse pas 50%, et - l’introduction par pompage de la phase mobile
- le mélange de ces solvants est biphasique, organique à travers la colonne telle qu’obtenue
à l’étape précédente, dans laquelle un dépla-
et notamment dans les proportions volumiques 24: 40 ceur basique est ajouté, afin d’éluer la galanth-
8:10:34. amine ou ses dérivés sous forme basique.

18. Procédé selon la revendication 16, comprenant l’uti- 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en
lisation de la combinaison suivante de solvants : ce que le reteneur acide est ajouté dans la phase
éther de méthyle et de tertiobutyle, acétonitrile et 45 stationnaire.
eau, dans des proportions volumiques telles que :
24. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en
- le pourcentage volumique de l’acétonitrile ne ce qu’il comprend les étapes suivantes :
dépasse pas 45%, et
- le mélange de ces solvants est biphasique, 50 - l’injection de la phase stationnaire organique
dans une colonne de chromatographie de par-
et notamment dans les proportions volumiques 4:1: tage centrifuge, ladite phase stationnaire conte-
5. nant un reteneur basique tel que défini dans la
revendication 12, afin d’obtenir une colonne de
19. Procédé selon l’une des revendications 2 à 18, ca- 55 chromatographie de partage centrifuge remplie
ractérisé en ce que la composition de départ est de phase stationnaire alcalinisée,
un extrait de parties aériennes ou de bulbes d’une - l’injection de la composition de départ, dans
Amaryllidaceae, notamment des genres Leucojum, laquelle la galanthamine ou ses dérivés sont

13
25 EP 1 824 857 B1 26

sous forme basique, dans la colonne de chro- the starting composition is a plant extract or biolog-
matographie de partage centrifuge remplie de ical material producing galanthamine or its deriva-
phase stationnaire alcalinisée, pour obtenir une tives, such as plant cells, or a mixture of compounds
colonne de chromatographie de partage centri- obtained by organic synthesis containing in particu-
fuge chargée avec ladite phase stationnaire al- 5 lar galanthamine and/or its derivatives, said plant ex-
calinisée et ladite composition de départ, et tract or said biological material or said mixture being
- l’introduction par pompage de la phase mobile dissolved in the mobile phase or the stationary
aqueuse à travers la colonne telle qu’obtenue à phase.
l’étape précédente, dans laquelle un déplaceur
acide est ajouté, afin d’éluer la galanthamine ou 10 4. Process according to claim 2 or 3, characterized in
ses dérivés sous forme de sels. that the two non-miscible liquid phases correspond
to a combination of at least two solvents, namely
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en water and a solvent which is non-miscible or partially
ce que le reteneur basique est ajouté dans la phase miscible with water, thus forming an aqueous phase
stationnaire. 15 and an organic phase.

