Conséquences d’une malnutrition

hyperlipidique pendant la lactation

dans un modèle murin de maladie
d’Alzheimer:
Les souris Thy-Tau22

Licence Sciences Technologie

Santé mention Biologie parcours
BCP
Tuteur :
Pr. Didier VIEAU
Présenté par
KATCHALA Fannata
Abréviations : (il faut les mettre par ordre
alphabetique)

ND: Normal Diet

HFD: Hight Fat Diet

NCD: Normal Chow Diet

MWM: Morris Water Maze

Ab: Beta-Amyloid

DOB: Day of Birth

MA:

Ad

HFD
Remerciements : (Il faut le faire sur une autre
page)

Je souhaite remercier sincèrement mon tuteur le Professeur Didier VIEAU

pour sa disponibilité, son aide, sa patience et sa confiance en moi. Merci
d’avoir accepté d’être mon tuteur, de m’avoir accueilli dans votre bureau
et d’avoir répondu à toutes mes questions même les plus stupides.
Enfin mes sincères remerciements à tous les membres du jury pour avoir
accepté de lire et d’évaluer soigneusement ce travail.
Table de matière

Résumé

I. Introduction

II. Matériels et méthodes

II.1 Animaux et régimes
II.2 Suivi des paramètres métaboliques et physiologiques
II.3 Tests comportementaux
II.3.1 piscine de Morris
II.3.2 Labyrinthe en croix surélevée
II.4 Analyses biochimiques
II.4.1 Western blot
II.5 Analyses moléculaires

III. Résultats attendus

IV. Discussion

V. Conclusion et perspectives

VI. Références bibliographiques

➔ ANNEXES
 Résumé
L'homéostasie métabolique maternelle exerce des effets à long terme
sur les résultats de santé de la progéniture. Ici, sera démontré que
l'alimentation riche en graisses maternelles (HFD) pendant la lactation
prédispose la progéniture à l'obésité et à la modification de
l'homéostasie du glucose chez les progénitures.
L'obésité induite par un régime riche en graisses (HFD) est un
facteur de risque de déficience cognitive dans la maladie
d'Alzheimer (MA). Il a été rapporté que deux marqueurs
neuropathologiques typiques de la MA, du peptide b-amyloïde (Ab)
et de la protéine tau hyperphosphorylée peuvent provoquer une
apoptose neuronale par stress oxydatif, ce qui conduit finalement à
un dysfonctionnement cognitif. Dans cette étude, nous avons
essayé d'explorer l’effet que peut avoir une alimentation HFD
pendant la lactation sur des souris Thy-Tau par l’étude de la voie
moléculaire sous-jacente de la déficience de la mémoire et du
métabolisme chez les jeunes modèles de souris transgéniques AD
en réponse à HFD puis de réaliser un rapprochement sur l’effet que
ça pourrait induire sur les souris Thy-Tau22 de maladie
d’Alzheimer.
Des souris témoins non transgéniques (non-Tg) et des souris triple
transgéniques AD (3xTg-AD) ont été maintenues avec un régime
normal (ND) contenant 10% de graisse ou HFD (60% de graisse)
pendant 16 semaines. Les fonctions cognitives ont été évaluées par
le labyrinthe aquatique Morris et les tests Y-labyrinthe. Les tests
comportementaux ont montré une altération significative de la
mémoire chez les souris 3xTg-AD nourries avec HFD. HFD n'a pas
modifié les niveaux de protéine Ab et phospho-tau dans la région
corticale indépendamment des groupes et une induction
significative de troubles métaboliques dus à l’allaitement par les
mères nourries au HFD.

