article original abc

Ann Biol Clin 2005 ; 63 (1) : 27-41

Évaluation multicentrique de quatre méthodes

de dosage direct du cholestérol-LDL

P. Bayer1 Résumé. Les recommandations internationales soulignent l’importance de la

F. Veinberg2 détermination du cholestérol-LDL (C-LDL) dans la prise en charge et le suivi
R. Couderc2 des patients à risque cardiovasculaire. Dans la plupart des études et en pratique
courante le C-LDL est estimé par la formule de Friedewald. L’exactitude de ce
C. Cherfils3 calcul est étroitement dépendante de la précision des paramètres pris en compte
M. Cambillau4 (cholestérol total, triglycérides (TG) et cholestérol-HDL) et le C-LDL calculé
C. Cosson5 n’est plus corrélé aux méthodes de référence quand les TG sont supérieurs à
S. Fradin6 4,5 mmol/L ou en présence de lipoprotéines anormales. Ces restrictions et
incertitudes du C-LDL calculé ont conduit au développement récent de métho-
P. Gillery7
des directes, homogènes et adaptables sur les analyseurs de biochimie usuels.
J. Steinmetz8 L’évaluation multicentrique de quatre réactifs de dosage direct du C-LDL
A. Legrand5 (Daiichi, Denka Seiken, Kyowa, Wako) a été réalisée dans huit laboratoires
M. Egloff3 utilisant différents automates d’analyse, et sur 45 échantillons sériques (TG
I. Beucler3 inférieurs à 3,1 mmol/L). Pour trois de ces méthodes (Daiichi, Kyowa, Wako),
la reproductibilité inter-laboratoire est nettement améliorée par rapport à celle
1
Laboratoire de biochimie et Centre du C-LDL calculé. Les nouvelles méthodes ont été comparées à une méthode
clinicobiologique des lipides (Arcol),
Groupe Hospitalier L’Archet, Nice de référence (bêta-quantification) à laquelle elles se sont toutes montrées hau-
<bayer.p@chu-nice.fr> tement corrélées. Les biais moyens sont plus importants pour la méthode
2
Laboratoire de biochimie, Hôpital Denka Seiken que pour Kyowa et Daiichi (bien que moins dispersés pour cette
Armand Trousseau, AP-HP, Paris dernière) et pour la méthode Wako tous les biais sont positifs. La variation des
3
Laboratoire des lipides, Service de biais a été étudiée en fonction des paramètres lipidiques des sérums dosés.
biochimie médicale, Groupe hospitalier Pour trois méthodes, Daiichi, Kyowa et Wako, il existe une relation positive
Pitié-Salpêtrière, AP-HP, Paris
4
significative entre les biais et le rapport C-VLDL/TG qui indique que l’enri-
Laboratoire de biochimie, Unité
cardiovasculaire, Hôpital européen chissement en cholestérol des VLDL est une source de variabilité dans les
Georges Pompidou, AP-HP, Paris dosages. La spécificité des quatre méthodes a été testée en situation de dyslipi-
5
Laboratoire de biochimie, Centre démie réalisée par des ajouts de lipoprotéines (chylomicrons, VLDL, HDL).
hospitalier de Bicêtre, AP-HP, Cette approche fait apparaître des différences de comportement notamment
Le Kremlin Bicêtre liées à la surcharge en VLDL : aucune méthode n’est à proprement parler
6
Laboratoire de biochimie, spécifique, mais jusqu’à 8 mmol/L de TG les variations sont acceptables ; en
CHU Côte de Nacre, Caen
7
présence d’hyperlipoprotéinémie de type III, cependant, seule la méthode
Laboratoire central de biochimie,
Hôpital Robert Debré, Reims Denka Seiken est utilisable. La linéarité des tests jusqu’à 20 mmol/L de C-LDL
8
Laboratoire de biologie clinique, (Daiichi et Denka Seiken) ou 14 mmol/L (Kyowa et Wako), permet leur utilisa-
Centre de médecine préventive, tion dans la grande majorité des cas de pratique quotidienne. Ces méthodes de
Vandœuvre-Les-Nancy dosage direct apportent un progrès technologique indiscutable en termes de
performances analytiques et d’aisance de mise en œuvre. Leur utilisation dans
le diagnostic et le suivi des hyperlipidémies devrait devenir une alternative au
calcul de Friedewald dont elles dépassent les limites d’application.
Mots clés : dosage direct, cholestérol-LDL

Abstract. International guidelines emphasize the importance of LDL choleste-

rol (LDL-C) assay in the care and follow-up of patients with cardiovascular
Article reçu le 7 mai 2004, risk. Most studies and common practice use Friedewald’s formula for LDL-C
accepté le 2 septembre 2004 calculation. The accuracy of the result depends closely on the precision of the

Tirés à part : P. Bayer

Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005 27

article original

input parameters (total cholesterol, triglycerides (TG) and HDL cholesterol),

and discrepancies between calculated LDL-C and measurement by reference
methods appear when TG exceed 4.5 mmol/L, or in the presence of abnormal
lipoproteins. These restrictions and uncertainties in calculations have prompted
the recent development of direct and homogeneous methods that fit all analy-
zers. A multicenter evaluation of four direct assays of LDL-C (Daiichi, Denka
Seiken, Kyowa, Wako) was carried out on 45 serum samples (TG below 3.1
mmol/L) in eight laboratories using different analyzers. For three methods
(Daiichi, Kyowa, Wako), the interlaboratory reproducibility was markedly im-
proved relative to that of calculation. A strong correlation was found for all
new methods when compared with a beta-quantification assay. Average bias in
Denka Seiken assays was greater than Kyowa’s and Daiichi’s (although less
dispersed for the latter) and for Wako all bias were positive. The relationship
between bias variations and the lipid parameters of the samples was studied.
Three methods, Daiichi, Kyowa and Wako, revealed a significant positive
correlation between bias and serum VLDL-C/TG ratio, clearly indicating that
cholesterol enrichment of VLDL was a source of variability in these assays.
Specificity of the four methods was tested in situation of dyslipidemia by
spiking isolated lipoproteins (chylomicrons, VLDL and HDL). This experi-
ment revealed differences in behavior, most evidently upon addition of VLDL.
No method was truly specific, but up to 8 mmol/L of TG the variations were
acceptable. In the presence of type III hyperlipoproteinemia, however, only the
Denka Seiken method was reliable. Linearity up to 20 mmol/L (Daiichi, Denka
Seiken) or 14 mmol/L (Kyowa, Wako) of LDL-C allows these tests to be used
in main routine cases. New direct assays are an obvious technological advance
in terms of analytical performance and conveniency. Their use for the diagnosis
and follow-up of hyperlipidemic patients offers an alternative that overcomes
the limitations of the Friedewald calculation.

Key words: direct assays, homogeneous assays, LDL-cholesterol

L’hypercholestérolémie et particulièrement l’augmenta-
tion de la fraction de cholestérol liée aux lipoprotéines de
faible densité (cholestérol-LDL, C-LDL) représente un ris-
que cardiovasculaire bien établi [1, 2] et les études de
prévention primaire et secondaire confirment clairement la
relation entre concentration de C-LDL et morbi-mortalité
cardiovasculaire [3, 4]. C’est pourquoi les recommanda-
tions internationales placent la détermination de ce para-
mètre au premier plan [5]. Ainsi, un dosage exact et précis
du C-LDL est nécessaire afin d’identifier de façon appro-
priée les patients présentant une hypercholestérolémie et
suivre leurs réponses aux divers traitements.
En routine, le C-LDL ne peut être mesuré directement par
ultracentrifugation (ou bêta-quantification), car il s’agit
d’une méthode laborieuse et chère et jusqu’à présent, ce
paramètre était estimé par la formule de Friedewald [6],
basée sur trois dosages indépendants : cholestérol total
(CT), cholestérol-HDL (C-HDL) et triglycérides (TG). Ce-
pendant, même si la formule de Friedewald est générale-
ment bien corrélée avec la méthode de référence, ce qui lui
a permis d’être utilisée depuis 30 ans avec une satisfaction
correcte [7], elle présente certains écueils : elle cumule
nécessairement l’imprécision analytique de trois dosages
[8] et ne peut être appliquée si le prélèvement n’est pas
réalisé à jeun ou lorsque la concentration de triglycérides
est supérieure à 4,52 mmol/L (4 g/L) ou encore lors d’hy-
perlipoprotéinémie de type III [6, 9]. De plus, certaines
études mettent en évidence l’inexactitude de ce calcul lors
de concentrations modérément augmentées de TG (entre 2
et 4 g/L) [10, 11] ou lors d’hyperlipoprotéinémies secon-
daires comme dans le diabète [12, 13] ou l’insuffisance
rénale [14, 15]. Ces dernières années ont vu l’introduction
sur le marché de méthodes homogènes directes et automa-
tisées de dosage du C-HDL [16, 17], et grâce à ces métho-
des les performances analytiques du C-LDL calculé ont pu
sensiblement être améliorées. Des méthodes semi-
automatisées de dosage de C-LDL avaient déjà été
proposées et faisaient appel soit à des précipitations chi-
miques soit à une immunoséparation (méthodes hétérogè-
nes). Cependant, elles ne semblaient pas offrir de réels

