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SUPPORT DE COURS

DE BIOCHIMIE

BTS-2 IAC
CHAPITRE I : ENZYMOLOGIE

Objectifs: à l’issu de l’enseignement, l’étudiant (l’apprenant) doit être en mesure de:


_ Expliquer les différents types de classifications des enzymes et dresser les différents
groupes
_ Décrire la structure des enzymes et des coenzymes
_ Expliquer le mode d’action des enzymes
_ Citer les facteurs qui influencent la cinétique enzymatique
_ Expliquer le mode d’action des différents facteurs influençant la cinétique
enzymatique.

INTRODUCTION
Les organismes vivants sont le siège d’innombrables réactions biochimiques. Ces réactions
constituent le métabolisme, c’est à dire la biosynthèse et le catabolisme d’un grand nombre de
molécules biologiques. Ces réactions se déroulent dans des conditions physiologiques
(pH:7,4 et température: 37°C).
Pour réaliser, ces réactions l’organisme met en œuvre de puissants catalyseurs que l’on a tout
d’abord désigné sous le nom de ferments, de diastases et auxquels la nomenclature
internationale a substitué celui d’enzyme.Sans la présence des enzymes, la vie serait
impossible. Les enzymes ont donc un rôle vital.

Les premières études des processus enzymatiques datent des expériences de REAUMUR
(1713) qui étudia in vivo et in vitro la digestion de la viande par le suc gastrique.
En 1814 : KIRCHHOFF a mis en évidence dans le germe de blé l’existence d’une substance,
capable de transformer l’amidon en sucres simples (saccharification).
En 1850: Pasteur démontra que la fermentation du sucre en alcool par la levure est catalysée
par une substance qui existe dans la levure (en = dans et zyme = levure).

Il a fallu attendre en 1926 avec l’isolement de l’uréase (1ère enzyme purifiée) par SUMMER
et 1930 avec l’isolement par NORTHROP d’une série de Protéases (Trypsine, chymotrypsine)
pour avoir une certaine certitude sur la nature protéique des enzymes.
Depuis, plus de 3000 enzymes sont décrites

 Définitions
L'enzymologie est la partie de la biochimie qui étudie les propriétés structurales et
fonctionnelles des enzymes.Elle s’intéresse aussi à décrire la vitesse des réactions catalysées
par les enzymes (cinétique enzymatique).
Un substrat (S) est la molécule qui est transformée sous l’action de l’activité de l’enzyme
Un produit (P) est la molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par l’enzyme

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Le site actif : la partie de l’enzyme qui fixe le substrat.

S + E⇌ ES ⇌P + E

1- Propriétés et Caractéristiques des enzymes


1.1- Les enzymes agissent en très faible quantité
Une molécule de catalase peut hydrolyser 5 millions de molécules d’H 2O2 en une min
dans des conditions de pH et de température physiologiques.

1.2- les enzymes ne sont pas consommées au cours de la réaction


Comme les catalyseurs chimiques, elles se retrouvent intactes à la fin de la réaction

1.3 - L’enzyme ne modifie ni la nature, ni l’équilibre thermodynamique de la réaction


catalysée.
L’enzyme ne peut modifier la constante d’équilibre d’une réaction

1.4- L’enzyme augmente la vitesse de la réaction catalysée


En absence d’enzyme le temps mis pour atteindre l’équilibre peut être long.
Exemple : hydrolyse de l’urée.
Absence d’enzyme : t½ → 109 secondes.
Présence d’enzyme : t½ → 10-4 secondes.

1.5- Les enzymes font baisser considérablement l’énergie d’activation d’une réaction
L’énergie d’activation (Ea) d’une réaction est l’énergie minimale qu’il faut fournir à
une réaction, pour amener les réactants dans un état transitoire activé et déclencher la
réaction.

Selon la relation d’Arrhénius on a k= A e - Ea/RT avec k constante de vitesse (V= k[S]), on se


rend compte que la k est liée à Ea.si Ea est grand k est faible.

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Exemple :
H2O2 ½ O2 + H2O

Sans catalyseur : Ea = 18 Kcal / mol de H2O2

En présence de Catalyseur chimique (platine) : Ea = 11,7 Kcal / mol de H2O2

En présence d’Enzyme (catalase) : 2 Kcal/mole d’H2O2.

1.6- Les enzymes sont régulables


L’activité catalytique de nombreuses enzymes varie en réponse à des signaux
métaboliques (inhibiteurs, activateurs).

