CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ

TQI/TRF
PRÁCTICA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA N° 5.

Práctica CARACTERIZACIÓN DE DOCENTE.

MACROMOLÉCULAS OBTENIDAS Fecha:
N° 5 EDWIN ALFREDO REYES GUZMÁN
DE TEJIDOS

Título.
CARACTERIZACIÓN DE MACROMOLÉCULAS OBTENIDAS DE TEJIDOS.

Objetivos Generales.

- Comprobar la presencia de Macromoléculas en los tejidos empleados en la práctica 4, utilizando para

ello reacciones características de cada uno de los componentes obtenidos.

Marco teórico.

El marco teórico lo deben tener en cuenta en relación a los siguientes aspectos. Recuerden que siempre
antes de la práctica habrá Quiz.

Fundamentos

A. Carbohidratos:
Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando polisacáridos de reserva,
pueden ser componentes estructurales o pueden estar participando en el metabolismo en forma
monomérica. Las propiedades químicas de tales compuestos permiten diferenciarlos así:

1. Reacción de Lugol
Los polisacáridos son solubles en soluciones acuosas ácidas, pero insolubles en etanol. Los
polisacáridos como el almidón- amilosa y amilopectina-, el glicógeno y los dextranos, forman
compuestos coloreados característicos cuando se combinan con yodo molecular. A pesar de que la
naturaleza de estos complejos no esta bien definida, evidencias indican la formación de complejos de
absorción entre las cadenas helicoidales del polisacárido y el yodo. Para que haya estructura helicoidal
se necesita por lo menos una cadena de 8 monosacáridos. Los polisacáridos que a todo lo largo de su
molécula muestran estructura helicoidal, dan coloración azul intensa (amilosa). Aquellos que son
ramificados con hélices ininterrumpidas producen coloraciones menos intensas (amilopectina). Los
altamente ramificados con segmentos cortos de ramificación, producen color pardo o rojizo
(glicógeno).

2. Reacción de Molish.
Un carbohidrato tratado con alfa-naftol y ácido sulfúrico concentrado produce una coloración violeta.
Se presume que el ácido sulfúrico actúa como deshidratante formando derivados furfurales que
reaccionan con el alfa-naftol para dar productos coloreados.

3. Reacción de Benedict.
Azucares reductores tratados con soluciones cúpricas en medio alcalino suave (citrato-carbonato de
sodio) reducen el ión cúprico a ión cuproso de color ladrillo.
B. Lípidos:
En cuanto a solubilidad, los lípidos son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos.

1. Reacción de Lieberman Burchard

Los hidroxiesteroides con instauración en la posición 5, reaccionan con el anhídrido acético para dar
ésteres, que en medio sulfúrico se deshidratan produciendo una coloración verde.

2. Saponificación
La hidrólisis alcalina de los acilgliceroles produce jabones y glicerol. Si el hidrolizado se somete a la
acción del éter, los jabones sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol.

3. Reacción de Fiske-Subbarow (prueba de fosfatos)

Los fosfolípidos por acción del NaOH se hidrolizan, produciendo fosfatos inorgánicos, que con el ácido
molibdico dan fosfomolibdatos, y éstos por acción de reductores como el ácido 1,2,4-
aminonaftolsulfonico o el ácido ascórbico, producen complejos de óxidos de molibdeno de color azul.

C. Acidos nucleicos:

1. Hidrólisis alcalina
Los álcalis diluidos (0.3 a 1.0 N), hidrolizan los enlaces éster del ácido ribonucleico, mientras que los
enlaces éster del ácido desoxirribonucleico son relativamente estables, lo mismo que los enlaces N-
glicosídicos de ambos ácidos. La facilidad de hidrólisis en el RNA parece estar asociada a la presencia
de OH en los carbonos 2’ y 3’, lo cual permite la formación de intermediarios cíclicos 2’ y 3’
fosfonucleótidos, que finalmente dan los monofosfonucleótidos 2’ ó 3’. Como la desoxirribosa del
DNA no forma tales intermediarios, es relativamente estable en presencia de álcali diluida. La
acidificación de la solución después del tratamiento alcalino precipita las moléculas de DNA intactas.