28 Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005


avantages en précision, exactitude ou spécificité [18, 19].
C’est également pour pallier les inexactitudes de la for-
mule de Friedewald que d’autres équations ont été propo-
sées, parmi elles, la formule de Planella [20], mettant en
jeu l’apolipoprotéine B (ApoB) dont la standardisation est
plus accomplie que celle du C-HDL [21]. Ces équations
présentent le même inconvénient à savoir l’obligation de
déterminer simultanément plusieurs paramètres et d’intro-
duire autant de facteurs d’erreur potentiels.
C’est dans cet état d’esprit d’incertitude vis-à-vis du
C-LDL calculé qu’une nouvelle génération de méthodes
de dosage direct de C-LDL vient d’être mise au point. Il
s’agit de méthodes homogènes, entièrement automatisées
qui permettent la détermination du C-LDL dans des volu-
mes d’échantillons très faibles, sur des analyseurs multi-
paramétriques et sans aucun pré-traitement, apportant ainsi
un réel progrès méthodologique et laissant espérer de net-
tes améliorations sur les méthodes antérieures et spéciale-
ment sur le calcul de Friedewald [22].
L’objectif a donc été de comparer dans une étude multi-
centrique les concentrations en C-LDL de 45 échantillons
sériques obtenues par quatre méthodes directes sur huit
analyseurs à celles obtenues par le calcul et à la technique
dite de référence, c’est-à-dire la mesure de la concentra-
tion en cholestérol des LDL par une méthode de bêta-
quantification. Le deuxième objectif était de vérifier la
spécificité de ces méthodes, par des ajouts de lipoprotéi-
nes isolées par ultracentrifugation, en contrôlant que d’une
part, seul le cholestérol des LDL était ainsi dosé et, d’autre
part, le C-LDL était bien dosé dans sa totalité.
Méthodes et matériel
Méthodes de dosage du cholestérol-LDL
Bêta-quantification
Les lipoprotéines de densité inférieure à 1,019 g/mL (chy-
lomicrons, VLDL, IDL) ont été isolées par ultracentrifu-
gation (rotor NVT 90, 560 196 g, à 10 °C, 135 min,
ultracentrifugeuse Beckman Optima XL 90) [23] et récu-
pérées par aspiration du surnageant. Les lipoprotéines LDL
et HDL ont été recueillies dans les sous-nageants
(d > 1,019 g/mL). Le cholestérol des sur- et sous- nageants
a été dosé en double, dans les mêmes conditions que pour
les sérums. Le rendement de l’ultracentrifugation était de
97,13 ± 4,15 % calculé d’après la somme des concentra-
tions en cholestérol dans les fractions de d < 1,019 et
d > 1,019, rapportée au CT du sérum. Dans les fractions
de d > 1,019 g/mL, le C-HDL a été dosé après précipita-
tion des LDL par du phosphotungstate de sodium/chlorure
de magnésium (PTA), suivant le protocole recommandé
par l’Arcol/SFBC [24]. Les concentrations du cholestérol
des LDL par bêta-quantification (C-LDL bQ) ont été obte-
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005
Dosage du cholestérol-LDL
nues par le calcul suivant : C-LDL bQ = [CT] – [cholesté-
rol de la fraction de d < 1,019] – [C-HDL]. La pureté des
différentes fractions a été contrôlée par électrophorèse sur
gel d’agarose (Hydragel-Lp(a) Plus, Sebia, France). Afin
de s’assurer de l’exactitude des concentrations du C-HDL
dans les fractions de d > 1,019 g/mL, celui-ci a été aussi
dosé par une méthode directe à l’a-cyclodextrine (Roche
Diagnostics) et aucune différence significative n’a été
constatée entre les résultats des deux méthodes. Ces
concentrations n’étaient pas non plus significativement dif-
férentes (p > 0,05) des concentrations de C-HDL des sé-
rums (méthode directe Roche Diagnostics).
Méthodes directes de dosage du C-LDL
Quatre méthodes directes homogènes ont été testées. Elles
sont fondées sur l’action consécutive de deux réactifs, le
premier (R1) est destiné à bloquer ou solubiliser sélective-
ment certaines classes de lipoprotéines, le second (R2)
permet le dosage spécifique enzymatique du C-LDL dans
la même cuvette.
1 - Procédé Daiichi
Cette méthode consiste à solubiliser sélectivement par un
détergent ionique, contenu dans le premier réactif R1, les
lipoprotéines non LDL (chylomicrons, VLDL, HDL) dont
le cholestérol libéré réagit avec les enzymes cholestérol
estérase, cholestérol oxydase et peroxydase. Le peroxyde
d’hydrogène généré réagit avec la 4-amino-antipyrine mais
ne peut former de dérivé coloré car le sel disodique de la
N,N’-bis-(4-sulfobutyl)-m-toluidine (DSBmT) est absent
de R1. Dans la deuxième étape (R2), un autre détergent
permet l’accessibilité des enzymes cholestérol estérase et
cholestérol oxydase au C-LDL. En présence de peroxy-
dase, le peroxyde d’hydrogène généré réagit avec le chro-
mogène (4-amino-antypirine du premier réactif) et le DS-
BmT pour former un produit coloré dont l’absorbance est
mesurée à 660 nm. Cette méthodologie est commerciali-
sée en France par BioMérieux (N-Geneous™LDL-C, Gen-
zyme Corporation).
2 - Procédé Denka Seiken
Cette méthode consiste dans une première étape (R1) à
faire agir un surfactant pour libérer le cholestérol des lipo-
protéines non LDL, qui réagit alors avec les enzymes cho-
lestérol estérase et cholestérol oxydase. Le peroxyde d’hy-
drogène généré est transformé sous l’action d’une catalase.
Dans la deuxième étape (R2), plusieurs détergents vont
agir spécifiquement sur les LDL dont le cholestérol sera
dosé par les cholestérol estérase et cholestérol oxydase.
De l’azide de sodium inhibe la catalase de R1 et le pe-
roxyde d’hydrogène généré réagit avec la peroxydase de
R2 en présence de 4-amino-antipyrine et de sel disodique
de la N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-diméthoxyaniline
pour former un complexe bleu dont l’intensité est mesurée
29
article original
à 600 nm. Cette méthodologie est commercialisée par les
laboratoires Randox (direct LDL-Cholesterol).
3 - Procédé Kyowa
Cette méthode consiste à masquer les chylomicrons et
VLDL par des sulfates d’a-cyclodextrine et de dextran en
présence d’ions Mg++ contenus dans R1. Les complexes
ainsi formés sont alors insensibles à l’action des enzymes
contenues dans R2. Le second réactif contient, en outre,
un détergent qui forme des micelles avec les HDL et les
chylomicrons et VLDL précédemment stabilisés, afin d’in-
hiber leur réactivité vis-à-vis des enzymes cholestérol esté-
rase et cholestérol oxydase. Seul le cholestérol des LDL
est susceptible de réagir et en présence de peroxydase, le
peroxyde d’hydrogène généré réagit avec la 4-amino-
antipyrine et la N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-
diméthoxyaniline pour former un dérivé dont l’intensité
de la coloration est mesurée à 585 nm. Cette méthodologie
est commercialisée par Roche Diagnostics (LDL-C Plus)
et par Thermo Clinical Labsystems (LDL-Cholesterol).
4 - Procédé Wako
Un agent « protecteur » (polyanions et surfactant ampho-
tère) masque les LDL aux détergents et aux enzymes cho-
lestérol estérase et cholestérol oxydase qui agissent alors
dans la première étape (R1) sur le cholestérol des lipopro-
téines non LDL. Le peroxyde d’hydrogène généré est éli-
miné par une catalase. Dans la deuxième étape (R2), les
LDL sont décomplexées par un surfactant non ionique et
leur cholestérol est dosé par les enzymes du premier réac-
tif. Le peroxyde d’hydrogène généré réagit avec la peroxy-
dase en présence de N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-
dimethoxyaniline et de 4-amino-antipyrine, pour former
un produit bleu dont l’absorbance est lue à 600 nm. Sigma
commercialisait ce procédé sous le label Cholesterol EZ
LDL™ (réactif repris par la société Ingen).
Équations pour le calcul du cholestérol-LDL
Formule de Friedewald [6] : le cholestérol-LDL est cal-
culé par l’équation suivante :
C-LDL (mmol/L) = CT (mmol/L) – C-HDL (mmol/L) –
TG/2,2 (mmol/L)
(ou C-LDL (g/L) = CT (g/L) – C-HDL (g/L) – TG/5 (g/L))
Formule de Planella modifiée [20, 11] : le cholestérol-
LDL est estimé par l’équation suivante :
C-LDL (mmol/L) = CT × 0,41 (mmol/L) – TG × 0,32
(mmol/L) + ApoB × 1,7 (g/L)
Analyseurs
Huit laboratoires ont participé à l’étude multicentrique
représentant un total de 6 modèles d’analyseurs : lab 1 -
Synchron CX4 (Beckman Coulter), lab 2 - Hitachi 917
[A] (Roche Diagnostics), lab 3 - Dimension RXL (Dade
Behring S.A), lab 4 - Olympus AU 600 (Olympus-Merck),
30
lab 5 - Hitachi 917 [B], lab 6 - Konelab 20 (Thermo
Clinical Labsystems), lab 7 - Hitachi 911 [A], lab 8 -
Hitachi 911 [B].
Les méthodes Daiichi et Denka Seiken ont été évaluées
par tous les laboratoires. La méthode Kyowa a été évaluée
sur les deux Hitachi 917 [A et B] (lab 2 et 5), les deux
Hitachi 911 [A et B] (lab 7 et 8) et sur le Konelab 20 (lab
6), les adaptations n’étant pas disponibles pour les autres
analyseurs. La méthode Wako a été évaluée sur les analy-
seurs CX4 (lab 1), Hitachi 917 [A et B] (lab 2 et 5),
Olympus AU 600 (lab 4) et Hitachi 911 [B] (lab 8). Les
adaptations communiquées par les fabricants ont été pro-
grammées sur les différents analyseurs plusieurs jours
avant l’étude et validées par des petites séries d’échan-
tillons incluant les contrôles fournis dans les coffrets. Les
mêmes lots de réactifs, calibrateurs et sérums de contrôle
ont été fournis aux différents laboratoires.
Chaque laboratoire a effectué des études préliminaires de
répétabilité et reproductibilité sur des sérums à diverses
concentrations en C-LDL et sur les sérums de contrôle.
Les coefficients de variation (CV) trouvés (≤ 2 % pour les
répétabilités et ≤ 3 % pour les reproductibilités) satisfai-
saient aux recommandations internationales [25] et concor-
daient avec ceux annoncés dans la littérature [22].
Échantillons sériques
Pour l’étude multicentrique, des fractions aliquotes non
nominatives provenaient d’échantillons sanguins analysés
quotidiennement par le laboratoire 6. Il s’agissait d’une
population non triée et sans dyslipidémie majeure. Les
prélèvements ont été réalisés sur une seule journée (j0)
après 12 heures de jeûne, sur tubes secs avec gélose sépa-
ratrice (Vacutainer). Après centrifugation à 3 500 g pen-
dant 10 minutes à 10 °C, les sérums ont été immédiate-
ment décantés et aliquotés. L’analyse des paramètres
lipidiques a été réalisée le jour du prélèvement, en double.
Les échantillons (n = 45) ont été alors sélectionnés sur des
concentrations en triglycérides inférieures à 3,1 mmol/L
(2,8 g/L) afin d’éviter toute erreur d’estimation du C-LDL
calculé par la formule de Friedewald [11], puis ils ont été
expédiés à 4 °C par transport express, dès j0 à tous les
laboratoires participant à l’étude multicentrique. Les labo-
ratoires ont reçu les échantillons le lendemain matin (j1) et
ont effectué les dosages de CT et TG par des méthodes
enzymatiques classiques, du C-HDL par une méthode de
dosage direct recommandée par l’Arcol (a-cyclodextrine
ou polyanions-détergent) [16] et de l’ApoB par néphélé-
métrie ou turbidimétrie (sur l’automate dédié aux dosages
quotidiens de ce paramètre). La Lp(a) a été dosée par deux
laboratoires en immunonéphélémétrie (Dade Behring)
avec une limite inférieure de détection fixée à 0,10 g/L.
Les 8 laboratoires participants étaient soumis au contrôle
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005

