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Chapitre 12 : Techniques de

géni-génétique
Ensemble des outils et des techniques de
la biologie moléculaire permettant, de
manière contrôlée, l'étude de la modification
des gènes : leur isolement, leur clonage,
leur séquençage, leur découpage ...dans un
but de recherche fondamentale ou appliquée.
1-L'hybridation in situ

2- Clonage

3- Transgénèse
1-L'hybridation in situ
L'hybridation in situ d'ADN, est une technique
qui permet de mettre en évidence et de
localiser des séquences d'acides nucléiques
connues.
Principe
L' hybridation in situ fait appel à deux propriétés
de la molécule d'ADN:

1- la possibilité de la dénaturer c'est à dire de


séparer les deux hélices la constituant.

2- la complémentarité des bases des deux


brins
Si des molécules d'ADN dénaturées sont
placées dans un milieu contenant des
molécules simple brin d'ADN ou d'ARN de
séquence connue, celles-ci auront tendance à
s'associer avec les portions des ADN
dénaturés qui leur sont complémentaires.
Cette méthode repose donc sur l'hybridation
d'une molécule simple brin d'ADN (sonde)
avec une séquence complémentaire
dénaturée.
Les sondes utilisées
Les sondes utilisées sont :

- le plus souvent de l'ADN (double brin ou plus


rarement monobrin)

- ou un ARN (riboprobes)
Pour pouvoir être visualisées, ces sondes
doivent être préalablement marquées.

On distingue donc plusieurs types de marquages:


Marquage Révélation

Isotopes radioactifs (tritium H3, P32 ou S35). Autoradiographie

Produits fluorescents, on parle alors de FISH; Microscopie à fluorescence

Enzymes (p.e. phosphatase alcaline) Anticorps


Fluorescence in situ hybridization (FISH)

Le FISH implique la préparation de séquences


courtes d'ADN simple brin (sondes) qui sont
complémentaires des séquences d'ADN à
examiner.
Ces sondes s'hybrident aux portions d'ADN
qui leur sont complémentaires et étant
marquées avec des molécules fluorescentes,
elles permettent la localisation des séquences
cibles.
Utilisations

• Caryotypage: numération et identification des


chromosomes homologues.

• Localisation de gène

• Analyse des chromosomes: identification des


anomalies chromosomiques.
Le caryotypage spectral

Le caryotypage spectral ou SKY (Spectral


Karyotyping) est une technique de laboratoire
qui permet aux scientifiques de visualiser les
23 paires de chromosomes humains en une
fois, chaque paire de chromosomes étant
peinte d'une couleur fluorescente différente.
Principe de la technique SKY
La technique SKY nécessite la préparation
d'une grande collection de sondes. Chacune
des sondes est complémentaires d'une unique
région d'un chromosome.

Après hybridation, chaque chromosome sera


apparié avec un grand nombre de sondes.
Chaque sonde est étiquetée avec une
molécule fluorescente. Ainsi chaque
chromosome sera hybridé avec un jeu de
sondes qui lui donneront une couleur
(fluorescence) particulière identifiée par
analyse spectrale.
Par exemple, les sondes qui sont
complémentaires du chromosome 1 sont
étiquetées avec des molécules jaunes, tandis
que celles qui sont complémentaires du
chromosome 2 sont étiquetées avec des
molécules rouges.

A chaque chromosome correspondra un jeu


de fluochromes.
Un grand nombre de maladies sont associées à
des anomalies chromosomiques particulières.
Par exemple, les chromosomes dans les
cellules cancéreuses (tumeurs
solides) présentent fréquemment des
aberrations chromosomiques de type
translocation.
2-Clonage des gènes
Plasmides
Criblage: Technique de réplique
Plantes transgéniques
(OGM ou PGM)
Par Agrobacterium tumefaciens
• La transgénèse est la technique de transfert
et d'intégration d'un ou plusieurs gènes à
l'intérieur du patrimoine génétique d'un
organisme vivant.

• Plusieurs découvertes scientifiques ont permis


d'aboutir à l'obtention de la première plante
transgénique en 1983.
• La compréhension des mécanismes
responsables de la galle du collet (maladie
connue depuis l'antiquité) a permis la mise en
évidence d'un transfert génétique naturel. Elle
est à l'origine des techniques de transformation
génétique utilisées aujourd'hui.
• En 1977 Schell découvre le transfert de gènes
par des agrobactéries, bactéries du sol
pathogènes de nombreuses espèces végétales.

• Il a montré que la virulence de ces bactéries est


due à un transfert de gènes de la bactérie vers
les cellules végétales.
• Ce n’est pas uniquement le gène d’intérêt lui-
même qui est transféré, mais une construction
génétique qui comprend d’autres séquences
de nucléotides ayant différentes fonctions,
notamment le promoteur, le marqueur.
• Le promoteur est une séquence de
nucléotides qui déclenche la lecture des
instructions contenues dans le gène.
• Le marqueur sert à discriminer les cellules qui
auront incorporé le gène d’intérêt de celles
qui ne l’auront pas incorporé. On utilise
généralement des gènes codant pour une
résistance à des antibiotiques.
Les étapes de la transgénèse
• 1) Un gène d’intérêt est sélectionné.

• 2) Le gène est purifié, puis inséré dans une


construction génétique qui comprend
habituellement, un promoteur et un ou deux
gènes marqueurs Il devient ainsi un
transgène. Le tout est inséré dans un plasmide
• 3) La construction génétique ainsi obtenue est
multipliée (clonage), puis introduite dans des
bactéries infectieuses (Agrobacterium).

• 4) des cellules hôtes sont infectées par


Agrobacterium afin d’introduire le transgène.
• 5) Sélection et culture des cellules
transformée

• 6)La transgénèse ne réussit que dans un tout


petit nombre de cas (un taux de succès de 1 %
ou moins n’est pas rare).
Pour les plantes qui ne peuvent être infectées
par Agrobacterium, comme le maïs, il faut
utiliser un procédé dit de biolistique, comme le
pistolet à gènes.

Il permet de bombarder les cellules avec des


particules de métal inerte (ou microbilles) sur
lesquelles on aura fixé l’ADN à transférer.
Un autre procédé, l’électroporation, permet
d’introduire l’ADN dans le noyau de la cellule à la
faveur d’un choc électrique qui rend
temporairement la membrane poreuse.