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MICROBIOLOGÍA
DE ALIMENTOS
(Guión de Prácticas)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Objetivo
Se pretende conseguir que los alumnos conozcan:
Metodología
Lecciones prácticas en el laboratorio de Microbiología (en grupos
reducidos). Cada grupo realizará las prácticas a lo largo de cuatro semanas (3 días
/semana; 2horas/día). La realización de las prácticas es obligatoria para aprobar la
asignatura.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Práctica 6: Antibiograma.
El objetivo de esta práctica es estudiar qué son los antibióticos y cómo se
realiza la valoración de la actividad antimicrobiana de un compuesto químico
(antibiótico) mediante la técnica de Kirby-Bauer.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Preparación de la muestra:
¾ Tomar la muestra en condiciones asépticas. Para ello se pueden emplear
cubiertos y botes previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la
toma de muestra y el análisis, se mantendrá la muestra en refrigeración.
¾ Homogeneización del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial
de paletas para que la distribución de los microorganismos en el medio sea
homogénea. Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plástico estéril
(especial para el homogeneizador) y se añaden 90 ml de caldo de peptona
estéril. El triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos,
aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y
jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada
práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes
más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).
5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
CALENDARIO DE PRÁCTICAS
1a SEMANA
2º DIA- prácticas 1, 2 y 3
¾ -Siembra de los medios preparados el día anterior:
• siembra de un cultivo en una placa de LB mediante agotamiento por estrías.
• siembra de tres cultivos mediante agotamiento por estrías en una placa de
LB y otra de agar McConkey.
• siembra de un caldo de LB.
• siembra de dos cultivos en slant de TSI.
• siembra de microorganismos ambientales a partir de objetos y superficies
para demostrar la ubicuidad de los microorganismos
• siembra de levaduras en agar sabouraud: incubación a temperatura ambiente.
¾ Cultivo de bacterias en anaerobiosis: Utilización de la jarra de anaerobiosis
¾ Ver los resultados del agotamiento por estrías y del crecimiento en medio
líquido y slant. Diferencias entre medio de cultivo general, selectivo y
diferencial.
¾ Comprobar la ubicuidad de los microorganismos
¾ Ver el resultado del crecimiento en anaerobiosis.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
2a SEMANA
¾ Ver los resultados de las diluciones seriadas del caldo de E.coli y cálculo del nº
de U.F.C./ml.
¾ Ver los resultados de los antibiogramas
¾ Ver los resultados del efecto de las temperaturas sobre el crecimiento
bacteriano
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3a SEMANA
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
4a SEMANA
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
2º DIA- práctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C, 14-A, 14-B, 16-A
Análisis de alimentos frescos-cocinados: investigación de patógenos en alimentos como
posible causa de toxiinfecciones. Continuaremos la práctica procediendo a aislar los
patógenos en medios selectivos.
Estudio de la resistencia de esporas a los procesos de conservación utilizados en la
industria alimentaria mediante comparación del recuento de formas vegetativas y
recuento formas esporuladas tras tratamiento de la muestra a 80 °C.
Comprobar la transformación de la leche que los microorganismos presentes en un
yogur llevan a cabo mediante una fermentación láctica para dar lugar a otro yogur.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Fundamento:
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento
y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de
medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan
por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el
autoclave.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de
degradarlo.
2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más
empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de
malta, etc.
4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de
algunos microorganismos patógenos.
6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener
el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.:
fosfatos bisódicos o bipotásicos.
7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
cambios de pH en el medio.
8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes
microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actúan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
Por su CONSISTENCIA:
a) Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus
componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant
(tubos con la superficie del medio inclinada).
b) Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.
Por su COMPOSICIÓN:
a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos.
b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.
d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee.
Siembra de microorganismos
Î 1) Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles.
Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos
microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de
trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en
conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista
microbiológico.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
•La esterilización
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Material de la Práctica:
Mechero bunsen o similar
Asa de siembra
Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis,
Staphylococcus aureus.