Introduction
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par deux types de lésions
histopathologiques qui sont les plaques amyloïdes extracellulaires et les
dégénérescences neurofibrillaires intra neuronales composées de
protéine Tau hyper et anormalement phosphorylée. Tau est
principalement connue pour son rôle clé dans la régulation de la
dynamique microtubulaire.
Dans un modèle murin de pathologie Alzheimer, la souris TG2576 qui
exprime une mutation de la forme humaine du peptide bêta-amyloïde et
qui se caractérise par le développement de dépôts amyloïdes, il a été
montré qu’un régime hyperlipidique pendant la période périnatale
aggrave la pathologie amyloïde chez les descendants adultes (Nizari et
al. 2016). Par ailleurs, il a également été rapporté dans un modèle murin
de MA qui développe à la fois des dépôts amyloïdes et des agrégats de
la protéine Tau qu’un régime hyperlipidique pendant la période
périnatale accentuait les troubles de la mémoire chez les descendants
(Martin et al. 2014). Chez ces animaux transgéniques, les effets du
régime n’affectent pas les dépôts amyloïdes mais augmentent
la production de Tau dans les neurones de l’hippocampe (structure
cérébrale jouant un rôle clé dans la cognition et la mémoire), suggérant
que la protéine Tau pourrait être impliquée dans les troubles observés.
Ceci nous permet alors de poser l’hypothèse qui est la suivante : la
programmation maternelle nutritionnelle périnatale peut-elle exacerber la
pathologie Alzheimer ? Ou en d’autres termes, l’environnement périnatal
peut-il programmer une maladie d’Alzheimer ? Que sait-on des liens
entre environnement et maladie d’Alzheimer ?
L’objectif sera donc d’aborder cette problématique par un modèle
d’excès d’apports nutritionnels riches en lipide au cours de la lactation
chez ces animaux transgéniques Tau et d’observer les conséquences
qui pourraient être induites par des tests physiologiques,
comportementaux et des approches moléculaires.
Je vais aborder cette problématique par une revue de données
existantes, humaines et animales et détailler le projet de recherche et les
protocoles expérimentaux, basés sur un excès d’apports en lipides et en
cholestérol par une alimentation obésogène au cours de la lactation.

II. Matériels et méthodes

II.1 Animaux et régimes
Pour ces expériences 30 femelles (souris ?) homozygotes sauvages et
10 souris Thy-Tau mâles hétérozygotes sont nécessaires. Ils seront
disposés en cage à raison de 3 femelles pour 1 mâle. Lorsque les
femelles seront prises, elles seront alors isolées des mâles jusqu’à ce
qu’elles mettent bas puis il y aura une égalisation des souriceaux à n= 6
souriceaux, c’est-à-dire mettre un nombre égal de souriceaux à chaque
femelle pour qu’ils se nourrissent avec la même quantité de lait.
Puis les femelles seront donc soumises au régime obésogènes tout au
long de la lactation des souriceaux (3 semaines). Ensuite, à partir d’un
certain âge (après sevrage), leurs génotypes (Thy-Tau/WT ou WT/WT)
seront déterminés et, également en fonction de leur sexe, les
souriceaux seront remis dans des cages différentes où ils poursuivront
leur croissance jusqu’à l’âge adulte, et seront alors utilisés pour les
différentes expériences.
(Ainsi ?) Les souris ont été réparties en quatre groupes: souris de type
sauvage avec un régime normal (non-Tg / ND), souris de type sauvage
avec un régime riche en graisses (non-Tg / HFD), des souris 3xTg-AD
avec un régime normal (3xTg-AD / ND) et des souris 3xTg-AD avec un
régime riche en graisses (3xTg-AD / HFD). Elles ont été nourries avec
un régime normal (ND: 10% de matières grasses) ou un régime riche en
graisses (HFD: 60% de matières grasses) pendant 16 semaines avec
un accès d'eau à volonté.