5. Process according to one of claims 2 to 4, charac-


Claims terized in that the two non-miscible liquid phases
correspond to a mixture of at least three solvents,
1. Use of a process of centrifugal partition chromatog- 20 namely water, a solvent which is non-miscible or par-
raphy in displacement mode, for the implementation tially miscible with water and a "bridge solvent", said
of a process for the purification of galanthamine or bridge solvent being a solvent partially or totally sol-
its derivatives, from a starting composition, contain- uble in water and in the solvent which is non-miscible
ing at least 20% of galanthamine or its derivatives, or partially miscible with water,
said process comprising a stage of centrifuging a 25 said solvents being such that they form a biphasic
combination of at least two solvents and said starting system comprising an aqueous phase and an organ-
composition, for a sufficient time to purify galan- ic phase.
thamine or its derivatives,
said solvents being such that they form two non-mis- 6. Process according to claim 4 or 5, characterized in
cible phases, namely an aqueous phase and an or- 30 that the solvent which is non-miscible or partially
ganic phase, the aqueous phase serving as the mo- miscible with water is chosen from:
bile phase or the stationary phase, and the organic
phase serving respectively as the stationary phase - ethers such as methyl tert-butyl ether (MTBE)
or the mobile phase, the mobile phase containing an and ethyl tert-butyl ether,
acidic or basic displacing agent. 35 - ketones which are non-miscible with water
such as methyl ethyl ketone (MEK) and the me-
2. Process for the purification of galanthamine or its thyl isobutyl ketone (MIBK),
derivatives from a starting composition, containing - aromatic hydrocarbons such as toluene,
at least 20% of galanthamine or its derivatives, by - aliphatic hydrocarbons such as hexane, hep-
centrifugal partition chromatography in displace- 40 tane and the cyclohexanes,
ment mode, said process comprising a stage of cen- - petroleum ethers,
trifuging - heavy alcohols the carbon-containing chain of
which comprises at least 4 carbon atoms, such
- a combination of at least two solvents, and pref- as n-butanol, 2-butanol and isobutanol,
erably of at least three solvents, and 45 - siloxanes which are non-miscible with water
- said starting composition such as hexamethyldisiloxane,
- halogenated solvents which are non-miscible
for a sufficient time to purify galanthamine or its de- with water, such as chloroform, dichlorometh-
rivatives, ane and dichloro-1,2-ethane, or
said solvents being such that they form two non-mis- 50 - esters such as ethyl acetate and butyl acetate.
cible phases, namely an aqueous phase and an or-
ganic phase, the aqueous phase serving as the mo- 7. Process according to claim 5, characterized in that
bile phase or the stationary phase, and the organic the "bridge" solvent is chosen from: light alcohols
phase serving respectively as the stationary phase the carbon-containing chain of which comprises less
or the mobile phase, the mobile phase containing an 55 than 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, pro-
acidic or basic displacing agent. panols, acetonitrile, acetone, tetrahydrofuran,
dimethylsulphoxide and dimethylformamide.
3. Process according to claim 2, characterized in that

14
27 EP 1 824 857 B1 28

8. Process according to one of claims 2 to 7, charac- trifluoroacetic acid, acetic acid, tartaric acid or
terized in that the stationary phase corresponds to citric acid,
the aqueous phase and the mobile phase corre- - mineral bases such as ammonia or soda, or
sponds respectively to the organic phase, and in that - organic bases such as the triethylamine.
the displacing agent contained in the organic mobile 5
phase is a base. 15. Process according to one of claims 10 to 14, char-
acterized in that the retaining agent is chosen from:
9. Process according to one of claims 2 to 7, charac-
terized in that the stationary phase corresponds to - mineral bases such as ammonia or soda, or
the organic phase and the mobile phase corre- 10 - organic bases such as triethylamine.
sponds respectively to the aqueous phase, and in - mineral acids such as HCl or H2SO4,
that the displacing agent contained in the aqueous - organic acids such as methanesulphonic acid,
mobile phase is an acid. trifluoroacetic acid, acetic acid, tartaric acid or
citric acid,
10. Process according to one of claims 2 to 9, charac- 15
terized in that a retaining agent is: 16. Process according to one of claims 2 to 15, compris-
ing the use of a combination of the following solvents:
. either added in the starting composition or in
the stationary phase, • toluene, heptane, acetone and water, or
. or is an element of the starting composition, 20 • methyl tert-butyl ether, acetonitrile and water,
or
said retaining agent being an acid or a base. • methyl tert-butyl ether, acetone and water, or
• methyl isobutyl ketone, acetone and water.
11. Process according to claim 8, characterized in that
a retaining agent, which is an acid, is added in the 25 17. Process according to claim 16, comprising the use
starting composition or in the stationary phase. of the following combination of solvents: toluene,
heptane, acetone and water, in volume proportions
12. Process according to claim 9, characterized in that such that:
a retaining agent, which is a base, is added in the
starting composition or in the stationary phase. 30 - the volume percentage of the toluene exceeds
that of the heptane,
13. Process according to one of claims 2 to 12, compris- - the volume percentage of the acetonitrile does
ing the following stages: not exceed 50%, and
- the mixture of these solvents is biphasic,
- the injection of the stationary phase into a cen- 35
trifugal partition chromatography column, said and in particular in the volume proportions 24:8:10:
stationary phase containing a retaining agent as 34.
defined in claim 10, in order to obtain a centrif-
ugal partition chromatography column filled with 18. Process according to claim 16, comprising the use
stationary phase, 40 of the following combination of solvents: methyl tert-
- the injection of the starting composition as de- butyl ether, acetonitrile and water, in volume propor-
fined in one of claims 2 to 12 into the centrifugal tions such that:
partition chromatography column filled with sta-
tionary phase, in order to obtain a centrifugal - the volume percentage of the acetonitrile does
partition chromatography column loaded with 45 not exceed 45%, and
said stationary phase and said starting compo- - the mixture of these solvents is biphasic,
sition, and
- the introduction by pumping into the column as and in particular in the volume proportions 4:1:5.
obtained in the previous stage, of the mobile
phase in which a displacing agent is added as 50 19. Process according to one of claims 2 to 18, charac-
defined in claim 8 or 9, in order to elute galan- terized in that the starting composition is an extract
thamine or its derivatives. of aerial parts or bulbs of Amaryllidaceae, in partic-
ular of the genus Leucojum, Narcissus or Galanthus,
14. Process according to one of claims 1 to 13, charac- and is preferably an extract of leaves of Leucojum
terized in that the displacing agent is chosen from: 55 aestivum or an extract of bulbs of Narcissus carlton.