Tableau 1. Profil lipidique des sérums testés. Paramètres
résultant de 45 échantillons, sauf *Lp(a), résultant de 34
échantillons (11 sérums indétectables, Lp(a) < 0,10 g/L).
Paramètre Moyenne (± ET)
Cholestérol total (mmol/L) 6,16 (± 1,28)
Triglycérides (mmol/L) 1,30 (± 0,59)
Cholestérol-HDL (mmol/L) 1,51 (± 0,47)
ApoB (g/L) 1,18 (± 0,29)
Lp(a) (g/L) * 0,39 (± 0,30)
C-LDL β-quantification (mmol/L) 4,03 (± 1,04)
de qualité hebdomadaire de l’Arcol (CCTB Toulouse) et
avaient satisfait aux critères d’exactitude exigés.
Les caractéristiques des 45 échantillons sériques utilisés
dans l’étude multicentrique sont résumées dans le ta-
bleau 1.
Deux séries indépendantes de dosages de C-LDL direct
ont été réalisées à j1 et à j2 dans chaque laboratoire. Les
résultats des 4 séries n’étant pas significativement diffé-
rents, nous avons alors retenu la moyenne des résultats de
chaque échantillon pour chaque méthode.
Études de la linéarité et de la spécificité
des méthodes directes de dosage
du cholestérol-LDL
Les limites de validité des méthodes de dosage direct de
C-LDL ont été définies par la méthode d’ajouts de lipo-
protéines isolées par ultracentrifugation à partir de sérums
individuels dyslipidémiques (ou de pools de sérums pré-
sentant le même profil lipidique). Les chylomicrons ont
été isolés à la densité d < 0,99 g/mL pendant 30 min
(Rotor 50.0 Ti, à 20 °C, 26 477 g, sur une ultracentrifu-
geuse Beckman L8-55) ; les VLDL (d < 1,006 g/mL), les
LDL (1,019 < d < 1,063 g/mL) et les HDL (1,085 < d
< 1,21 g/mL) ont été isolées respectivement pendant 135
min, 3 h et 4 h (Rotor NVT 90, à 10 °C, 560 196 g sur une
ultracentrifugeuse Beckman Optima XL 90) [16].
Études de la linéarité
La linéarité pour les valeurs élevées de C-LDL a été véri-
fiée par ajouts de LDL isolées à un sérum hypocholestéro-
lémique de façon à faire varier les concentrations en
C-LDL de 1,54 mmol/L (0,6 g/L) à 19,71 mmol/L (7,7
g/L) dans le milieu réactionnel. La linéarité pour les va-
leurs basses de C-LDL a été étudiée par dilution d’un
sérum hypercholestérolémique (C-LDL = 6,91 mmol/L
soit 2,7 g/L) dans un sérum dépourvu de lipoprotéines
(SDLP) préparé par ultracentrifugation (4 h 30) à la den-
sité de d > 1,25 g/mL, faisant varier le C-LDL théorique
de 6,91 à 0,35 mmol/L (2,7 à 0,14 g/L).
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005
Dosage du cholestérol-LDL
Études de la spécificité
La spécificité de ces méthodes a été vérifiée en ajoutant
des quantités variables de chylomicrons, VLDL et HDL
Min/max isolés par ultracentrifugation.
4,13/9,62
Les HDL (HDL2 et HDL3) ont été ajoutées à un sérum
0,37/3,07
(C-HDL = 1 mmol/L (0,39 g/L) ; C-LDL = 4,1 mmol/L
0,76/3,09 (1,6 g/L) ; TG = 1,01 mmol/L (0,92 g/L)) faisant varier le
0,69/1,80 C-HDL de 1 à 3,82 mmol/L (0,39 à 1,49 g/L).
0,10/1,34 Les chylomicrons ont été ajoutés à un sérum normotrigly-
2,43/6,58 céridémique (TG = 0,7 mmol/L (0,65 g/L) ; C-LDL = 4,1
mmol/L (1,6 g/L)), faisant varier la triglycéridémie de 0,7
à 26 mmol/L (0,65 à 23,5 g/L).
Les VLDL ont été ajoutées :
– à un sérum normotriglycéridémique et normocholestéro-
lémique (TG = 1,15 mmol/L (1,05 g/L) ; C-LDL = 3,8
mmol/L (1,5 g/L)) faisant varier la triglycéridémie de 1,15
à 10,5 mmol/L (1,05 à 9,56 g/L) ;
– à un sérum normotriglycéridémique et hypercholestéro-
lémique (TG = 1,58 mmol/L (1,44 g/L) ; C-LDL = 7,7
mmol/L (3 g/L)) faisant varier la triglycéridémie de 1,58 à
10,7 mmol/L (1,44 à 9,7 g/L).
Les dosages des C-LDL (par les différentes méthodes di-
rectes) après surcharge ont été effectués en double par
deux laboratoires différents, sur deux automates différents
(Konelab 30 et Hitachi 911). Les résultats n’étant pas
significativement différents, seuls ceux de l’Hitachi ont
été utilisés pour l’étude.
Études statistiques
L’exploitation statistique a été réalisée à l’aide du logiciel
StatView® (SAS Institute Inc., version 5.0). La distribu-
tion des échantillons de C-LDL a été analysée et corres-
pondait à celle d’une population normale. Les résultats
obtenus par les différentes méthodes directes ont donc été
comparés à ceux obtenus par b-quantification (méthode de
référence) par simple régression linéaire en déterminant
les coefficients de régression et les paramètres des droites
correspondantes (pente ± intervalle de confiance au seuil
de 95 % (IC 95%) et ordonnée à l’origine). Par ailleurs,
chaque série a été comparée à la méthode de référence par
un test t sur séries appariées. Les significativités statisti-
ques des différentes variables ont été déterminées à plu-
sieurs seuils (p ≥ 0,05 non significatif). Pour chaque série
de C-LDL direct (y), les biais moyens à ± 2 écarts-types
ont été calculés en pourcentage par rapport à la méthode
de référence (x) selon la formule (y-x/x)×100.
Les coefficients de variation (CV) inter laboratoires ont
été calculés pour chaque échantillon et chaque méthode
sur l’ensemble des laboratoires participants (n = 8 pour les
méthodes Daiichi et Denka Seiken ainsi que pour les
C-LDL calculés, n = 5 pour les méthodes Kyowa et Wako),
puis les valeurs moyennes, minimales et maximales de ces
CV ont été rapportées.
31
article original
Résultats
Étude multicentrique
Les résultats de précision inter laboratoires pour les diffé-
rentes méthodes testées sont rapportés dans le tableau 2.
Les CV moyens inter laboratoires de trois méthodes direc-