II.2 Suivi des paramètres métaboliques et

physiologiques

II.2.1 Mesure de la prise alimentaire et de la masse pondérale

Des souris femelles C57Bl / 6 âgées de 3 semaines ont été nourries

avec une NCD ou un HFD jusqu'à l'âge de 11 semaines. À l'âge de 10
semaines, les taux de glucose dans le sang ont été déterminés et le
sang de la queue veineuse entière a été recueilli, après un jeûne de 16
h pendant la nuit, pour déterminer l'insuline sérique à jeun. Des
reproductions avec des souris mâles C57Bl / 6 ont été mises en place à
l'âge de 11 semaines. Pendant la gestation, les souris ont été
maintenues selon le même régime qu'elles avaient reçu auparavant.
Pendant la lactation, la moitié des mères (quelles mères ?) ont reçu
l'autre régime alimentaire.
 II.2.2 Evaluation de l’homéostasie glucidique

Des tests de tolérance à l'insuline ont été réalisés avec des animaux de
14 semaines nourris ad libitum. Après avoir mesuré la glycémie basale,
chaque animal a été soumis à une injection intrapéritonéale (i.p.) de
0,75 U kg "1 de poids corporel d'insuline (Actrapid, Novo Nordisk A / S).
Les niveaux de glucose dans le sang ont été enregistrés 15, 30 et 60
minutes après l'injection. Des tests de tolérance au glucose ont été
effectués sur des souris âgées de 15 semaines après un jeûne de 16
heures. Après la détermination de la glycémie à jeun, les animaux ont
été injectés par voie intrapéritonéale avec un bolus de 2 mg mg-1 de
poids corporel de glucose (20% de glucose, Delta Select) et les niveaux
de glucose sanguin ont été surveillés 15, 30, 60 et 120 minutes après
l'injection.

II.3 Tests comportementaux

Des tests comportementaux ont été entrepris pour évaluer l'état de

l'apprentissage et de la mémoire grâce au labyrinthe aquatique Morris et
aux tests du labyrinthe en Y. Le jour du test de comportement, les souris
ont été placées dans la salle d'essai pendant 30 minutes pour
l'habituation avant de commencer les tests.

II.3.1 Piscine de Morris

C’est une technique comportementale largement utilisée pour explorer

la mémoire de référence spatiale d'un rongeur. Cet essai a été effectué
dans une piscine d'eau circulaire (1,26 m de diamètre et 45 cm de
hauteur, température 22 ± 2 ° C), rendue blanche par dissolution de
couleur non toxique. Une plate-forme circulaire blanche (10 cm de
diamètre et 30 cm de hauteur) a été placée dans un quadrant à une
profondeur de 1 cm de la surface de l'eau. Le test a été réalisé pendant
cinq jours consécutifs avec trois essais / jour, suivis d'un essai à sonde
unique le sixième jour comme mentionné précédemment. Dans chaque
essai, la souris a été autorisée à nager pendant 120 s pour trouver la
plate-forme cachée et naviguer dans sa position en fonction de quatre
indices spatiaux différents entourant la piscine. Une fois que la souris a
trouvé la plate-forme, il lui a été permis de rester sur la plate-forme
pendant 10 s. Dans le cas où la souris ne pouvait pas trouver la plate-
forme dans les 120 s, elle y était dirigée, autorisée à rester pendant 10 s
dessus, puis retournée à la cage. Les activités des souris ont été
enregistrées par une caméra vidéo reliée à un ordinateur afin d’analyser
le temps nécessaire pour trouver la plate-forme mesurée comme
latence d'échappement.

II.3.2 Labyrinthe en croix surélevée : Test Y

Le test Y-labyrinthe est un test comportemental spontané d'alternance

destiné à mesurer la mémoire de travail spatiale et basé sur le fait que
les rongeurs préfèrent généralement explorer un nouvel environnement.
Le labyrinthe en Y est constitué d'un compartiment constitué de trois
bras blancs disposés en «Y» à 120 °d’angle. Il a été effectué le jour
suivant après le test MWM. Chaque souris a été placée dans un des
bras du labyrinthe en Y et a pu se déplacer librement sur l'un des trois
bras pendant 8 minutes. Le nombre d'entrées d'armes effectuées par la
souris et le nombre de triades (alternances) effectuées a été enregistré
avec une caméra vidéo reliée à un ordinateur installé avec un
programme EthoVision Pro. Ici, une triade (alternance) se réfère à des
entrées faites par la souris à tous les trois bras consécutivement à la
fois. Au cours de plusieurs entrées parmi les trois bras, la souris devrait
montrer moins d'intérêt à passer à des bras visités de façon répétitive
[15]. Le pourcentage d'alternance spontanée a été calculé pour mesurer
la mémoire de réorganisation spatiale.