Material a preparar por el alumno:
1 Tubo con medio líquido estéril (caldo común): Luria Bertani (LB)
2 Tubos con medio sólido estéril (agar inclinado): TSI
Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud.
Métodos:
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos más de 1/3 de su volumen).
3. Autoclavar.
4. Sacar del autoclave y dejar enfriar.
b) Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inóculo tomado de los
cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma una gota de inóculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Introducción
Un CULTIVO PURO es aquel que contiene una sola clase de
microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de
aislamiento. Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean un medio de
cultivo sólido, en el que los microorganismos generan colonias separadas.
Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un
grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo
más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al
origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genéticamente
iguales y constituyen un clon.
En esta práctica emplearemos dos métodos para obtener un cultivo puro:
• Aislamiento por agotamiento por estrías
• Aislamiento por siembra de diluciones seriadas (que será el objeto de
otra práctica más adelante).
•
• Agotamiento por estrías.
Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del
inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es
obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas
distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas
bacterias originará una colonia.
Procedimiento:
1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.
2. Tomar el inóculo como se ha descrito anteriormente.
3. Transferir el inóculo a un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al
borde. Extenderlo formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción
pequeña de la placa.
4. Flamear el asa y enfriarla. Rozar una vez con el asa las estrías sembradas la
primera vez y realizar sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de
estrías que no toque la primera.
5. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operación descrita en el apartado anterior, pero
rozando al empezar la segunda tanda de estrías.
6. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37ºC.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Material:
Portaobjetos.
Mechero Bunsen.
Asa de siembra.
Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Cubetas de tinción o similar.
Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y
Safranina.
Método:
1º) Realización del frotis y la fijación de los diferentes cultivos de bacterias Se
procederá tal y como se ha descrito anteriormente.
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2º) Tinciones:
A) La TINCIÓN SIMPLE es la tinción en que se utiliza un solo colorante.
Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de
naturaleza básica. La técnica es la siguiente:
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Introducción
El método que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivas
de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades
conocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna de
las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originará colonias
separadas. Contando el número de colonias, el volumen sembrado en la placa y la
dilución correspondiente, podremos calcular el número de unidades formadoras de
colonias presentes en la muestra inicial.
Material
- Muestra
- Pipetas automáticas.
- Tubos eppendorf.
- Placas de agar LB.
Método
A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de
esterilidad.
-2 -4 -6 -8
Extender 25 µl de las diluciones 10 , 10 , 10 y 10 en una placa e incubar toda la
noche. A partir del número de colonias presentes en cada dilución, calcular el número
de bacterias por ml en el cultivo original.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Práctica 6: ANTIBIOGRAMA
Introducción
En nuestros días han sido puestos a nuestra disposición para la lucha
contra las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos.
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por
microorganismos o derivados semisintéticos de éstas, mientras que los
quimioterápicos son productos de síntesis química, pero ambos tienen la propiedad
de estar dotados de actividad antibacteriana.
Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos
antibacterianos. La evaluación de esta sensibilidad nos va a ayudar en la selección del
compuesto más adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las
pruebas más utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente
antibacteriano están basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas
concentraciones del agente.
• Concentración mínima inhibitoria (CMI) se define como la menor
concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una
cepa bacteriana dada.
• Concentración mínima bactericida (CMB) se define como la
menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir una cepa
bacteriana dada.
Fundamento
El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la
que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una
solución antibiótica absorbida en discos de papel de filtro. Este método está
estandarizado y los halos de inhibición han sido obtenidos correlacionándolos con las
CMI y aparecen en unas tablas.
Hay varios factores que afectan al halo de inhibición: la carga del
antibiótico en los discos, la difusión del antibiótico en el medio de cultivo, el tamaño
del inóculo bacteriano, la composición y grosor del medio de cultivo, la velocidad del
crecimiento bacteriano y el tiempo de incubación.
Los discos de antibióticos son adquiridos comercialmente. Deben
contener la cantidad establecida de antibiótico y ser conservados a 4ºC protegidos de
la humedad.
El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala
8
de McFarland, aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solución salina
estéril o caldo de cultivo.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Objetivos
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos utilizando una
metodología sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiología.