2. Prueba de Tollens para pentosas

Se basa este ensayo en la producción de furfural por medio del ácido clorhídrico y su posterior
identificación con un fenol, en este caso floroglucinol, para dar complejos rojos. Otros carbohidratos
pueden producir colores amarillo, naranja o carmelito.

D. Proteínas:

1. Desnaturalización:
Por acción de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura
secundaria de las proteínas. Las proteínas a temperaturas mayores de 50°C precipitan, por formación de
agregados que resultan de la destrucción de la estructura secundaria.

2. Prueba de Millon:
Las proteínas que contiene tirosina reaccionan con mercurio disuelto en ácido nítrico, produciendo
nitroderivados mercuriales de color rojo.

3. Prueba de la Ninhidrina:
Los grupos aminoterminales y laterales de las proteínas reaccionan con la ninhidrina caliente, dando
complejos de color violeta. En ellos, el amoniaco desprendido reacciona con una molécula de
ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado reducido.
4. Prueba de Biuret:
Los nitrógenos del enlace peptídico forman complejos coloreados con los iones cúpricos en medio
alcalino.

5. Reacción Xantoproteica:
Esta reacción se basa en la nitración del anillo bencénico por el HNO3 concentrado, dando derivados
amarillos de nitrobenceno. Las proteínas que contienen tirosina y triptófano dan esta reacción, pero el
color amarillo resultante se transforma en naranja si se le adiciona NH 4OH. Para nitrar la fenilalanina
se requiere H2SO4 como catalizador.

Materiales.

Pipetas de 1,2,5 y 10 ml. 5 Tubos de centrífuga. Beaker 600 ml, mechero bunsen o placa de
calentamiento, 1 pipeta Pasteur plástica (gotero), 1 beaker 400 ml, 1 beaker de 100 ml, 1 frasco
lavador. 1 gradilla, 15 tubos de ensayo, pinzas para tubo de ensayo. Embudo y papel filtro. Papel
aluminio, termómetro.

Equipos.
Balanza. Centrifuga 2500 rpm.

Reactivos.
Acido clorhídrico 2N 50 ml
Acido sulfurico conc. 50 ml
Hidroxido de sodio 15% 100 ml
Acido clorhidrico 6N 100 ml
Hidroxido de potasio 2N 100 ml
Acido nitrico conc. 50 ml
Hidroxido de amonio conc. 50 ml
Agua destilada 500 ml
Reactivo de Millon 50 ml
Sln de lugol 50 ml
Etanol 96% 100 ml
Reactivo de Molish 50 ml
Reactivo de Benedict 50 ml
Eter etilico 50 ml
Cloroformo 50 ml
Anhidrido acetico 50 ml
Ninhidrina 0.2% 50 ml
Reactivo de Biuret 50 ml
Almidon 50 ml
Glucosa 50 ml
Albumina, glicina, fenilalanina 50 ml c/u
Orcinol 0.5 g
Cloruro Ferrico sln 0.5 g
Metodología.

Con las muestras M1, M2, M3, M4 y M5 obtenidas en la práctica anterior, se harán las siguientes
pruebas de caracterización (Ver los diagramas adjuntos)

1. Carbohidratos:
Muestras M1, M2 y patrones de glucosa y almidón.

A. Lugol.
A una fracción de cada una de las muestras y de los patrones (0.5 ml de cada una) agregar 4 ml de agua
y 1 gota de solución de Lugol. Observar las coloraciones. Si la solución es muy oscura diluir con más
agua y observar nuevamente. A otras porciones iguales de estos compuestos adicionar 1 ml de HCl 2 N
y colocarlos en baño maría durante 15 min. Dejar enfriar y agregar nuevamente Lugol. Observe los
resultados y explíquelos en el informe.

B. Molish.
A una nueva fracción (0.5 ml de cada uno) de los compuestos anteriores agregar 2 gotas de reactivo de
Molish. Mezclar cuidadosamente y con los tubos inclinados agregar 1 ml de H2SO4 concentrado de
manera que se forme una capa de ácido debajo de la fase acuosa. No agitar los tubos. Observe el color
del anillo formado en la interfase.

C. Benedict.
Colocar al baño maría durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones (0.5 ml de cada una),
con 1 ml de solución de Benedict. Observe los resultados y continúe calentando por 15 min. De nuevo
observe los tubos.