tes : Daiichi, Kyowa et Wako sont inférieurs à 2 % (va-
leurs extrêmes : 0,65 % - 3,93 %). Les résultats obtenus
avec la méthode Denka Seiken sont comparables à ceux
obtenus par l’équation de Friedewald (CV moyens inter
laboratoires 4,4 % et 4 % respectivement).
Nous avons comparé chaque méthode sur chaque analy-
seur à la méthode de référence C-LDL ßQ et calculé les
divers paramètres de régression (tableau 3). Toutes les mé-
thodes sont hautement corrélées à la méthode de référence
(p < 0,0001). Les coefficients de régression r sont compris
entre 0,96 et 0,99. Deux méthodes, Daiichi et Wako, pré-
sentent sur tous les analyseurs des coefficients supérieurs
à 0,98.
Pour le C-LDL calculé selon l’équation de Friedewald
ainsi que pour les deux procédés Daiichi et Kyowa, les
paramètres de régression (pentes et ordonnées à l’origine)
montrent une bonne concordance entre ces méthodes et la
bêta-quantification. Ainsi, avec la méthode Daiichi, une
seule pente est significativement différente de 1 (Hitachi
911 [B]) et aucune ordonnée à l’origine n’est significative-
ment différente de 0. Pour la méthode Kyowa, aucune
pente n’est significativement différente de 1 et aucune
ordonnée à l’origine n’est différente de 0. Pour la méthode
Wako, une seule pente est significativement différente de 1
(Olympus AU 600), cependant les ordonnées à l’origine
sont toutes positives et pour deux automates significative-
ment différentes de 0 (Olympus AU 600 et Hitachi 917
[B]). Enfin, avec la méthode Denka Seiken, les pentes de
régression sont significativement différentes de 1 pour 6
analyseurs sur 8 et les ordonnées à l’origine, toutes négati-
ves, significativement différentes de 0 pour 5 analyseurs.
La figure 1 et le tableau 3 analysent les biais (%) des
résultats de C-LDL direct par rapport à ceux de la méthode
de référence pour chaque méthode et pour tous les analy-
seurs concernés. Avec la méthode Daiichi (figure 1A), aucun
biais moyen ne dépasse ± 4 % qui est la valeur limite
recommandée par le NCEP (National cholesterol educa-
tion program) [25]. En effet, on observe des biais moyens
faibles (de – 1,1 % à 2,7 %) pour l’ensemble des analy-
seurs et une dispersion des biais (± 2 écarts-types) modé-
rée : de 8,9 % à 11,4 %. La comparaison de séries appa-
riées fait apparaître une différence significative (p < 0,05)
avec la bêta-quantification (tableau 3) pour 5 automates
mais seul l’analyseur RXL a donné 4 résultats individuels
dont le biais est supérieur à 兩 12 % 兩 (cette valeur de 12 %
représentant la limite admise par le NCEP pour l’erreur
totale du C-LDL [25]). Trois automates ne montrent aucun
32
Tableau 2. Variabilité inter-laboratoires des méthodes de dosage
du cholestérol-LDL.
Méthode CV moyen ± ET Min/max
(%) (%)
Friedewald 4,02 ± 1,37 1,79/9,25
Planella 2,73 ± 0,64 1,60/4,45
Daiichi 1,91 ± 0,68 1,01/3,80
Denka Seiken 4,38 ± 0,71 3,04/6,95
Kyowa 1,71 ± 0,55 0,65/3,93
Wako 1,75 ± 0,58 0,81/3,46
résultat individuel dont le biais est supérieur à 兩 12 % 兩 :
Hitachi 917[A], Olympus AU 600 et Hitachi 911 [A].
Trois automates présentent un seul résultat dont le biais
est supérieur à 兩 12 % 兩 : CX 4, Hitachi 917 [B] et Hitachi
911 [B], et 1 analyseur montre deux résultats dont le biais
dépasse cette limite (Konelab 20). Enfin, il n’y a pas de
relation entre les biais et la concentration en C-LDL.
Avec la méthode Denka Seiken (figure 1B), les biais
moyens sont plus importants et pour trois analyseurs dé-
passent ± 4 % (RXL, AU 600, Konelab 20). La dispersion
des biais est également plus marquée pour tous les auto-
mates. Les comparaisons de séries (tableau 3) montrent
des différences significatives avec la méthode de référence
pour 7 automates sur 8. Le nombre de résultats individuels
dont le biais est supérieur à ± 12 % varie de 3 à 8. Il existe
une relation significative entre la concentration en C-LDL
et les biais (r varie de 0,30 à 0,47 avec des valeurs de p de
0,04 à 0,001) pour 6 analyseurs (sauf RXL et Konelab
20) : les faibles valeurs en C-LDL sont sous-estimées et
les valeurs fortes surestimées.
Pour la méthode Kyowa (figure 1C), les biais moyens sont
modérés de – 2,7 % à 0 %. Cependant, la dispersion des
résultats est importante (± 13 % en moyenne) et le nombre
de résultats individuels dont le biais dépasse 兩 12 % 兩 varie
de 3 à 6. Aucune corrélation significative n’existe entre les
biais et la concentration en C-LDL.
Enfin, en ce qui concerne le procédé Wako (figure 1D), les
biais moyens sont tous positifs, de 1,7 % à 4,9 %. Cette
méthode surestime la valeur du C-LDL comme le montre
également le test t sur séries appariées (p < 0,05 dans tous
les cas). Cependant, la dispersion des résultats est limitée
(± 9,5 % en moyenne) entraînant un nombre faible (1 à 3)
de biais individuels dépassant 兩 12 % 兩 .
Nous avons également recherché s’il existait une relation
entre les biais des différentes méthodes directes et divers
paramètres : CT, TG, C-HDL, Lp(a) ainsi que le rapport
C-VLDL/TG du sérum, le cholestérol-VLDL (C-VLDL)
étant assimilé au cholestérol dosé dans la fraction d <1,019
compte tenu de l’absence de chylomicrons et d’IDL véri-
fiée par le lipoprotéinogramme. Pour les méthodes Daiichi
et Wako, il n’y a pas de variation significative des biais
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005
 Dosage du cholestérol-LDL