Material necesario
- Cultivo puro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
- Placas de LB agar.
- Discos comerciales de antibióticos.
- Hisopos estériles
- Pinzas de laboratorio.
Realización
1. Preparación del inóculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra
X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del
inóculo debe equivaler al estándar 0,5 de McFarland.
2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasándolo uniformemente
por toda la superficie en tres direcciones. Por último, pasar el hisopo por el reborde
de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos. Colocar los discos de antibióticos sobre la
superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y apretándolos suavemente sobre
la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de
la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de
inhibición. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a
difundir los antibióticos.
3. Incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante 18-24 horas.
4. Medir los diámetros de los halos de inhibición con una regla.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Fundamento
Las altas temperaturas provocan efectos letales o subletales sobre los
microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que normalmente
crece, sufre, en primer lugar, daños en sus proteínas y ácidos nucleicos. Estos primeros
daños impiden que la bacteria se reproduzca y, por consiguiente, forme una colonia sobre un
medio de cultivo adecuado. Sin embargo, si el tratamiento es corto en duración y se efectúa a
una temperatura no excesivamente alta, los daños que la bacteria sufre son reparables y, por
eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es más fuerte, en temperatura o en
duración, los daños se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su
capacidad de formar colonias. Se habla entonces de efecto letal.
Material necesario
3 matraces con un cultivo de la bacteria problema.
1 placa de Petri de agar LB.
Micropipeta y puntas estériles.
Mechero Bunsen.
Baño termostático a 60ºC.
Realización
Se dispondrá de tres matraces con un cultivo de la bacteria problema y de una placa
de Petri con agar LB.
1.- Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con
el tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 15 y 30 minutos.
2.- Tomar, con una punta estéril, 25 µl de uno de los cultivos y extenderlos sobre la parte de
la superficie de la placa correspondiente al tiempo t=0.
3.- Colocar los otros dos matraces en el baño de agua e incubar a 60ºC.
4.- A t= 15 y 30 minutos tomar 25 µl de muestra del matraz que corresponda y extenderlos
sobre la parte de la placa correspondiente.
5.- Incubar la placa a 37ºC durante una noche.
6.- Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos (a t=0 será
imposible porque se tratará de un césped).
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
3.-La TRANSDUCCION: cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el
ADN viral está integrado en el de la bacteria (ciclo lisogénico) se escinde del
cromosoma bacteriano (pasa a ciclo lítico) puede llevarse consigo parte del
genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma de una nueva bacteria a la que
infecte.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Objetivo
Demostrar como podemos conferir a una bacteria la resistencia a un antibiótico
mediante transformación con DNA exógeno.
Material:
Metodología
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
B.-Transformación
1. Dividir la placa de Petri en dos mitades con el marcador de vidrio.
2. Extender con la punta de la pipeta 50 µl de las células competentes en una
mitad de la placa.
3. Añadir el resto de las células sobre el ADN del segundo tubo.
4. Mantener 20 minutos en hielo.
5. Colocar el ADN con las células a 42º durante 1 minuto.
6. Poner la mezcla en hielo durante 5 minutos.
7. Incubar las células a 37ºC durante 15 minutos.
8. Extender las células transformadas en la segunda mitad de la placa.
9. Incubar 20 horas a 37ºC
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Los virus son demasiado pequeños para poder ser vistos con el
microscopio óptico y únicamente son visibles gracias al mayor poder de resolución
que ofrece el microscopio electrónico. Los virus están compuestos de un genoma,
bien en forma de DNA o RNA, y de proteínas. Son parásitos obligados y necesitan de
la maquinaria metabólica de la célula huésped para la replicación de su material
genético. En esencia un virus consta de ácido nucleico rodeado por una cubierta de
proteína, llamada cápsida.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
en la célula) y una vez unido inyecta su ADN de cadena doble en la célula bacteriana.
En el interior de la bacteria este ADN puede o bien integrarse en el cromosoma
bacteriano y sus genes quedan reprimidos, o bien se expresar sus genes y sintetizar
nuevos fagos. En el primer caso se habla de ciclo lisogénico y en el segundo de ciclo
lítico.