II.4 Analyses biochimiques

II.4.1 Western blot

Les souris ont été sacrifiées après l'achèvement des tests

comportementaux. Immédiatement après la décapitation, le cortex
cérébral a été disséqué et conservé instantanément à -80 ° C. Le cortex
a été homogénéisé dans un tampon RIPA en utilisant un
homogénéisateur automatique.
Les blots ont été sondés avec des anticorps primaires contre: oligomère
amyloïde, p-Tau, Tau, phospho-glycogène synthase kinase 3a / b, GSK-
3a / b, pour identifier les biomarqueurs appropriés responsables de
troubles de la mémoire.

II.5 Analyses moléculaires :

Des hypothalamus ont été disséqués en utilisant des matrices

cérébrales. L'ARNm isolé de ce tissu a été analysé en utilisant une PCR
quantitative en temps réel. L'ARN a été isolé. L'ARN a été transcrit de
façon inverse et amplifié. L'expression relative des ARNm cibles a été
ajustée pour la teneur en ARN total par l'hypoxanthine guanine
phosphoribosyl transferase 1 (Hprt1) ARN quantitative PCR. Les calculs
ont été effectués par une méthode comparative (2-ΔΔCT). La PCR
quantitative a été réalisée sur un système de détection de séquence.

III. Résultats attendus

But du projet: A partir des données pré-existantes poser des
hypothèses sur les effets d’une nutrition hyperlipidique sur la
progéniture au cours de la lactation chez les souris THY-TAU22, modèle
murin de maladie d’Alzheimer.

➢L'alimentation HFD maternelle exclusivement

pendant la lactation prédispose la progéniture aux
troubles métaboliques
Des expériences ont été réalisées pour évaluer l’effet d’une HFD
maternelle sur les descendants.
Tous les groupes de descendants ont été soumis à une caractérisation
métabolique. Lorsque les descendants mâles ont reçu une NCD, seules
les souris dont les mères ont reçu un HFD pendant l'allaitement (NCD /
HFD) ont montré une augmentation significative du poids corporel tout
au long de leur vie adulte par rapport à tous les autres groupes.
Constamment, les souris NCD / HFD ont montré une teneur élevée en
graisse corporelle, une augmentation du poids du coussinet adipeux
périgonadal et des niveaux élevés de leptine sérique par rapport aux
souris NCD / NCD. En outre, les souris NCD / HFD ont montré une
résistance accrue à l'insuline et intolérance au glucose par rapport à tout
autre groupe de progéniture.
Pris ensemble, l'exposition des mères à un HFD exclusivement pendant
la phase de lactation exerce les effets les plus forts sur les modifications
de l'énergie et l'homéostasie du glucose chez les descendants mâles et
femelles. En se basant sur cette expérience on pourrait poser
l’hypothèse que la lactation par une femelle recevant une alimentation
riche en graisse (HFD) serait alors susceptible d’engendrer encore plus
de troubles métaboliques chez les souris descendantes, par rapport aux
souris contrôles (souris AD allaitées par une mère nourrie au NCD).