1.7- Les enzymes sont spécifiques


Une enzyme transforme un substrat S donné (spécificité de substrat) grâce à une réaction
donnée. La spécificité de l’action des enzymes s’exerce à 3 niveaux. Elle s’exerce à la fois au
niveau de la classe, au niveau de la réaction elle même et au niveau du substrat.
 Spécificité au niveau de la classe
Au niveau de la spécificité de la classe, chaque enzyme va catalyser les réactions de sa classe.
Une hydrolase va catalyser une réaction d’hydrolyse. Cette spécificité est à la base de la
classification des enzymes en 6 classes.
 Spécificité au niveau de la réaction ou spécificité de liaison
Si nous prenons les hydrolases, en fonction de la liaison à hydrolyser, chaque enzyme va
hydrolyser une liaison particulière.
Liaison osidique → Osidase
Liaison ester → Estérase
….
Sur un acide aminé nous avons plusieurs (au moins 3) types de liaisons dont la rupture peut
être spécifiquement catalysée par une enzyme donnée.

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 La spécificité au niveau du substrat
L’enzyme qui catalyse un type de réaction donné va reconnaitre un seul substrat ou un groupe
de substrat. On parle à ce niveau de spécificité étroite et de spécificité large.
 La spécificité étroite
L’enzyme ne reconnait et n’agit que sur un seul type de substrat, mais jamais sur son analogue
de substrat. L’enzyme exige la présence des trois parties de la molécule représentée ci-
dessous :
A─B. les groupements A et B et la liaison ─.
Exemple : l’unique substrat de l’uréase est l’urée : (H2N)2C=O (n’agit pas sur ClH2NC=O, ni
sur Cl2C=O)
 La spécificité large
L’enzyme agit ici sur tous les analogues de structure de son substrat.
Exemple : la ß galactosidase hydrolyse le lactose qui est un ß galactoside mais hydrolyse aussi
tous les ß galactosides de structure :

L’enzyme n’exige qu’une seule partie du substrat

On peut mettre à profit cette spécificité de substrat large pour rechercher ou doser l’enzyme
en utilisant des substrats synthétiques comme l’ONPG (l’orthonitrophényl ßD-
galactopyranoside) dont l’hydrolyse libère un produit coloré facilement décelable et dosable
par colorimétrie.

1.8 Les enzymes ont une action réversible


La plupart des réactions biochimiques sont des réactions réversibles et c’est la même
enzyme qui catalyse la réaction dans les deux sens. On dit que l’enzyme a une action
réversible.

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Exemple : Pyruvate + NADH, H+ ⇌ Lactate + NAD+
Cette réaction est catalysée dans les deux sens par la Lactate Déshydrogénase.

2 - Nature et structure des enzymes


2.1 Nature protéique des enzymes
Les enzymes sont de nature protéique, leur masse molaire varie de 104 à 2.106 Da (ou
g/mol). Selon leur nature chimique, on distingue deux types d’enzymes :
 Enzymes entièrement protéiques : on parle d’enzymes holoprotéiques. Ce sont
généralement les hydrolases.
 Enzymes hétéroprotéiques (à Cofacteurs)
Elles sont formées d’une partie protéique (polymères d’acides aminés) appelée apoenzyme et
d’une partie non protéique appelée cofacteur. Le cofacteur peut être :

- de nature inorganique: les ions métalliques : Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+…
Exemple: Fer dans les cytochromes et Zn2+ dans l’alcool déshydrogénase qui forme un pont
entre l’enzyme et son substrat

- de nature organique: les coenzymes


Lorsque le coenzyme se lie à la protéine enzymatique par une liaison covalente, on parle de
groupement prosthétique. Lorsque la liaison est faible on parle de cosubstrat.

L’Apoenzyme: intervient dans la spécificité de la réaction enzymatique, il est thermolabile


Le Cofacteur: effectue la réaction chimique, il est thermostable

2.2- Structure chimique


La plupart des enzymes se trouve au moins sous la structure tertiaire protéique. Elles
sont structurées par repliement de la chaine polypeptidique pour adopter une structure
tridimensionnelle. Cette structure est maintenue par des liaisons hydrogènes, des ponts
disulfures entre les résidus cystéinyl et des liaisons ioniques. L’activité des enzymes est
conditionnée par l’intégrité de cette structure. Sous l’action des agents dénaturants comme :
- ß mercapto-éthanol (réducteur : rompt les ponts S-S),
- SDS (détergent : rompt les liaisons ioniques et hydrophobes),
- acides et bases fortes (liaisons ioniques),
- sels de métaux lourds (liaisons ioniques),
- solvants organiques (interactions hydrophobes),
- chaleur (liaisons H),
- urée (liaisons H),
ces liaisons se rompent et l’enzyme se dénature, perdant ainsi son activité.