Objetivo
La presencia de virus pasaría desapercibida a no ser por el hecho de que son agentes
infecciosos y que se hacen evidentes a través de los síntomas de las enfermedades
que producen. El objetivo de la práctica consiste en visualizar la presencia de
bacteriófagos a través de las consecuencias de su ciclo infeccioso.
Material
Dos placas de medio phage base precalentadas a 37°C.
Dos tubos de vidrio con 300 µl de bacterias Staphylococcus aureus 8325-4
competentes diluidas en phage broth.
10 ml de phage top agar a 55 °C.
Eppendorf con 200 µl del fago φ 85 diluido en phage broth.
Pipeta automática
Pipeta de 5 ml estéril
Pipeteador automático
Metodología
Tomar un tubo con 300 µl de células competentes y añadirles 200 µl de una dilución
del fago. Mezclar por agitación. A partir de aquí, hacer lo mismo con el tubo con 300
µl de células competentes al que no le hemos añadido el fago.
Incubar 30 min a temperatura ambiente.
Añadir 5 ml de phage top agar a 55 °C. IMMEDIATAMENTE mezclar y añadir
sobre la placa de phage base precalentada a 37°C.
Dejar solidificar y meter en la estufa a 37°C.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Introducción
Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse
asexualmente por gemación o fisión. La mayoría se reproducen asexualmente por
gemación polar o multilateral, proceso durante el cual se forma en la periferia de la
célula, una protuberancia (yema) que aumenta de tamaño hasta que finalmente se
desprende de la pared celular, constituyendo una nueva levadura. Unas pocas
especies se multiplican por escisión.
Algunas especies pueden formar micelio, y la mayoría de ellas fermentan
uno o varios azúcares. Intervienen en fermentaciones beneficiosas como la
fabricación del pan, vino, cerveza y quesos. También pueden intervenir en
alteraciones de zumos y frutas, miel, almíbares, jaleas, carnes, vino, cerveza y otros
alimentos.
Su identificación se basa en criterios morfológicos y fisiológicos. En esta
práctica nos centraremos en la identificación de levaduras siguiendo pruebas
morfológicas lo que nos permitirá aproximarnos al género al que pertenecen teniendo
en cuenta que la identificación definitiva se hace en base a pruebas bioquímicas.
Definimos algunos términos habituales en micología.
1. Blastospora: Célula fúngica que se forma como consecuencia de un proceso de
gemación.
2. Clamidospora: Espora esférica formada en las hifas, ya sea en posición intercalar
o terminal, de pared gruesa y cuyo diámetro es mayor que el de los filamentos en los
que se forma.
3. Micelio: Conjunto de hifas o filamentos de un hongo.
Objetivos
1. Observar colonias de diferentes especies de levaduras.
2. Poner de manifiesto las principales características microscópicas de las levaduras,
tales como presencia de micelio, blastosporas y clamidosporas.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Material necesario.
1. Cultivos puros en agar Sabouraud de:
Candida pseudotropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Realización
1. Observar el aspecto de las colonias de las dos especies de levaduras.
2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se
inoculan las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud. Para ello se
toma una pequeña parte de una colonia aislada y se realizan estrías en una
porción de la placa. Se incuban las placas durante tres días a temperatura
ambiente.
3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra
previamente flameada transferir una pequeña cantidad del cultivo en medio
sólido a la gota. Remover hasta formar una suspensión homogénea. Colocar
un cubreobjetos
4. Observación microscópica de los cultivos. Se empleará el objetivo X10.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Fundamento:
Material:
-Cultivo de Bacillus en medio sólido.
-Portaobjetos.
-Asa de siembra.
-Mechero Bunsen.
-Papel de filtro.
-Verde malaquita (solución acuosa al 2%).
-Safranina.
-Microscopio.