- mineral acids such as HCl or H2SO4, 20. Process according to one of claims 2 to 19, charac-
- organic acids such as methanesulphonic acid, terized in that the starting composition is an extract

15
29 EP 1 824 857 B1 30

of leaves of Leucojum aestivum and in that the com- in the previous stage, in which an acidic displac-
bination of solvents is as follows: toluene, heptane, ing agent is added, in order to elute galan-
acetone and water, in the volume proportions 24:8: thamine or its derivatives in the form of salts.
10:34.
5 25. Process according to claim 24, characterized in
21. Process according to one of claims 2 to 19, charac- that the basic retaining agent is added in the sta-
terized in that the starting composition is an extract tionary phase.
of bulbs of Narcissus carlton and in that the combi-
nation of solvents is as follows: methyl tert-butyl
ether, acetonitrile and water, in the volume propor- 10 Patentansprüche
tions 4:1:5.
1. Verwendung eines Verfahrens der zentrifugalen
22. Process according to claim 11, characterized in Verteilungschromatographie im Verdrängungsmo-
that it comprises the following stages: dus zum Durchführen eines Verfahrens zur Reini-
15 gung von Galanthamin oder Galanthamindderiva-
- the injection of the aqueous stationary phase ten, ausgehend von einer Ausgangszusammenset-
into a centrifugal partition chromatography col- zung, die mindestens 20 % Galanthamin oder Ga-
umn, said stationary phase containing an acidic lanthamindderivate enthält, wobei das Verfahren ei-
retaining agent as defined in claim 11, in order nen Schritt des Zentrifugierens einer Kombination
to obtain a centrifugal partition chromatography 20 aus mindestens zwei Lösemitteln und dieser Aus-
column filled with acidified stationary phase, gangszusammensetzung umfasst, während eines
- the injection of the starting composition, in Zeitraums, der ausreicht, um das Galanthamin oder
which galanthamine or its derivatives are in the die Galanthaminderivate zu reinigen, wobei die Lö-
form of salts, into the centrifugal partition chro- semittel derart sind, dass sie zwei nicht mischbare
matography column filled with acidified station- 25 Phasen bilden, nämlich eine wässrige Phase und
ary phase, in order to obtain a centrifugal parti- eine organische Phase, wobei die wässrige Phase
tion chromatography column loaded with said als mobile Phase oder als stationären Phase dient,
acidified stationary phase and said starting com- und die organische Phase entsprechend als statio-
position, and näre Phase bzw. mobile Phase dient, wobei die mo-
- the introduction by pumping of the organic mo- 30 bile Phase ein Verdrängungsmittel enthält, das eine
bile phase through the column as obtained in Säure oder eine Base ist.
the previous stage, in which a basic displacing
agent is added, in order to elute galanthamine 2. Verfahren zur Reinigung von Galanthamin oder Ga-
or its derivatives in basic form. lanthamindderivaten ausgehend von einer Aus-
35 gangszusammensetzung, die mindestens 20 % Ga-
23. Process according to claim 22, characterized in lanthamin oder Galanthamindderivate enthält, durch
that the acidic retaining agent is added in the sta- zentrifugale Verteilungschromatographie im Ver-
tionary phase. drängungsmodus, wobei das Verfahren einen
Schritt des Zentrifugierens
24. Process according to claim 12, characterized in 40
that it comprises the following stages: - einer Kombination aus mindestens zwei Löse-
mitteln, und bevorzugt mindestens drei Lösemit-
- the injection of the organic stationary phase teln und
into a centrifugal partition chromatography col- - der Ausgangszusammensetzung während ei-
umn, said stationary phase containing a basic 45 nes Zeitraums umfasst, der ausreicht, um das
retaining agent as defined in claim 12, in order Galanthamin oder die Galanthamindderivate zu
to obtain a centrifugal partition chromatography reinigen,
column filled with alkalinized stationary phase,
- the injection of the starting composition, in wobei die Lösemittel derart sind, dass sie zwei nicht
which galanthamine or its derivatives are in ba- 50 mischbare Phasen bilden, nämlich eine wässrige
sic form, into the centrifugal partition chroma- Phase und eine organische Phase, wobei die wäss-
tography column filled with alkalinized stationary rige Phase als mobile Phase oder als stationäre Pha-
phase, in order to obtain a centrifugal partition se dient, und die organische Phase entsprechend
chromatography column loaded with said alka- als stationäre Phase bzw. als mobile Phase dient,
linized stationary phase and said starting com- 55 wobei die mobile Phase ein Verdrängrngsmittel ent-
position, and hält, das eine Säure oder eine Base ist.
- the introduction by pumping of the aqueous
mobile phase through the column as obtained 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn-

