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Les méthodes de séparations

Techniques chromatographiques

1) Définition:
La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un
mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long
d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la répartition sélective des solutés
entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la
phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).
Le mot chromatographie vient du grec " khrôma" (couleur) et "graphein" (écrire).
La première chromatographie a été réalisée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl Tswett et
consistait à séparer les pigments d'une feuille d'épinard sur une colonne de carbonate de
calcium.
2) Nature des phases:
Phase stationnaire "fixe": est une phase qui reste en place, soit dans une colonne, soit sur
une surface plane.
La phase stationnaire peut être solide ou liquide. Les solides: silice ou alumine traitées
permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leur propriétés adsorbantes. Ils
peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et
chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de
verre, d'aluminium ou sur une feuille de matiére plastique (chromatographie sur couche mince
CCM). La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou
encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en
chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose
du papier absorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un
liquide peut volatil et thermiquement stable imprégnant un granule poreux.
Phase mobile:
Est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant l'analyte avec
elle.
- soit un gaz: (ex; chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz
vecteur ou gaz porteur.
- Soit un liquide: (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase
mobile est appelée éluant.

L'élution: est un processus au cours du quel les analytes sont entraînés à travers une phase
stationnaire par le mouvement d'une phase mobile.

Un chromatogramme: est le graphique d'une fonction de la concentration de l'analyte en


fonction du temps (ou volume) d'élution.
3- Paramètres intervenant dans la séparation:
Les paramètres physico-chimiques sur les quels reposent les principes de séparation sont:
Paramètres Type de chromatographie Domaine d'application
La charge électrique Echange d'ions Protéines, polypeptides,
acides aminés, acides
nucléiques, sucres
La taille et la forme (le Exclusion ou gel de filtration Protéines, polypeptides,
volume) acides nucléiques, sucres,
lipides
L'existence de structures Affinité Protéines
particulières qui permettent
d'établir des liaisons
spécifiques
La polarité et/ ou Polarité de phase inversée ou Protéines, polypeptides,
l'hydrophobicité phase reverse acides aminés, acides
nucléiques, sucres, acides
gras
Interactions hydrophobes Protéines.

4- les différents types de techniques chromatographiques:


Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui peuvent être
classées selon 3 modalités différentes:
 Classification selon la nature des phases:
 La phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz
 La phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide.
La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités:
- Chromatographie liquide-solide (LSC).
- Chromatographie liquide-liquide (LLC).
- Chromatographie gaz-solide (GSC ou GC).
- Chromatographie gaz-liquide (GLC ou GC).
 Classification des chromatographies en fonction de mécanismes de séparation:
Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre la phase fixe et
mobile sont: la solubilités dans le solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge
électrique, la présence du groupements d'atomes formant des sites particuliers. Les différents
types de chromatographie résultent:
 La chromatographie de partage:
C'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un
support inerte. Cette chromatographie est ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du
soluté dans deux phases liquide.
 La chromatographie d'exclusion:
Elle est encore appelée chromatographie d'exclusion-diffusion, tamisage moléculaire, gel
filtration, perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux: les grosses particules
sont exclues de la phase fixe, en revanche les petites molécules incluses diffusent dans les
pores du gel.
 La chromatographie d'adsorption:
C'est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide.
 La chromatographie sur échangeurs d'ions:
La phase stationnaire est un échangeur d'ions constitué par une résine porteuse de
groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type
électrostatique avec les solutés ioniques du milieu.
 La chromatographie d'affinité:
La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est
greffé un effecteur qui présente une affinité biologique (bio- affinité) pour un soluté de
l'échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).
 Classification selon les procédés utilisés:
Selon le support de la phase stationnaire, on distinguera:
- La chromatographie sur colonne (regroupant notamment la chromatographie à haute
performance HPLC et la chromatographie en phase gazeuse CPG): la phase
stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou
différence de pression.
- La chromatographie planaire (qui regroupe la chromatographie sur couche mince
CCM et la chromatographie sur papier): la phase stationnaire est sur la surface d'un
support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie sur
papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité.
Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera:
- La chromatographie par développement: les constituants de l'échantillon restent sur la
phase stationnaire.
- La chromatographie d'élution: les substances sont entraînées hors de la phase mobile.
Remarque:
Les méthodes chromatographiques, bien que très diverses, mettent en jeu un certain nombre
de principes communs.
Les substances se répartissent entre deux phases non miscibles, selon un équilibre lié à un
coefficient de partition, qui dépend à la fois de la nature des composés et de celle des deux
phases considérées coefficient de partage K.

Cs
K 
Cm
Où Cs: Concentration dans la phase stationnaire.
Cm: Concentration dans la phase mobile