lorsque le CT, TG, C-HDL ou la Lp(a) augmentent. Par
contre, sur la plupart des analyseurs, nous avons trouvé
une corrélation positive significative entre les biais de ces
deux techniques et le rapport C-VLDL/TG. Ainsi pour la
technique Daiichi, sur 6 analyseurs : r est compris de 0,30
à 0,37 avec p variant de 0,04 à 0,01 ; pour le CX4 et
Konelab 20, la corrélation n’atteint cependant pas la signi-
ficativité (r = 0,28 ; p = 0,06 et r = 0,23 ; p = 0,12, respec-
tivement). En ce qui concerne la méthode Wako, sur les 5
analyseurs : r varie de 0,30 à 0,41 avec des valeurs de p de
0,04 à 0,005. Ces résultats suggèrent que la composition
des VLDL serait une source de variabilité dans les dosages
par ces deux méthodes. Les biais de la méthode Kyowa ne
présentent pas de variation significative lorsque le CT, le

Tableau 3. Résultats comparés des méthodes de dosage direct et du calcul de Friedewald avec la méthode de référence. Nombre
d’échantillons par série = 45.

Série Corrélation linéairea C-LDLb Biais (%) c

C-LDLx = A × C-LDLβQ + B moyen

Méthode Analyseur A IC95 B (mmol/L) r (mmol/L) m ± 2 ET n > | 12 % |
Daiichi Beckman CX4 1,043 ns 0,991–1,094 - 0,097 ns 0,987 4,107 * 1,6 ± 9,3 1
Hitachi 917 [A] 1,045 ns 0,995–1,096 - 0,117 ns 0,988 4,098 * 1,4 ± 9,3 0
Dade Behring RXL 1,010 ns 0,948–1,072 0,064 ns 0,981 4,137 ** 2,7 ± 11,4 4
Olympus AU 600 1,013 ns 0,964–1,063 - 0,072 ns 0,988 4,014 - 0,6 ± 8,9 0
Hitachi 917 [B] 1,050 ns 0,995–1,105 - 0,127 ns 0,986 4,108 * 1,6 ± 9,9 1
Konelab 20 0,991 ns 0,931–1,051 - 0,004 ns 0,981 3,992 - 1,1 ± 10,6 2
Hitachi 911 [A] 1,031 ns 0,978–1,085 - 0,093 ns 0,986 4,065 0,6 ± 9,7 0
Hitachi 911 [B] 1,054 * 1,001–1,106 - 0,152 ns 0,987 4,097 * 1,3 ± 9,6 1
Denka Seiken Beckman CX4 1,154 *** 1,075–1,232 - 0,498 ** 0,976 4,154 ** 2,2 ± 14,8 4
Hitachi 917 [A] 1,075 * 1,012–1,139 - 0,351 * 0,982 3,986 - 1,8 ± 12,0 4
Dade Behring RXL 1,107 ** 1,031–1,183 - 0,239 ns 0,976 4,225 **** 4,3 ± 14,2 8
Olympus AU 600 1,031 ns 0,977–1,086 - 0,293 * 0,986 3,866 **** - 4,6 ± 10,4 4
Hitachi 917 [B] 1,119 *** 1,054–1,183 - 0,345 * 0,983 4,166 *** 2,7 ± 12,0 3
Konelab 20 0,978 ns 0,913–1,042 - 0,086 ns 0,978 3,856 **** - 4,6 ± 11,4 5
Hitachi 911 [A] 1,090 ** 1,025–1,156 - 0,247 ns 0,981 4,149 ** 2,5 ± 11,6 4
Hitachi 911 [B] 1,128 *** 1,062–1,193 - 0,331 * 0,983 4,215 **** 4,0 ± 12,4 3
Kyowa Hitachi 917 [A] 1,013 ns 0,932–1,094 - 0,151 ns 0,968 3,933 * - 2,7 ± 13,9 6
Hitachi 917 [B] 1,026 ns 0,945–1,107 - 0,133 ns 0,969 4,003 - 0,9 ± 14,1 4
Konelab 20 0,983 ns 0,909–1,058 - 0,034 ns 0,971 3,930 ** - 2,6 ± 12,8 4
Hitachi 911 [A] 1,027 ns 0,949–1,106 - 0,131 ns 0,971 4,012 - 0,7 ± 13,3 3
Hitachi 911 [B] 1,043 ns 0,963–1,123 - 0,162 ns 0,970 4,043 0,0 ± 13,8 4
Wako Beckman CX4 0,980 ns 0,926–1,035 0,191 ns 0,984 4,144 *** 3,0 ± 9,5 2
Hitachi 917 [A] 0,962 ns 0,910–1,014 0,212 ns 0,985 4,091 * 1,7 ± 9,2 1
Olympus AU 600 0,940 * 0,888–0,993 0,322 ** 0,984 4,114 ** 2,5 ± 9,9 2
Hitachi 917 [B] 0,978 ns 0,924–1,022 0,238 * 0,984 4,182 **** 4,1 ± 9,5 3
Hitachi 911 [B] 0,997 ns 0,943–1,052 0,197 ns 0,985 4,219 **** 4,9 ± 9,4 3
Friedewald Beckman CX4 1,001 ns 0,937–1,065 0,027 ns 0,979 4,064 0,8 ± 10,7 2
Hitachi 917 [A] 1,016 ns 0,953–1,079 - 0,229 ns 0,980 3,867 **** - 4,5 ± 11,3 5
Dade Behring RXL 1,030 ns 0,958–1,101 - 0,172 ns 0,975 3,979 - 1,6 ± 12,2 2
Olympus AU 600 1,086 * 1,005–1,166 - 0,183 ns 0,972 4,196 *** 3,7 ± 14,3 5
Hitachi 917 [B] 1,005 ns 0,926–1,084 - 0,105 ns 0,969 3,948 * - 2,3 ± 13,2 4
Konelab 20 0,990 ns 0,917–1,062 0,225 ns 0,973 4,216 **** 4,9 ± 13,2 6
Hitachi 911 [A] 1,026 ns 0,957–1,094 - 0,034 ns 0,977 4,102 1,7 ± 12,5 2
Hitachi 911 [B] 1,020 ns 0,957–1,083 - 0,166 ns 0,980 3,946 ** - 2,4 ± 10,9 1
a
Paramètres de corrélation linéaire des C-LDL obtenus par chaque couple méthode/analyseur (C-LDLx) avec ceux de la b-quantification (C-LDLbQ) : A :
pente de la droite de régression, significativement différente de 1 pour *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ou non significativement différente (ns) ; IC95 :
intervalle de confiance à 95 % de la droite de régression ; B : ordonnée à l’origine, significativement différente de 0 pour *p < 0,05, **p < 0,01 ou non
significativement différente (ns) ; r : coefficient de régression linéaire.
b
C-LDL moyen de chaque série ; écart par rapport à la valeur moyenne de référence (4,032 mmol/L) significativement différent de 0 pour *p < 0,05,
**p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 (comparaison des moyennes appariées par test t).
c
Biais par rapport à la méthode de référence (C-LDLx -C-LDLbQ)/C-LDLbQ : m : moyenne des biais (biais moyen) de chaque série ; n : nombre des biais
de chaque série dépassant ± 12 %.

Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005 33

article original

C-HDL ou la Lp(a) augmentent. En revanche nous avons
trouvé une relation négative entre la concentration en TG
et les biais, non significative pour le Konelab 20 (r = – 0,17,
p = 0,26) et l’Hitachi 911 [A] (r = – 0,27, p = 0,07) et
significative pour les autres analyseurs (r varie entre – 0,30
et – 0,32 avec des valeurs de p entre 0,04 et 0,03). Il existe
pour cette méthode, sur tous les analyseurs, une corréla-
tion positive hautement significative (p < 0,001) entre les
biais et le rapport C-VLDL/TG (r entre 0,51 et 0,56).
À la différence des trois autres méthodes, les biais de la
méthode Denka Seiken ne varient pas de façon significa-
tive lorsque le rapport C-VLDL/TG augmente. Cepen-
dant, on note une corrélation positive des biais de cette
méthode avec d’une part, la concentration en CT (r = 0,38
à 0,48 ; p variant de 0,01 à 0,0008 et non significatif pour
RXL et Konelab20 r = 0,24 et 0,25, p = 0,11 et 0,1 respec-
tivement) et, d’autre part la concentration en TG (r = 0,30
à 0,34 ; p entre 0,04 et 0,02), sauf sur les analyseurs RXL
et Hitachi 911 [B] (r = 0,23 ; p = 0,13 et r = 0,22 ; p = 0,15,
respectivement). Comme pour les trois autres méthodes
nous ne retrouvons pas de variation significative des biais
en fonction de l’augmentation du C-HDL ou de la Lp(a),
sur l’étendue des concentrations présentées par les 45 sé-
rums de l’étude.
À titre de comparaison, nous avons recherché également si
les biais des C-LDL calculés selon Friedewald présen-
taient des variations en fonction des paramètres cités. Il
n’existe pas de variation significative de ces biais lorsque
le CT, le C-HDL ou la Lp(a) augmentent. Mais comme
attendu (et malgré les concentrations peu élevées des TG
des échantillons de cette étude) apparaît une relation néga-
tive significative entre les biais du C-LDL calculé et les
TG (r variant entre – 0,30 et – 0,41 avec p entre 0,04 et
0,005), sauf pour l’Hitachi 917 [A] et l’Hitachi 911 [B] où
la corrélation négative n’atteint pas la significativité
(r = – 0,23 ; p = 0,13 et r = – 0,22 ; p = 0,15) ainsi qu’une
relation positive hautement significative (p < 0,001) entre
ces biais et le rapport C-VLDL/TG (r entre 0,47 et 0,58)
pour tous les analyseurs.
Études de linéarité des méthodes directes
de dosage de cholestérol-LDL
Sur l’étendue de concentrations de C-LDL de 1,54 à 19,7
mmol/L (0,6 à 7,7 g/L), obtenues par ajouts de LDL iso-
lées par ultracentrifugation à un sérum hypocholestérolé-
mique (figure 2A), les méthodes Daiichi et Denka Seiken
apparaissent linéaires. En comparant les résultats des
C-LDL directs et ceux des C-LDL attendus, les droites et
coefficients de régression sont les suivants : y = 0,977 x
+ 0,105, r = 0,999 pour la méthode Daiichi et y = 1,068 x
– 0,215, r = 0,999 pour la méthode Denka Seiken. Pour
cette dernière méthode, il existe un faible surdosage dans
les fortes concentrations (les taux de récupération varient
de 100 à 106 %) alors que pour la méthode Daiichi, les
taux de récupération sont tous compris dans la fourchette
97-102 %. Les méthodes Kyowa et Wako ne sont plus

20 A B

10
Biais cholestérol-LDL direct (%)

- 10

- 20

20 C D

10

- 10

- 20

2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7
Cholestérol-LDL β-quantification (mmol/L)

Figure 1. Biais des méthodes directes par rapport à la méthode de référence. Méthodes : A : Daiichi ; B : Denka Seiken ; C : Kyowa ;
D : Wako. Laboratoires [analyseurs] : ♦ Lab1 [CX4] ; M Lab2 [917 A] ; m Lab3 [RXL] ; * Lab4 [AU 600] ; n Lab5 [917 B] ; + Lab6
[Koné] ; • Lab7 [911 A] ; C Lab8 [911 B].