➢ HFD altére l'apprentissage et la fonction de

mémoire chez les souris 3xTg-AD

L'effet du HFD sur la fonction cognitive a été analysé en effectuant un

test MWM suivi du test Y-labyrinthe. Dans un premier temps, un test
MWM a été réalisé pour évaluer l'état et / ou comparer la mémoire
spatiale de différents groupes de souris. La latence d'échappement
moyenne pour trouver la plate-forme cachée pendant l'entraînement au
test MWM pendant six jours consécutifs a été surveillée dans chaque
groupe de souris.
Le groupe de souris 3xTg-AD alimenté par HFD a montré une latence
d'échappement moyenne élevée soutenue pendant des jours
d'entraînement par rapport à la non-Tg alimentée par HFD et à la 3xTg-
AD alimentée par ND ainsi que des groupes non-Tg indiquant que la
conservation de la mémoire pour naviguer dans la plate-forme avait été
fortement altérée en raison de la consommation de HFD en particulier
chez les souris 3xTg-AD (figure A). Elles n'ont pas pu apprendre aussi
efficacement par rapport aux souris nourries au ND pour relocaliser la
plate-forme cachée pendant une série d'essais de six jours consécutifs,
ce qui suggère qu'elles étaient plus affectées par HFD par rapport aux
souris témoins non-Tg.
Les souris non-Tg nourries avec ND ou HFD ont appris rapidement à
monter sur la plate-forme à partir du 3ème jour d'entraînement tandis
que les souris 3xTg-AD alimentées par HFD ont pris plus de temps.

Le dernier jour, le test de sonde a montré que les souris 3xTg AD

nourries avec HFD passaient le moins de temps dans ce quadrant de
test MWM où la plate-forme cachée était placée pendant l'entraînement
(figure B).
Le test du labyrinthe en Y a été effectué le lendemain du test MWM. Les
souris 3xTg AD alimentées par HFD présentaient un pourcentage moyen
d'alternance spontanée relativement plus faible que les souris nourries
au ND, supportant l'altération de la mémoire sur la consommation de
HFD (figure C).

Figure 1: Effet du HFD sur la déficience cognitive Des

souris femelles âgées de 8 semaines ont été nourries
avec ND ou HFD pendant 16 semaines. (A) le test MWM
(B) Le test de sonde (C) Y-labyrinthe test
 ➢ HFD n’agit pas sur La phosphorylation de Tau et
l’expression de l’oligomère Ab

Dans l'analyse par transfert de Western du tissu cortical, le niveau

d'expression de l'oligomère Ab et du p-Tau n'a pas été modifié de
manière significative entre les groupes quel que soit le régime et le
génotype (figure A et figure B). De plus, l'activité de GSK-3b, est
impliquée dans la phosphorylation.
 Figure 2: Effet du HFD sur les niveaux d'expression des
IV. oligomères Ab, protéine p-Tau et pGSK-3b Les effets du HFD
sur l'accumulation de l'oligomère Ab (A), la phosphorylation de
la protéine tau (B) et l'activation de GSK-3b (C) dans le cortex
cérébral

Discussion
Les études montrent que l'obésité, le diabète et l'hyperglycémie pendant
la grossesse et l'allaitement ont des effets à long terme sur les futurs
pronostics de santé de la progéniture (Plagemann, 2012; Sullivan et
Grove, 2010). Afin de mieux comprendre les processus moléculaires
sous-jacents à ce phénomène appelé « programmation métabolique»,
nous avons cherché à identifier l’altération de l'énergie et l'homéostasie
du glucose chez les descendants qui pourraient être causées par l’HFD.
Notre étude montre non seulement que la période de lactation chez les
rongeurs est la plus sensible au développement altéré, prédisposant la
progéniture pour les maladies métaboliques (Sun et al., 2012); mais
l'exposition courte à HFD pendant cette phase de développement
distincte est suffisante pour prédisposer la progéniture pour les troubles
métaboliques.
Le test MWM, Test de labyrinthe et le test de sonde ont montré une
altération significative de l'apprentissage et de la mémoire chez les
souris 3xTg-AD avec une performance réduite pour trouver la plate-
forme cachée car elles ont passé moins de temps dans le quadrant où la
plate-forme a été conservée pendant les essais d'entraînement. La
fonction cognitive est relativement altérée chez ces souris due à L’HFD
qui s’explique par la réduction du pourcentage d'alternance spontanée
moyenne après le test de Y. Les souris non-Tg nourries avec des HFD
ou ND et 3xTg-AD nourries avec ND ne présentaient aucun
dysfonctionnement cognitif significatif. Donc l’alimentation au HFD a
vraiment un effet d’augmentation des troubles chez les descendants. Ce
test de comportement suggère que les souris 3xTg AD nourries avec
HFD avaient de graves déficits d'apprentissage et de mémoire par
rapport au control. L’alimentation riche en graisse des mères pendant la
lactation pourrait altérer la mémoire chez les souris Thy-Tau.