16
31 EP 1 824 857 B1 32

zeichnet, dass die Ausgangszusammensetzung 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn-


ein Pflanzenextrakt oder ein biologisches Material zeichnet, dass das "Brückenlösemittel" ausgewählt
ist, der (das) Galanthamin oder Galanthamindderi- ist aus: leichten Alkoholen, deren Kohlenstoffkette
vate produziert, wie etwa Pflanzenzelle oder ein mindestens 4 Kohlenstoffatome umfasst, wie etwa
durch organische Synthese erhaltenes Verbin- 5 Methanol, Ethanol, Propanole, Acetonitril, Aceton,
dungsgemisch, das insbesondere Galanthamin und/ Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Dimethyl-
oder Galanthamindderivate enthält, wobei der Pflan- formamid.
zenextrakt oder das biologische Material oder das
Gemisch in der mobilen Phase oder der stationären 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, da-
Phase gelöst sind. 10 durch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase
der wässrigen Phase entspricht und die mobile Pha-
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch ge- se entsprechend der organischen Phase entspricht,
kennzeichnet, dass die zwei nicht mischbaren, und dadurch, dass das Verdrängungsmittel, das in
flüssige Phasen einer Kombination aus mindestens der organischen mobilen Phase enthalten ist, eine
zwei Lösemitteln entsprechen, nämlich Wasser und 15 Base ist.
einem Lösemittel, das nicht oder teilweise mit Was-
ser mischbar ist, und so eine wässrige Phase und 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, da-
eine organische Phase bilden. durch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase
der organischen Phase entspricht und die mobile
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, da- 20 Phase entsprechend der wässrigen Phase ent-
durch gekennzeichnet, dass die beiden nicht spricht, und dadurch, dass das Verdrängungsmittel,
mischbaren flüssigen Phasen einem Gemisch aus das in der wässrigen mobilen Phase enthalten ist,
mindestens drei Lösemitteln entsprechen, nämlich eine Säure ist.
Wasser, einem Lösemittel, das nicht oder teilweise
mit Wasser mischbar ist, und einem "Brückenlöse- 25 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, da-
mittel", wobei das Brückenlösemittel ein Lösemittel durch gekennzeichnet, dass ein Retentionsmittel:
ist, das teilweise oder vollständig in wasser und dem
Lösemittel löslich ist, das nicht oder teilweise mit • entweder der Ausgangszusammensetzung
Wasser mischbar ist, wobei die Lösemittel derart oder der stationären Phase zugegeben wird
sind, dass sie ein zweiphasiges System bilden, das 30 • oder ein Element der Ausgangszusammenset-
eine wässrige Phase und ein organische Phase um- zung ist,
fasst.
wobei das Retentionsmittel eine Säure oder eine Ba-
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch ge- se ist.
kennzeichnet, dass das Lösemittel, das nicht oder 35
teilweise mit Wasser mischbar ist, ausgewählt ist 11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn-
aus: zeichnet, dass der Ausgangzusammensetzung
oder der stationären Phase ein Retentionsmittel zu-
- Ethern, wie etwa tert-Butylmethylether (MTBE) gegeben wird, das eine Säure ist.
und tert-Butylethylether, 40
- Ketonen, die nicht mit Wasser mischbar sind, 12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn-
wie etwa Methylethylketon (MEK) und Me- zeichnet, dass der Ausgangzusammensetzung
thylisobutylketon (MIBK), oder der stationären Phase ein Retentionsmittel zu-
- aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie etwa gegeben wird, das eine Base ist.
Toluen, 45
- aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie etwa 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, das
Hexan, Heptan und den Cyclohexanen, die folgenden Schritte umfasst:
- Petrolethern,
- schweren Alkoholen, deren Kohlenstoffkette - Injizieren der stationären Phase in eine zentri-
mindestens 4 Kohlenstoffatome umfasst, wie et- 50 fugale Verteilungschromatographiesäule, wo-
wa n-Butancl, 2-Butanol und Isobutanol, bei die stationäre Phase ein Retentionsmittel
- Siloxanen, die nicht mit Wasser mischbar sind, enthält, wie in Anspruch 10 definiert, um eine
wie etwa Hexamethyldisiloxan, zentrifugale Verteilungschromatographiesäule
- halogenierten Lösemitteln, die nicht mit Was- zu erhalten, die mit der stationären Phase gefüllt
ser mischbar sind, wie etwa Chloroform, Dich- 55 ist,
lormethan und Dichlor-1,2-ethan, oder - Injizieren der Ausgangszusammensetzung,
- Estern, wie etwa Ethylacetat und Butylacetat. wie in einem der Ansprüche 2 bis 12 definiert,
in die zentrifugale Verteilungschromatographie-