2. Lípidos:
Muestras M3.

A. Prueba de Lieberman-Burchard. (M3).

Tomar una fracción de 0.5 ml de la muestra indicada, agregar 1 ml de cloroformo, mezclar. Agregar 1
ml de anhídrido acético, agitar y adicionar con cuidado por las paredes del tubo 3 gotas de H2SO4
concentrado. Observe la coloración en la interfase al minuto y a los 15 minutos. Explique el resultado
obtenido.

B. Saponificación (M3).
A una cantidad análoga a la anterior de las fracciones indicadas, agregar 3 ml de NaOH al 15 %.
Colocar en la boca del tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio y reflujar al baño maría durante 20
min. Añadir 2 ml de éter y filtrar los jabones resultantes.

C. Fosfatos (filtrados obtenidos en B)

A 1 ml del filtrado agregar 10 gotas de ácido molíbdico, mezclar y dejar en reposo 5 min. En seguida
adicionar 10 gotas de solución de ácido ascórbico. Observe la coloración. Si no se desarrolla color
colocar el tubo en el baño maría por 5 min.

3. Acidos nucleicos:
Muestras M5
A. Hidrólisis básica (M5)
En un tubo de ensayo colocar la fracción de la muestra M5 correspondiente a los ácidos nucleicos,
adicionar 3 ml de KOH 2 N y colocar en la boca del tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio.
Colocar la solución al baño maría durante 20 min. Acidificar la solución con HCl y observar si se
forma precipitado correspondiente al DNA. Separar éste por centrifugación.

B. Prueba de Pentosas (hidrolizado obtenido en A)

A 0.5 ml del hidrolizado adicionar 2 ml de HCl 6N y agregar 10 mg de orcinol y 10 mg de Cloruro
ferrico. Calentar la mezcla a baño maría durante 1 minuto. La aparición de un color o precipitado
verde, indica que existen pentosas en la muestra.

D. Fosfatos. (hidrolizado obtenido en A)

Repita la prueba de fosfatos (numeral 2C) con 1 ml del hidrolizado.

4. Proteínas:
Muestras M4 y patrones de albúmina, tirosina y glicina.
A. Millon. (M4, albúmina, y glicina)
A una fracción de las muestras (0.5 ml de cada una) agregar 5 gotas de reactivo de Millon; calentar
durante unos minutos al baño maría ; observar el precipitado.

B. Ninhidrina. (M4, albúmina y fenilalanina)

A una fracción de las muestras agregar 1 ml de la solución de ninhidrina al 0.2%. Acidificar con 0.5 ml
de HCl 2N. Calentar al baño maría durante 10 minutos ; observar el color.

C. Biuret. (M4, albúmina)

Tomar una fracción de 0.5 ml de cada muestra, agregar 1 ml de reactivo de Biuret. Mezclar. Esperar 10
minutos y observar el color.

D. Xantoproteica. (M4, albúmina y fenilalanina)

Calentar una fracción de 0.5 ml de cada una de las muestras con 1 ml de ácido nítrico concentrado,
enfriar y observar el color. Agregar cuidadosamente 10 gotas de NH4OH. Observar la interfase.

RESULTADOS.

De acuerdo con los resultados, deduzca qué tipo de polisacáridos, de aminoácidos en las proteínas, de
lípidos y de ácidos nucleicos están en el tejido, realice el análisis correspondiente.

1. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta práctica.

2. Que se requiere para que un carbohidrato tenga poder reductor y por qué la sacarosa es negativa para
la prueba de Benedict?
3. Por qué las proteínas no dan la reacción con Ninhidrina?
4. En la prueba de fosfatos, por qué es necesario adicionar el ácido molibdico antes del agente
reductor?

BIBLIOGRAFIA.

1. Martínez J. C. Guías de Análisis Orgánico. Universidad Nacional de Colombia., 1996.

2. Shriner R.L. Fuson R.C. Identificación sistemática de compuestos orgánicos. Limusa Noriega editores, 1995.
 3. Vogel’s A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed., 1978.
4. Durst H.D. Gokel G.W. Química Orgánica experimental. Ed. Reverté, 1985.
5. Universidad nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Química. Laboratorio de Principios de
Bioquímica. 2009.