2.3- Site actif des enzymes


C’est une zone particulière contenant les radicaux d’acides aminés entrant en contact
avec le substrat et indispensables à l’activité enzymatique. Le site actif comprend :
- le site de fixation qui se combine au substrat

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- le site catalytique qui agit sur le substrat pour lui faire subir la réaction chimique.
Les acides aminés du site actif, rapprochés par la structure tertiaire peuvent être très éloignés
dans la structure primaire (chaine linéaire des acides aminés).

2.3- Proenzymes ou zymogènes


De nombreuses enzymes (surtout les protéases intestinales) sont synthétisées sous
forme de proenzymes ou zymogènes inactives car ayant leur site actif masqué par un peptide.
L’activation des proenzymes en enzyme est souvent un phénomène protéolytique.

NB : il existe des enzymes qui ont des structures oligomériques (au moins deux monomères et
qui possèdent au moins de deux sites de fixation) .Ce sont en général les enzymes
allostériques spécialisées dans la régulation du métabolisme.

3- Nomenclature et classification des enzymes


Les enzymes ont été dénommées selon le nom du S sur lequel elles agissent, en
ajoutant le suffixe "ase".
Exemple: amidon → amylase
Urée → uréase
Lactose → lactase
Saccharose → saccharase
Il y a cependant des noms d’enzymes qui ne renseignent point sur la nature du substrat
catalysé. Exemple : chymotrypsine ; papaïne ; trypsine.

Ainsi en 1961, l’Union Internationale de Biochimie (UIB), pour mettre de l’ordre a proposé
une nouvelle classification des enzymes selon le type de réaction catalysée. On a 6 classes
d’enzyme non interchangeables.

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3.1- les oxydoréductases
Ce sont des enzymes qui catalysent les réactions d’oxydoréduction, c'est-à-dire des
réactions de transfert d’électrons, de protons, d’oxygènes .
Ce sont des réductases, des déshydrogénases, des oxygénases…ils ont pour coenzymes
(NAD, NADP, FAD ou FMN)
Aox + Bréd ⇌ Aréd + Box

 Déshydrogénases: lactate déshydrogénase

CH3- CHOH-COOH + NAD+ ⇌ CH3-CO-COOH + NADH + H+

 monooxygénases catalysent la fixation d’un atome d’oxygène


-CH3 → -CH2OH
-CH2- → -CHOH

 Cytochromes: ont un coenzyme héminique avec un ion, qui présente 2 états


d’oxydation, ce qui en fait un transporteur d’électrons.
Fe2+ ⇌ Fe3+ + e-
3.2- Les transférases
C’est la classe des enzymes qui catalysent le transfert de groupement autre que l’hydrogène et
l’oxygène. Elles nécessitent un coenzyme.

A-X + B ⇌ A + B-X
 Les transaminases: transfèrent les radicaux aminés -NH2 d’un AA à un acide cétonique
accepteur. Le coenzyme est le phosphate de pyridoxal.

•les phosphokinases ou kinases: transfèrent un P sur une molécule d’ADP. L’ion Mg++ est
indispensable.

ATP + Glucose → Glucose-6-P + ADP

3-3-Les hydrolases
Catalysent la rupture d’une liaison avec fixation des éléments d’une molécule d’eau.
A-B + H2O ⇌ A-H + B-OH

• Les estérases: hydrolysent les esters en acides gras et en alcool


RCOO-CH2-R’ + H2O ⇌ RCOOH + R’CH2OH
• Les lipases :
Hydrolysent les glycérides en glycérol et en acides gras.

3.4- Les lyases


Ce sont des enzymes qui catalysent la rupture des liaisons C-C, C-N, C-O, C-S sans
incorporation d’eau.

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- décarboxylase d’acide cétonique: Le coenzyme est la thiamine pyrophosphate (TPP)
R-CO-COOH → R-CHO + CO2
-Décarboxylation des acides aminés : le coenzyme est le phosphate de pyridoxal
R ─CH─COOH → R-CH2-NH2 + CO2

NH2

Cas de la pyruvate déshydrogénase: contient 5 coenzymes qui sont ; TPP, NAD+, FAD,
Coenzyme A et Lipoate

3.5- Les isomérases


Ce sont des enzymes qui catalysent le déplacement de groupes à l’intérieur d’une
molécule sans que la formule brute varie.