34 Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005


linéaires à partir de 13,7 mmol/L (taux de récupération
< 90 %), ce qui est en accord avec la limite de linéarité
indiquée par les fournisseurs de ces méthodes (14,2
mmol/L pour la méthode Kyowa, 10 mmol/L pour la mé-
thode Wako).
D’autre part, les quatre méthodes sont linéaires pour des
concentrations très faibles de C-LDL variant de 6,91
mmol/L (2,7 g/L) à 0,35 mmol/L (0,14 g/L) obtenues en
diluant un sérum hypercholestérolémique dans un SDLP
(figure 2B). Les droites de régression sont respective-
ment : y = 1,003 x – 0,025 pour la méthode Daiichi, y
= 1,007 x – 0,051 pour la méthode Denka Seiken, y = 1,005
x – 0,009 pour la méthode Kyowa et y = 1,015 x – 0,022
pour la méthode Wako. Les coefficients de régression sont
tous égaux à 0,999. Les résultats sont sensiblement les
mêmes lorsque les dilutions sont effectuées en sérum phy-
siologique (résultats non montrés). Le bon comportement
de ces méthodes (taux de récupération de 94 à 103 % pour
l’ensemble) nous permet de valider les études de spécifi-
cité où l’ajout de lipoprotéines à des sérums entraîne des
dilutions plus ou moins importantes des LDL.
Études de la spécificité des méthodes directes
de dosage de cholestérol-LDL
Interférence des HDL (figure 3A)
Des surcharges progressives en HDL (HDL2 + HDL3) à
un sérum normolipidémique faisant varier les concentra-
tions de C-HDL de 1 à 3,82 mmol/L (0,39 à 1,49 g/L) ont
été utilisées pour étudier l’interférence de ces lipoprotéi-
nes sur les dosages directs de C-LDL. Seule la méthode
Denka Seiken ne montre aucune variation significative.
Les trois autres méthodes surestiment la valeur de C-LDL.
Pour la méthode Daiichi, la surévaluation reste inférieure
à 5 %, même pour des concentrations très élevées de
C-HDL. En revanche, les deux autres méthodes sont plus
sujettes à l’interférence des HDL. En ce qui concerne la
méthode Wako, la surévaluation est nette (> 5 %) à partir
de 3,36 mmol/L (1,3 g/L) de C-HDL. Quant à la méthode
Kyowa, la surévaluation dépasse 5 % à partir de 2,91
mmol/L (1,14 g/L) de C-HDL et augmente jusqu’à 16 %
pour une concentration de cholestérol-HDL de 3,82
mmol/L.
Nous avons pu tester simultanément la deuxième version
de la méthode Kyowa (version qui ne comporte plus d’a-
cyclodextrine dans le premier réactif). Les résultats mon-
trent également une surévaluation variant de 7 à 27 %
pour des concentrations de C-HDL de 2,91 à 3,82 mmol/L.
Interférence des chylomicrons (figure 3B)
Les résultats de C-LDL, obtenus par les méthodes Denka
Seiken, Kyowa et Wako ne sont pas modifiés pour des
concentrations en TG variant de 0,7 à 11,5 mmol/L obte-
nues par des ajouts successifs de chylomicrons à un sérum
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005
Dosage du cholestérol-LDL
normolipidémique. La méthode Daiichi surestime le
C-LDL de façon proportionnelle à la quantité de triglycé-
rides ajoutés dans le milieu. Cependant, la surévaluation
reste inférieure à 5 % jusqu’à 7,3 mmol/L de TG et les
variations des quatre méthodes sont comprises dans l’inter-
valle 90-110 % jusqu’à 14 mmol/L de TG.
Interférence des VLDL (figure 3 C et D)
Lors de surcharges progressives en VLDL à un sérum
normoLDLémique (C-LDL à 3,84 mmol/L soit 1,5 g/L)
(figure 3C), nous observons un comportement différent
des quatre méthodes : les méthodes Daiichi, Denka Seiken
et Wako surdosent le C-LDL alors que la méthode Kyowa
le sous-évalue. Jusqu’à 6 mmol/L de TG, la surévaluation
de la méthode Daiichi reste inférieure à 5 %, alors que
pour les méthodes Denka Seiken et Wako, dès 4 mmol/L
de TG la surévaluation est supérieure à 5 %. Les variations
de ces trois méthodes restent inférieures à 10 % jusqu’à
7,5 mmol/L de triglycérides des VLDL. Pour des concen-
trations supérieures à 10 mmol/L de TG, la technique
Wako montre la plus forte variation (118 % de récupéra-
tion du C-LDL pour une triglycéridémie de 10,5 mmol/L).
La méthode Kyowa, en revanche, montre une sous-
évaluation proportionnelle au taux de TG. Le sous-dosage
reste inférieur à 5 % jusqu’à 6 mmol/L de TG et inférieur
à 10 % jusqu’à 8 mmol/L de TG des VLDL. Cependant, à
10,5 mmol/L de TG, le taux de récupération du C-LDL
n’est plus que de 84 %, dépassant les limites d’acceptabi-
lité.
Lorsque des VLDL sont ajoutées à un sérum fortement
hypercholestérolémique (C-LDL à 7,7 mmol/L soit 3 g/L)
(figure 3D), les variations des dosages de C-LDL direct
deviennent négligeables sauf pour la méthode Kyowa avec
laquelle le taux de récupération du C-LDL est de 89 % à la
plus forte concentration de TG (10,7 mmol/L).
Cholestérol-LDL dosé (mmol/L)
25 8
B A
6
20 4
2
15
0 2 4 6 8
10
Daiichi
Denka Seiken
5
Kyowa
Wako
0 5 10 15 20 25
Cholestérol-LDL attendu (mmol/L)
Figure 2. Linéarité des méthodes directes. A : surcharge d’un
sérum hypocholestérolémique (C-LDL = 1,54 mmol/L) par ajouts
de LDL isolées ; B : dilution d’un sérum hypercholestérolémique
(C-LDL = 6,91 mmol/L) par du sérum déplété en lipoprotéines
(SDLP).
35
article original

Ces études de surcharge ont été réalisées plusieurs fois sur mmol/L) ou 0,30 (en g/L) caractéristique des hyperlipo-
des sérums différents afin de confirmer les résultats pré- protéinémies de type III [26]. La fraction isolée redonnait
sentés. Lors d’une de ces études, sur un sérum à 6,4 typiquement en électrophorèse un aspect de broad-band.
mmol/L de C-LDL (2,5 g/L), nous avons pu étudier le Cette fraction a été ajoutée en quantités croissantes à un
comportement de la deuxième version de la méthode sérum normolipidémique (C-LDL = 3,28 mmol/L (1,28
Kyowa : les résultats obtenus sont superposables à ceux g/L) ; TG = 0,34 mmol/L (0,31 g/L)) et nous avons testé
des méthodes qui surestiment le C-LDL. Avec cette ver- trois méthodes : Daiichi, Denka Seiken et Kyowa, ainsi
sion, les taux de récupération varient de 100 à 106 % que la 2e version du procédé Kyowa. Comme le montre la
lorsque les triglycérides des VLDL augmentent de 0,9 à figure 4, les trois méthodes surévaluent à des degrés divers
10,4 mmol/L (résultats non montrés). Dans ce même es- le C-LDL lorsque les b-VLDL sont ajoutées. La variation
sai, la première version de ce réactif se comportait comme la plus importante est obtenue avec la méthode Kyowa qui
dans l’étude actuelle, en sous-évaluant le C-LDL. dose environ 30 % du cholestérol ajouté par les b-VLDL,
Interférence des b-VLDL (figure 4) provoquant ainsi, même pour de faibles quantités de
Lors des études de surcharge en VLDL, nous avons pu b-VLDL dans le milieu, un biais important : en effet dès
étudier un cas de surcharge en b-VLDL. Le sérum prove- l’ajout de 1,7 mmol/L (0,66 g/L) de cholestérol des
nait d’un patient atteint d’une hyperlipoprotéinémie de b-VLDL le surdosage du C-LDL est de 19 %. Compte-
type III, dont le diagnostic biologique a été fait sur l’hyper- tenu de la composition des b-VLDL, cet ajout n’entraîne
lipidémie mixte (CT : 19 mmol/L (7,4 g/L) ; TG : 16 qu’une concentration de 2,2 mmol/L en triglycérides,
mmol/L (14,5 g/L)) et l’aspect de broad-band à l’électro- concentration très nettement inférieure à 8 mmol/L qui est
phorèse des lipoprotéines. La fraction VLDL le niveau de TG à partir duquel nous avons noté une inter-
(0,99 < d < 1,006 g/mL) a été isolée et montrait une majo- férence importante des VLDL. La deuxième version de
rité de b-VLDL (C-VLDL = 13,5 mmol/L (5,3 g/L) ; TG- cette méthode étudiée simultanément montre une variation
VLDL = 15,4 mmol/L (14 g/L)) et un rapport encore plus forte puisque 36 % du cholestérol des
C-VLDL/TG du sérum nettement supérieur à 0,68 (en b-VLDL ajoutées sont dosés par cette méthode (résultats

120 140
A B
120
110
100
Cholestérol-LDL direct récupéré (%)

100 80

60
90
40

80 20
0 1 2 3 4 0 5 10 15 20 25 30
120 120
C D

110 110

100 100

90 90

80 80
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12

Cholestérol-HDL [A] ou triglycérides [B,C,D] (mmol/L)

Figure 3. Spécificité des méthodes directes. A : ajouts de HDL à un sérum normolipidémique ; B : ajouts de chylomicrons à un sérum
normolipidémique ; C : ajouts de VLDL à un sérum normoLDLémique (C-LDL = 3,84 mmol/L) ; D : ajouts de VLDL à un sérum
hyperLDLémique (C-LDL = 7,7 mmol/L). Méthodes : ♦ Daiichi ; M Denka Seiken ; m Kyowa ; · Wako.