Dans cette étude, l'effet de HFD sur la dégradation de la mémoire au

stade pré-vieillissement et ses mécanismes moléculaires sous-jacents
ont été étudiés (observés peut-être) chez des souris 3xTg-AD. Cette
étude n'a montré aucune altération de l'oligomère Ab et du p-tau
indépendamment du génotype et du régime alimentaire. Bien que les
enchevêtrements d'Ab et de p-tau s'intensifient dans la pathogenèse de
la MA, une étude récente utilisant le modèle de souris 3xTg-AD a établi
le fait que les graisses alimentaires induisent une déficience cognitive
sans aucune implication de la pathologie Ab ou tau. Un point clé qui peut
être noté est que HFD n'aggrave pas de manière significative l'oligomère
d'Ab à la juvénile ou au stade jeune des souris. Ainsi, on peut s'attendre
à ce que HFD altère l'état de la mémoire au pré-vieillissement n'est pas
probable en raison de la neuropathologie Ab et tau AD-connexes.
Comme l’étude a révélé que le HFD altère la mémoire sans augmenter
l'oligomère et les enchevêtrements d'Ab.

Il n'y a pas de différence significative dans les niveaux oligomères et p-

tau Ab et l'activation de GSK-3b par phosphorylation dans tous les
groupes, indépendamment du génotype et de l'alimentation. Ceci
pourrait alors laisser penser qu’une alimentation riche en graisse au
cours de la lactation n’augmente pas la phosphorylation de Tau ni la
formation de l’agrégat amyloïde chez les souris Thy-Tau. On pourrait
penser que l’alimentation aux HFD de la mère pendant la lactation aurait
également le même effet chez les souris Thy-Tau en rapprochant ces
expériences à celles vues précédemment en rapport avec l’effet de
l’alimentation aux HFD sur les descendants.

V. Conclusion
Il a été démontré que l'exposition périnatale à l'HFD réduit l'innervation
sympathique hépatique chez les primates non humains (Grant et al.,
2012). Ainsi, la modification du métabolisme maternel pendant le
développement peut en outre affecter (directement ou indirectement) les
voies autonomes en aval, détériorant ainsi potentiellement la bonne
régulation de l'énergie et l'homéostasie du glucose chez les descendants
Les mères lourdes ont des bébés lourds - une conclusion simpliste des
études démontrant que l'obésité maternelle, le diabète et l'hyperglycémie
pendant la grossesse et l'allaitement ont des effets à long terme sur les
futurs pronostics de santé de la progéniture.
Cependant, on pourrait se demander sur les gènes qui seraient touchés
chez ces souris, ceci pourraient être démontré par une approche
globale: RNAseq qui permettra de mieux visualiser les gènes qui sont
alors impliqués.

VI. References Bibliographique

https://www.researchdiets.com/opensource-diets/dio-
series-diets

https://pdfs.semanticscholar.org/ce39/91063c4a587991ed
3dd20b7b927992766ad3.pdf

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=mice+lactat
ion
 Annexe
Coût du projet

Animale
-Charles river
-Janvier
-Harlan
Régime (Diète) : 5-10kg (pour 30 femelles
environ12000 euros)
-SAFE
-New Brunswick

Expériences
-Anti-corps, test de tolerance au
glucose+leptine+insuline (2000 euros)
-RNAseq
-24 echantillons environ 15000 euros
soit 30000euros