Método:
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Fundamento
Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas”, carentes de papel activo (metabólico)
pero que confieren a las bacterias importantes propiedades:
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Material
- Cepas bacterianas: Klebsiella en medio líquido
- Tinta china
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Microscopio óptico
Método
La observación a microscopía óptica en fresco es difícil, ya que su índice de
refracción es similar al del medio. Se recurre a tinción negativa por medio de
nigrosina o tinta china.
1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, añadir una
gota de tinta china y mezclar bien.
2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensión de células con tinta
china. Evitar que se formen burbujas.
3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes.
Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensión será
absorbido por los papeles.
4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las
manos con jabón.
5. Observar al microscopio, se debe de ver la célula teñida de negro y la cápsula
en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar
el contraste de las células.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a una serie de tres placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 45-
50 °C.
3. Incubar durante 24 h-72 h a 30 °C. Recuento de placas en las que el número
de colonias esté comprendido entre 30 y 300. Cálculo de ufc/gramo.
4. Tinción de Gram de colonias con diferentes morfologías.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de dos de las diluciones decimales y por
duplicado (10 -2, 10 -3), 1 ml/placa a placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBG fundido y atemperado a 45-
50 °C (este medio de cultivo no se autoclava).
3. Incubar durante 24 h a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Las colonias características son de
color violeta con un halo de precipitación alrededor.
4. Confirmar las colonias típicas aisladas mediante pase a agar nutritivo
(incubación 24h a 37 C) y a partir de ahí, realizar la prueba de la oxidasa y
siembra en agar KIA y tinción de Gram. Cálculo de ufc/gramo.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
En esta práctica se aísla en medio selectivo OGA que lleva incorporado el antibiótico
oxitetraciclina, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano.
Material
Muestra
Balanza de precisión
Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml
Placas de Petri con medio OGA
Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio OGA.
2. Incubar durante 5 días a 25 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Cálculo de ufc/gramo.
Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBL fundido y atemperado a 45-
50 °C (este medio de cultivo no se autoclava).
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Material
Muestra
Balanza de precisión
Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml
Tubos con caldo EC con campana
Tubos con caldo de triptona
Reactivo de Kovacs
Método
1. Siembra de 10 ml de muestra (dilución 10-1) en 10 ml de caldo EC de doble
concentración con campana, precalentados a 44°C.
2. Incubar los tubos 24-48 horas a 44°C.
3. Considerar positivos los tubos que presenten al menos un 10% de gas en la
campana.
4. Confirmar los tubos positivos de EC mediante pase de 0,1 ml a tubos con
caldo de triptona, para realizar la prueba del indol. Incubar los tubos a 44°C
durante 24-48 horas.
5. Añadir reactivo de Kovacs para revelar la presencia de indol.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio Agar Baird Parker.
2. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. Recuento de placas en las que el número
de colonias esté comprendido entre 15-150 (típicas y no típicas).
3. Confirmar tres colonias típicas y 3 no típicas mediante siembra en caldo BHI.
Incubar los tubos a 37°C durante 24 horas.
4. Añadir 0,1 ml a tubos estériles que contienen 0,3 ml de plasma de conejo con
EDTA. Incubar durante 4-6 horas para observar la aparición del medio
solidificado por la acción del enzima coagulasa
5. Los resultados Staphylococcus coagulasa + se expresan como ufc/g o ml
multiplicando el número de colonias confirmadas positivas, por 10 (porque
hemos sembrado 0,1 ml por placa) y por el factor de dilución.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Su presencia en los alimentos indica que estos pueden ser causa de toxiinfecciones al
ser ingeridos por el hombre.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Material
Muestra
Balanza de precisión
Pipetas automáticas de 1 y 0,1 ml
Agua de peptona tamponada (BPW)
Placas de Petri con medio XLD
Placas de Petri con medio BGA
Tubos con caldo Mueller Kauffmann tetrationato
Tubos con caldo Rappaport-Vassiliadis Soja
Método
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril
y añadir 225 ml de agua de peptona tamponada (BPW). Homogeneizar con el
stomacher. Incubar la bolsa 16-18 horas a 37 °C.