36 Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005


non montrés). La méthode Daiichi surdose également le
C-LDL en présence de b-VLDL et environ 15 % du cho-
lestérol des b-VLDL sont reconnus. Enfin seule la mé-
thode Denka Seiken est peu affectée en présence de
b-VLDL puisque seulement 5 % du cholestérol apporté
par ces lipoprotéines sont dosés par cette méthode.
Discussion
Comme le démontrent les nombreuses études cliniques et
épidémiologiques, une concentration élevée de C-LDL est
un facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires
[1, 2]. Les recommandations nationales et internationales
placent donc le C-LDL en première ligne pour la classifi-
cation et le suivi des patients à risque [5, 27]. Puisque des
variations relativement minimes de la concentration de
C-LDL peuvent entraîner des changements dans
l’évaluation du risque d’athérosclérose, il est nécessaire de
disposer de mesures exactes de ce paramètre. Les
méthodes utilisées en référence (ultracentrifugation,
b-quantification) pour la détermination du C-LDL sont
particulièrement laborieuses et nécessitent un équipement
spécialisé, limitant leur utilisation en pratique de routine.
D’un autre côté, la formule de Friedewald, qui peut être
utilisée dans n’importe quel laboratoire, cumule la variabi-
lité analytique et biologique de trois paramètres et souffre,
de plus, de plusieurs limites bien établies. Ces arguments
ont amené les différents experts à encourager le dévelop-
pement de méthodes directes de dosage du C-LDL [5].
Récemment, une nouvelle génération de méthodes direc-
tes homogènes, entièrement automatisables est apparue.
Leur principe repose sur l’utilisation de réactifs spécifi-
ques de différents types qui exposent sélectivement et me-
surent directement le cholestérol associé aux LDL [22].
Nous rapportons la première évaluation multicentrique de
quatre méthodes directes homogènes de dosage de C-LDL
actuellement disponibles en France, testées sur des analy-
seurs différents. À ce jour, une seule méthode a fait l’objet
d’une étude multicentrique sur huit analyseurs identiques
et une autre a été testée sur deux analyseurs différents [28,
29]. Cela ne permettait donc pas de juger de la transférabi-
lité des résultats obtenus par ces nouveaux tests d’un auto-
mate à un autre. Les faibles CV inter laboratoires des trois
méthodes Daiichi, Kyowa et Wako rapportés dans notre
étude démontrent une nette amélioration de la reproducti-
bilité inter laboratoires de ces méthodes directes par rap-
port aux méthodes de calcul et le bon agrément entre les
différents laboratoires pour le dosage du C-LDL par cha-
cune de ces trois techniques quel que soit l’analyseur uti-
lisé. Les CV inter laboratoires obtenus avec la méthode
Denka Seiken sont par contre comparables à ceux obtenus
par l’équation de Friedewald et ce résultat devrait encou-
rager la reconsidération de certaines adaptations.
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005
Dosage du cholestérol-LDL
Nous avons volontairement limité l’étude d’exactitude à
des échantillons ne présentant pas d’hypertriglycéridémie
majeure afin de pouvoir appliquer le calcul de Friedewald
sans erreur notable et choisi comme méthode de référence
une b-quantification modifiée permettant de ne doser que
le cholestérol lié aux LDL [23]. Bien que dans cette étude
multicentrique les différentes méthodes n’aient été testées
que sur un nombre relativement limité de sérums, nos
résultats sont conformes à ceux annoncés dans la littéra-
ture [22] : les quatre méthodes présentent une excellente
corrélation avec la méthode de référence (r de 0,96 à 0,99 ;
p < 0,0001) et avec le calcul de Friedewald dans chaque
laboratoire (r > 0,97 ; p < 0,0001 ; résultats non montrés).
Cependant l’étude des paramètres de régression permet de
déceler quelques différences : en effet si pour les trois
méthodes Daiichi, Kyowa et Wako, les pentes (sauf deux)
sont significativement non différentes de 1, pour la mé-
thode Denka Seiken elles sont significativement supérieu-
res à 1 pour six automates sur huit. Les ordonnées à l’ori-
gine ne sont pas significativement différentes de zéro pour
les méthodes Daiichi et Kyowa, par contre elles le sont
pour les méthodes Denka Seiken et Wako sur plusieurs
automates.
La détermination des paramètres de régression et des coef-
ficients de corrélation pour comparer deux méthodes ne
représente cependant que des tests statistiques qui ne reflè-
tent ni la magnitude des biais ni le nombre de biais inac-
ceptables selon les critères des recommandations interna-
tionales. En d’autres termes, une bonne corrélation peut
néanmoins masquer l’existence d’erreurs cliniquement si-
gnificatives. En dehors de la comparaison des séries appa-
riées par un test t de Student, une autre approche de l’exac-
titude consiste à faire l’analyse des biais et leur imprécision
à 95 % (biais moyen ± 2 ET) et calculer le nombre (ou le
pourcentage) de biais individuels dépassant ± 12 %,
comme le préconisent Miller et al. [30]. Seules deux mé-
350
Cholestérol-LDL direct récupéré (%)
300
250
200
150
100
50 Daïchi
Denkaseiken
Kyowa
0 2 4 6 8 10
Cholestérol-β-VLDL ajouté (mmol/L)
Figure 4. Spécificité des méthodes directes. Ajouts de b-VLDL à
un sérum normolipidémique.
37
article original
thodes, Daiichi et Wako, répondent de façon satisfaisante
à ces critères. En effet, pour la méthode Daiichi, les biais
moyens sont tous modérés, nettement inférieurs à 兩 4 % 兩
(tableau 3). Seulement avec l’analyseur RXL on constate
une magnitude de biais importante (biais moyen ± 2 ET >
兩 12 % 兩 ) et un nombre de biais individuels de la série
dépassant 兩 12 % 兩 égal à 4, soit 9 % des échantillons. Sur
tous les autres analyseurs, la magnitude des biais est modé-
rée et le nombre de biais individuels inacceptables ne
dépasse pas 5 % de la population. Ce procédé d’analyse
montre donc que le C-LDL mesuré par ce réactif est com-
parable à celui déterminé par la b-quantification modifiée.
La méthode Wako présente sur tous les analyseurs un biais
positif, déjà décrit dans d’autres études [29] et un écart
significativement différent de zéro au test t de comparai-
son de moyennes appariées. Cependant, la dispersion des
biais est modérée et le nombre de biais individuels supé-
rieurs à 兩 12 % 兩 est compris entre 2 et 7 % de la population
testée. Pour cette méthode, si nos résultats concordent
avec ceux de certains auteurs qui considèrent que ses per-
formances analytiques d’exactitude sont tout à fait accep-
tables [29, 31], ils sont par contre très différents de ceux
rapportés dans l’étude récente de Miller [30] qui fait état
d’un biais moyen de 14 % par rapport à l’ultracentrifuga-
tion. Cependant, si l’on ne prend en compte dans cette
étude que les sérums normotriglycéridémiques (TG
< 1,5 g/L), le biais moyen de la méthode est de 4,4 %,
similaire aux biais moyens que nous avons constatés.
Les deux autres méthodes Denka Seiken et Kyowa présen-
tent des résultats moins satisfaisants. En effet, même si les
biais moyens de ces méthodes sont acceptables sur la
quasi-totalité des analyseurs et nos résultats conformes à
la plupart des évaluations de ces deux réactifs [22, 30, 32],
les intervalles de confiance de ces biais sont plus élevés
que pour les deux méthodologies précédentes (tableau 3).
Le nombre de biais individuels inacceptables dépasse 5 %
de la population testée sur tous les automates. Sur notre
échantillonnage, l’exactitude de ces deux méthodes n’ap-
paraît donc pas meilleure que celle du calcul de Frie-
dewald. Néanmoins l’excellente précision de ces nou-
veaux dosages, rapportée dans toutes les études
d’évaluation [22] et vérifiée préliminairement à l’étude
multicentrique par les huit laboratoires sur les différents
automates, leur permet d’atteindre l’objectif d’une erreur
totale (CV × 2 + 兩 biais moyen 兩 ) < 12 % exigé par le
NCEP [25].
Pour tenter d’expliquer les variations des biais mises en
évidence lors de notre étude, nous avons recherché s’il
existait une relation avec la concentration en C-LDL ou
avec d’autres paramètres de l’exploration lipidique (TG,
C-HDL ou Lp(a)).
Pour les méthodes Daiichi, Kyowa et Wako, les biais obser-
vés ne dépendent pas de la concentration en C-LDL,
38
comme le rapportent également d’autres études [28, 31,
33]. Pour la méthode Denka Seiken, sur 6 analyseurs, il
existe une relation positive significative entre les biais et la
valeur du C-LDL. Le peu de travaux réalisés avec ce réac-
tif ne nous permet pas de conclure, cependant notre étude
de linéarité va dans le même sens puisqu’elle montre un
léger surdosage dans les fortes concentrations avec cette
méthode.
Il n’existe pas non plus de variations des biais des quatre
méthodes testées vis-à-vis de la b-quantification, lorsque
la Lp(a) augmente. Cela indique que ces méthodes dosent
probablement le cholestérol lié à cette particule, au même
titre que la méthode de référence ou que le calcul par la
formule de Friedewald. Cependant dans notre série, seuls
17 échantillons avaient une Lp(a) > 0,30 g/L dont trois
seulement une concentration supérieure à 0,80 g/L. Bien
que le fait ne soit pas démontré, à cause de la difficulté
d’isoler cette lipoprotéine des fractions LDL par ultra-
centrifugation, la plupart des études concluent, comme la
nôtre, à la prise en compte plus ou moins complète du
cholestérol de la Lp(a) dans le dosage du C-LDL par ces
nouveaux tests [34, 35].
D’autre part, notre étude, pas plus que d’autres [29, 31],
n’a pu mettre en évidence de relation entre les biais et la
concentration en C-HDL. Néanmoins, l’étude d’interfé-
rence montre un manque de spécificité des méthodes
Kyowa et Wako vis-à-vis de HDL ajoutées : une partie du
cholestérol contenu dans ces lipoprotéines est dosé par ces
deux tests et lors d’hyperalphalipoprotéinémie majeure (C-
HDL > 3 mmol/L), la surestimation du C-LDL devient
importante. L’erreur par excès sur le dosage de C-LDL
semble limiter l’utilisation de ces deux méthodes aux do-
maines de mesure habituels du C-HDL. Les tests effectués
avec la 2e génération du réactif Kyowa montrent que la
suppression d’a-cyclodextrine dans le nouveau réactif
n’améliore pas la spécificité vis-à-vis du C-HDL.
L’inexactitude du calcul de Friedewald lors d’hypertrigly-
céridémie même modérée est connue depuis la publication
d’origine de cette méthode [6] et a été largement argumen-
tée ces trente dernières années [10, 22]. Aucune corréla-
tion ne peut être mise en évidence entre la concentration
en TG et les biais obtenus avec les méthodes Daiichi et
Wako dans notre étude, comme dans d’autres [15, 29]. Au
contraire, une relation positive est constatée avec la mé-
thode Denka Seiken et une relation négative avec la mé-
thode Kyowa. Plusieurs publications corroborent ce der-
nier résultat [28, 31], suggérant une mesure incomplète du
C-LDL lorsque les TG augmentent. Il faut souligner que
nous avons observé une tendance identique pour les biais
obtenus avec la formule de Friedewald, ce qui était at-
tendu. Pour vérifier l’effet des triglycérides sur les dosa-
ges directs de C-LDL, nous avons étudié le comportement
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005