17
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säule, die mit der stationären Phase gefüllt ist, - das Gemisch aus diesen Lösemitteln zweipha-
um eine zentrifugale Verteilungschromatogra- sig ist,
phiesäule zu erhalten, die mit der stationären
Phase und der Ausgangszusammensetzung und insbesondere in den Volumenanteilen 24:8: 10:
beladen ist, und 5 34.
- Einführen durch Pumpen der mobilen Phase,
der ein Verdrängungsmittel zugegeben wird, 18. Verfahren nach Anspruch 16, das die Verwendung
wie in Anspruch 8 oder 9 definiert, in die im vor- der folgenden Kombination von Lösemittel umfasst:
hergehenden Schritt erhaltene Säule, um das tert-Butylmethylether, Acetonitril und Wasser in den
Galanthamin oder die Galanthamindderivate zu 10 Volumenanteilen, so dass
eluieren.
- der Volumenprozentanteil des Acetonitrils 45
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, da- % nicht übersteigt, und
durch gekennzeichnet, dass das Verdrängungs- - das Gemisch aus diesen Lösemitteln zweipha-
mittel ausgewählt ist aus: 15 sig ist,

- mineralischen Säuren, wie etwa HCl oder und insbesondere in den Volumenanteilen 4:1:5.
H2SO4,
- organischen Säuren, wie etwa Methansulfon- 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 18, da-
säure, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Wein- 20 durch gekennzeichnet, dass die Ausgangszu-
säure oder Citronensäure, sammensetzung ein Extrakt der oberirdischen Teile
- mineralischen Basen, wie etwa Ammoniak oder der Zwiebeln einer Amaryllidaceae, insbeson-
oder Soda, oder dere der Gattungen Leucojum, Narcissus oder Ga-
- organischen Basen, wie etwa Triethylamin. lanthus, und bevorzugt ein Extrakt der Blätter von
25 Leucojum aestivum oder ein Extrakt der Zwiebeln
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, da- von Narcissus carlton ist.
durch gekennzeichnet, dass das Retentionsmittel
ausgewählt ist aus: 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 19, da-
durch gekennzeichnet, dass die Ausgangszu-
- mineralischen Basen, wie etwa Ammoniak 30 sammensetzung ein Extrakt der Blätter von Leuco-
oder Soda, oder jum aestivum ist und dadurch, dass die Kombinati-
- organischen Basen, wie etwa Triethylamin, on der Lösemittel Folgende ist: Toluen, Heptan, Ace-
- mineralischen Säuren, wie etwa HCl oder ton und Wasser in den Volumenanteilen 24:8:10:34.
H2SO4,
- organischen Säuren, wie etwa Methansulfon- 35 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 19, da-
säure, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Wein- durch gekennzeichnet, dass die Ausgangszu-
säure oder Citronensäure. sammensetzung ein Extrakt der Zwiebeln von Nar-
cissus carlton ist und dadurch, dass die Kombina-
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, das tion der Lösemittel Folgende ist: Tert-Butylmethyle-
die Verwendung einer Kombination folgender Löse- 40 ther, Acetonitril und Wasser in den Volumenanteilen
mittel umfasst: 4:1:5.