2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Añadir con pipeta estéril,
1ml de la muestra preenriquecida a 10 ml de caldo Mueller Kauffmann
tetrationato e incubar a 37 °C durante 24 horas. Por separado, añadir 0,1 ml
de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de Rappaport-Vassiliadis
Soja en incubarlo a 42 °C durante 24 horas.
3. Aislamiento en medios sólidos selectivos: agitar los caldos de
enriquecimiento y a partir de cada uno de ellos, realizar un agotamiento por
estrías en medio selectivos para Salmonella (XLD y BGA). Incubar las placas
a 37°C durante 24-48 horas.
Nota: Salmonella crece en XLD formando colonias rosas con centro negro
salmón. En BGA las colonias de Salmonella son rosas transparentes, virando el
medio a un rosa intenso.
4. Confirmación bioquímica y serológica: Si se considera conveniente, se
pueden realizar a partir de las colonias presuntivas de Salmonella pruebas
confirmativas bioquímicas y/o serológicas
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril
y añadir 225 ml de caldo Fraser demi. Homogeneizar con el stomacher.
Incubar la bolsa 24 horas a 30 °C.
2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Añadir con pipeta estéril,
0,1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de caldo Fraser e
incubarlo a 37 °C durante 24 horas. Los tubos que contienen Listeria se
ponen de color negro.
3. Aislamiento en medios sólidos selectivos: agitar el tubo de Fraser y realizar
un agotamiento por estrías en medio selectivos para Listeria (Oxford y
Palcam). Incubar las placas a 37°C durante 24-48 horas.
Nota: Listeria crece en Palcam formando colonias pequeñas, negras-grisáceas,
rodeadas de un halo negro y deprimidas en el centro. En Oxford las colonias de
Listeria son verde grisáceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro y
deprimidas en el centro.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Añadir con pipetas estériles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacías estériles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 45-
50 °C.
3. Incubar durante 24 h a 37 °C. Recuento de placas en las que el número de
colonias esté comprendido entre 30 y 300. Tinción de Gram y de esporas de
los distintos tipos de colonias.
Material
Muestra
Balanza de precisión
Pipetas automáticas de 1
Placas de Petri estériles vacías
PCA fundido para recuento en placa
Medio Schaedler fundido para recuento en placa
Jarra de anaerobiosis
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Calentar el tubo de muestra (dilución 10 -1) a 80 °C en el baño durante 10
minutos. Este tratamiento térmico destruye las formas vegetativas pero lo
resisten las esporas.
2. Hacer una dilución decimal en caldo de peptona del tubo previamente
sometido a calor.
3. Añadir con pipetas estériles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacías estériles.
4. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 45-
50 °C (para recuento de esporos aerobios) o de medio Schaedler fundido y
atemperado a 45-50 °C (para recuento de esporos anaerobios. En este caso
añadir doble capa).
5. Incubar durante 24 h a 37 °C. Las placas de anaerobios se incuban en una
jarra de anaerobiosis. Recuento de placas en las que el número de colonias
esté comprendido entre 30 y 300. Comparación con el recuento de aerobios
mesófilos. Tinción de Gram y esporas.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. Destapar la placa de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminación se desee
examinar durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5; 1; 1,5 horas.
2. Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37 °C.
3. Determinar el número de aerobios mesófilos totales ambientales.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los
productos llevarán microorganismos. En la manipulación, el envasado y el
almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo
momento en niveles que aseguren la calidad microbiológica del alimento. El objetivo
de los análisis microbiológicos de superficies es comprobar el estado higiénico del
lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el
procesado de los alimentos. Existen distintos métodos para el examen microbiológico
de las superficies: método del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar,
de la lengüeta (o película pegajosa), etc. En esta práctica se describen el método del
hisopo (para el estudio de superficies no planas) y el de placa de contacto Rodac
(para el estudio de superficies planas).
Método
1. Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel de
aluminio estéril con una abertura de dimensiones conocidas (ej. 9 cm2).
2. Humedecer el hisopo estéril en una solución de 10 ml de solución salina
estéril y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla.
3. Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solución salina estéril y dejar
durante 15-30 min de manera que los microorganismos se liberen del algodón
al caldo.
4. Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa PCA y VRBG.
5. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. El resultado se expresa en ufc/9 cm2
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Método
1. El medio PCA, una vez fundido y atemperado a 55°C, se vierte en las placas
de manera que sobresalga del borde de la placa para facilitar el contacto con
la superficie a examinar.
2. Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida.
3. Incubar durante 24-48 horas a 37 °C. La superficie delimitada por las placas
es de 25 cm2, por lo que el resultado se expresa en ufc/25 cm2
Nota: el principal inconveniente de este método es su ineficacia en superficies muy
contaminadas y la posibilidad de no recuperar todos los microorganismos presentes
en la superficie. Sin embargo, se obtienen buenos resultados en los casos en los que
la carga microbiana es baja.
Método
1. Para realizar esta práctica el alumno no se lavará las manos. Pasar los dedos
por la mitad de la superficie de una placa de VRBG.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la
mitad restante de la placa.
3. Tomar con un hisopo estéril muestra del interior de la nariz y sembrar el
hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal.
4. Incubar durante 24 horas a 37 °C.
5. Observar el crecimento de las colonias características en cada medio de
cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de
Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus
aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
No todos los microorganismos son patógenos o alterantes, sino que algunos de ellos
pueden ser aprovechados por el hombre en la fabricación de diferentes productos.
Éste es el caso de las levaduras que se emplean por ejemplo, en la elaboración del
pan y bebidas alcohólicas como vino y cerveza. También se utilizan bacterias en la
fabricación de productos lácteos, embutidos, etc.
El objetivo de esta práctica consiste en comprobar la transformación que algunos
microorganismos llevan a cabo sobre diferentes materias primas para dar lugar a
productos aprovechables para la alimentación humana. Se propone la realización de
dos tipos de fermentación que se caracterizan por subproductos finales, de ahí los
nombres de fermentación láctica y fermentación alcohólica.
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Fermentación láctica
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
Fermentación alcohólica
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Prueba del indol: esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima
triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol+) de los otros
coliformes (indol-). Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, que es
el compuesto que se detecta en este ensayo.
Procedimiento: inocular un caldo de triptona + NaCl al 0,5 % (este digerido de
proteínas animales es especialmente rico en triptófano) con una colonia. Incubar a
37 °C durante 24 horas. Añadir el reactivo de Kovacs: si se produce un anillo de
color rojo en la superficie del caldo, la prueba será considerada positiva.
El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehido, que puede
reaccionar tanto con el indol como con el triptófano, produciendo compuestos de
coloración rojiza. Para evitar la interferencia del triptófano, el p-
dimetilaminobenzaldehido está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua.
A diferencia del triptófano, el indol es soluble en alcohol isoamílico, y por tanto,
sólo él reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado.
Galería API 10S: es una galería de varias pruebas bioquímicas simultáneas que
identificarán/confirmarán la enterobacteria que hemos aislado del producto
alimenticio.
Procedimiento: Añadir agua a la cámara de incubación (5 ml aproximadamente).
Coger 5 colonias y resuspender en 5 ml de agua destilada estéril (esto da una
turbidez aproximada de 0,5 en la escala de Mc Farland). Rellenar los pocillos del
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Prácticas de Microbiología de Alimentos (1º ITA)
API (no la cúpula) con una pipeta Pasteur. El símbolo significa que el pocillo ha
de llenarse hasta arriba. El signo _ significa que hay que poner vaselina en la
cúpula del pocillo. Incubar a 37 °C durante 24 horas.
Lectura del API: hay que apuntar en una plantilla en qué pocillos la prueba
correspondiente ha sido positiva o negativa (esto se sabe porque ha habido un
cambio de color, la aparición de un precipitado, etc.). La prueba de indol y la de
fenilalanina necesitan reactivos apropiados (Kovacs y cloruro férrico
respectivamente). Una vez reveladas las pruebas hay que sumar los números que
hay debajo de los pocillos positivos en la plantilla. Como éstos se encuentran
agrupados de tres en tres, finalmente obtenemos una serie de números o código
que nos permitirá identificar la bacteria.
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