de ces nouvelles méthodes lors d’ajout de lipoprotéines
riches en TG (LRT).
L’ajout de chylomicrons ne modifie que peu les résultats
attendus et jusqu’à 10 mmol/L de TG de chylomicrons, les
dosages directs de C-LDL ne sont pas affectés. Ces résul-
tats sont à mettre en parallèle avec ceux obtenus par diver-
ses équipes lors d’ajout d’Intralipid [35, 36] et/ou de chy-
lomicrons isolés [28]. Plus complexe est l’approche de
l’interférence des VLDL. Nous avons été amenés à répéter
plusieurs fois les tests d’ajout de VLDL de façon à affir-
mer la nature des anomalies constatées. Les résultats obte-
nus lors de ces ajouts confirment les variations des biais en
fonction des TG observées lors de l’étude multicentrique
pour les méthodes Denka Seiken et Kyowa et mettent en
évidence pour les méthodes Daiichi et Wako un surdosage
du C-LDL. Le test Kyowa de 2e génération, sans
a-cyclodextrine, ne montre plus de sous-estimation mais
un léger surdosage, similaire à celui constaté avec la mé-
thode Daiichi. Malgré ce manque de spécificité, d’ailleurs
moins évident lorsque le sérum est hypercholestérolémi-
que, on peut conclure, comme plusieurs autres auteurs
[33, 35] que les quatre méthodes testées restent accepta-
bles pour des triglycéridémies inférieures à 8 mmol/L.
Cette constatation n’est cependant vraie que lorsque les
ajouts ne concernent que des VLDL larges isolées à partir
d’hyperlipoprotéinémie de type IV. Les LRT étant très
hétérogènes, nous avons également étudié le comporte-
ment des différentes méthodes en présence de petites
VLDL ou b-VLDL isolées à partir d’une hyperlipoprotéi-
némie de type III. Dans cette situation, deux des trois
méthodes testées, Daiichi et Kyowa, montrent une nette
surestimation du C-LDL, qui est même majorée avec le
réactif Kyowa 2e génération. Ces résultats également dé-
crits dans d’autres études [34, 37] soulignent que l’enri-
chissement en cholestérol des VLDL est une source d’in-
terférence notable dans le dosage de C-LDL. La méthode
Wako, ayant été retirée du commerce pendant l’étude, n’a
pas été testée, cependant d’autres auteurs constatent une
interférence des b-VLDL du même ordre dans le dosage
du C-LDL par ce test [31]. Avec la méthode Denka Sei-
ken, à l’opposé des précédentes, les b-VLDL n’entraînent
pas d’interférence notable. Sakaue et al. rapportent égale-
ment une faible réactivité de cette méthode vis-à-vis des
VLDL et des IDL isolées d’un sérum de patient atteint de
dyslipoprotéinémie de type III [34].
Les résultats obtenus lors de l’ajout de b-VLDL sont
confortés par l’analyse complémentaire des variations des
biais en fonction du rapport C-VLDL/TG observées dans
l’étude multicentrique. Il s’avère, en effet, que cette appro-
che est beaucoup plus informative de la composition des
VLDL que le simple dosage des TG. Nous démontrons,
comme d’autres équipes [31, 38], que plus ce rapport aug-
mente (c’est-à-dire plus les VLDL sont enrichies en cho-
Ann Biol Clin, vol. 63, n° 1, janvier-février 2005
Dosage du cholestérol-LDL
lestérol), plus le C-LDL dosé avec les méthodes Daiichi,
Kyowa et Wako est surévalué par rapport à la méthode de
référence. Et comme attendu d’après les résultats de la
surcharge en b-VLDL, les biais du C-LDL dosé par la
méthode Denka Seiken ne sont pas corrélés aux variations
du rapport C-VLDL/TG. Enfin, à titre de comparaison, il
faut souligner qu’une relation positive très significative
existe entre les biais du C-LDL calculé par la formule de
Friedewald et le rapport C-VLDL/TG, montrant nettement
que même pour des concentrations modérées de TG, l’esti-
mation du C-VLDL par le rapport TG/5 (en g/L) ou TG/2,2
(en mmol/L) est loin d’être parfaite.
Au terme de cette étude de spécificité vis-à-vis des LRT,
nous pensons que les méthodes testées sont utilisables en
présence d’hypertriglycéridémie jusqu’à 8 mmol/L de TG.
Une attitude beaucoup plus réservée doit être la règle dans
le cas de dysblipoprotéinémie de type III ou de tableaux
dyslipidémiques évoquant la présence de LRT enrichies
en cholestérol (b-VLDL, IDL ou remnants).
Enfin, l’étude de linéarité démontre que ces nouveaux tests
sont utilisables sur un large domaine de mesure pour les
méthodes Daiichi et Denka Seiken. La linéarité est plus
limitée pour les méthodes Kyowa et Wako conformément
à ce qui est annoncé par les fournisseurs et la littérature
[28, 31], mais suffisamment étendue pour mesurer la plus
grande majorité des concentrations de C-LDL rencontrées
en pratique quotidienne.
Conclusion
Les quatre méthodes de dosage direct du C-LDL évaluées
dans cette étude ont apporté une satisfaction générale.
Dans le domaine de la lipidologie courante, elles sont
précises et suffisamment exactes, et pour trois d’entre elles
amènent une réelle amélioration de la reproductibilité in-
ter laboratoires. Ces dosages peuvent être utilisés pour des
échantillons modérément hypertriglycéridémiques (entre
4,5 et 8 mmol/L de TG) pour lesquels le calcul de Frie-
dewald n’est plus applicable et la méthode de référence est
longue et onéreuse. Cependant l’étude de spécificité et
certains résultats individuels de l’étude multicentrique
nous amènent à émettre quelques réserves. Certaines adap-
tations méritent d’être revues et surtout il semble néces-
saire d’être prudent lors d’hyperlipoprotéinémie de type
III, où au moins trois de ces tests ne sont plus applicables.
Nous regrettons que la protection industrielle de ces pro-
cédés nous ait privés des éléments nécessaires à la com-
préhension utile de leurs principes d’efficacité ou de spé-
cificité, qui nous aurait permis d’analyser finement les
anomalies constatées dans cette étude et dans d’autres.
Quoi qu’il en soit, la mise au point de ces nouveaux tests
représente une réelle avancée technologique, permettant le
39
article original
dosage en laboratoire du C-LDL sur un grand nombre
d’échantillons à l’aide d’automates multiparamétriques et
devrait constituer une bonne alternative à la méthode de
référence.
Remerciements. Ce travail a été réalisé grâce aux compé-
tences des techniciens des différents laboratoires et plus
particulièrement de Marie-Christine Federspiel et Valérie
Fesel-Fouquier. Nous remercions les différentes sociétés
pour les fournitures gracieuses des réactifs, étalons et
contrôles nécessaires à cette étude. Les dépenses de fonc-
tionnement ont été exclusivement assurées par l’Arcol et
les laboratoires concernés.
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