- Toluen, Heptan, Aceton und Wasser, oder 22. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenn-
- tert-Butylmethylether, Acetonitril und Wasser, zeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
oder 45
- tert-Butylmethylether, Aceton und Wasser, - Injizieren der wässrigen stationären Phase in
oder eine zentrifugale Verteilungschromatographie-
- Methylisobutylketon, Aceton und Wasser. säule, wobei die stationäre Phase ein saures
Retentionsmittel enthält, wie in Anspruch 11 de-
17. Verfahren nach Anspruch 16, das die Verwendung 50 finiert, um eine zentrifugale Verteilungschroma-
der folgenden Kombination von Lösemitteln um- tographiesäule zu erhalten, die mit der angesäu-
fasst: Toluen, Heptan, Aceton und Wasser, in Volu- erten stationären Phase gefüllt ist,
menanteilen, so dass: - Injizieren der Ausgangszusammensetzung, in
der das Galanthamin oder die Galanthaminde-
- der Volumenprozentanteil des Toluens größer 55 rivate in Form von Salzen vorliegen, in die zen-
ist als der des Heptans, trifugale Verteilungschromatographiesäule, die
- der Volumenprozentanteil des Acetonitrils 50 mit der angesäuerten stationären Phase gefüllt
% nicht übersteigt, und ist, um eine zentrifugale Verteilungschromato-

18
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graphiesäule zu erhalten, die mit der angesäu-


erten stationären Phase und der Ausgangszu-
sammensetzung beladen ist, und
- Einführen durch Pumpen der organischen mo-
bilen Phase durch die Säule, wie sie im vorher- 5
gehenden Schritt erhalten wurde, wobei ein ba-
sisches Verdrängungsmittel zugegeben wird,
um das Galanthamin oder die Galanthaminde-
rivate in basischer Form zu eluieren.
10
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekenn-
zeichnet, dass das saure Retentionsmittel der sta-
tionären Phase zugegeben wird.

24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekenn- 15


zeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

- Injizieren der organischen stationären Phase


in eine zentrifugale Verteilungschromatogra-
phiesäule, wobei die stationäre Phase ein basi- 20
sches Retentionsmittel enthält, wie in Anspruch
12 definiert, um eine zentrifugale Verteilungs-
chromatographiesäule zu erhalten, die mit der
alkalisierten stationären Phase gefüllt ist,
- Injizieren der Ausgangszusammensetzung, in 25
der das Galanthamin oder die Galanthaminde-
rivate in basischer Form vorliegen, in die zentri-
fugale Verteilungschromatographiesäule, die
mit der alkalisierten stationären Phase gefüllt ist,
um eine zentrifugale verteilungschromatogra- 30
phiesäule zu erhalten, die mit der alkalisierten
stationären Phase und der Ausgangszusam-
mensetzung beladen ist, und
- Einführen durch Pumpen der wässrigen mobi-
len Phase durch die Säule, wie sie im vorherge- 35
henden Schritt erhalten wurde, wobei ein saures
Verdrängungsmittel zugegeben wird, um das
Galanthamin oder die Galanthaminderivate in
Form von Salzen zu eluieren.
40
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekenn-
zeichnet, dass das basische Retentionsmittel der
stationären Phase zugegeben wird.

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RÉFÉRENCES CITÉES DANS LA DESCRIPTION

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Documents brevets cités dans la description

• FR 2802104 [0002] • WO 9745431 A [0007]


• WO 2004079363 A [0002] • US 6407229 B [0007]
• WO 0058722 A [0002] • US 6573376 B [0009]
• US 5332504 A [0003] • US 6617452 B [0009]
• US 5354473 A [0003] • US 6194404 B [0009]
• US 5449461 A, Weisz [0003] • CN 1490319 [0012]
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