Epimérases: provoquent des interconversions d’oses :


Galactose ↔ glucose
Mutases: catalysent le transfert d’un radical d’une partie d’une molécule à une autre.

3.6- Les ligases ou synthétases


Ce sont les enzymes qui catalysent la condensation de 2 molécules. Les réactions
catalysées consomment en générale de l’énergie.

A + B + ATP → A-B + AMP + P-O-P

Conclusion
Sur le plan scientifique chaque enzyme doit être désignée par un nom formé du nom
du substrat catalysé, de celui de la réaction et du suffixe « ase » précédé d’EC (Enzyme
Commission) et d’un numéro de code de 4 chiffres
Le numéro de code spécifie :
1 - le type de réaction (classe)
2 - le type de fonction du substrat métabolisé (sous-classe)
3 - le type de l’accepteur
4 - Le numéro d’ordre (dans la sous-sous-classe).

Exemple
EC 2.7.1.1 ATP : D - hexose 6 - phosphotransférase communément appelée hexokinase

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EC 1.1.1.67 Mannitol : NAD oxydoréductase = Mannitol Déshydrogénase

Mannitol + NAD ⇌ Fructose + NADH

EC 5.3.1.1 D-glycéraldéhyde 3-phosphate céto-isomérase = Triose phosphate isomérase

Glycéraldéhyde 3 phosphates ⇌ Dihydroxy acétone phosphate

4 Cinétique enzymatique des enzymes Michaëliennes


4.1- Rappel de la cinétique chimique
4.1.1-Vitesse d’une réaction
Soit la réaction suivante : k
S → P
Avec k constante de vitesse
La vitesse de la réaction est définie comme étant la quantité de substrat qui apparait par unité
de temps ou comme la quantité de substrat qui disparait par unité de temps.

d [P ] d [S ]
V =  dt  =  dt on peut aussi écrire V= k [s]

4.1.2. Ordre d'une réaction


L’ordre d’une réaction est le nombre total de réactifs effectivement nécessaire à l’acte
chimique. La vitesse peut s'écrire : V = k[A] α [B]β [C]γ ... où A,B, C sont les réactifs
intervenant dans la réaction chimique.
- k est appelée constante de vitesse (c'est une constante pour les paramètres
thermodynamiques : température, pression, concentrations initiales déterminées). Sa
dimension est dépendante de la loi de vitesse.
− α, β, γ sont appelés les ordres partiels de réaction par rapport à l'espèce chimique pour
laquelle ils sont exposants. Dans le cas le plus général, ils ne sont pas égaux aux coefficients
Stœchiométriques des réactifs.
- n = α + β + γ +... est appelé l'ordre (global) de la réaction

 Réaction d'ordre zéro (ou nul)


k
Soit une réaction élémentaire : S → P
Si la réaction est d'ordre zéro, la vitesse de réaction ne dépend pas des concentrations des
réactants intervenant dans la réaction : V = k[S]0 = k = -d[S]/dt , d'où en intégrant :
[S] = [S]0 - kt , où [S]0 est la concentration de S à l'instant t0= 0.

La concentration des réactifs diminue linéairement en fonction du temps, et évidemment celle


des produits augmente linéairement en fonction du temps.
Une représentation de [S] = f(t) est une droite de pente –k.
Pour une réaction d'ordre zéro, la constante de vitesse k a les dimensions de
[(mole/litre) temps-1] .

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 Réaction du premier ordre (ou d'ordre 1)
k
Soit une réaction élémentaire : S → P
Si la réaction est d'ordre 1 par rapport à S, la vitesse de réaction s'écrit :
−d [ S ] d [S ]
V= =k [S] d’où – =k dt , en intégrant  on obtient :
dt [S]
[ So ]
Ln ( ) = kt ou encore [ S ] =[ So ] e−kt o ù ln [ S ] =ln [ So ] – kt
[S]
Où [So] est la concentration de S à l’instant t0 = 0.

La concentration des réactifs diminue exponentiellement en fonction du temps, et évidemment


celle des produits augmente exponentiellement en fonction du temps.
Une représentation de Ln([S]) = f(t) est une droite de pente -k
Pour une réaction d'ordre un, la constante de vitesse k a les dimensions de [temps-1].

 Réaction du second ordre (ou d'ordre 2)


Soit une réaction élémentaire : A + A → P
Si la réaction est d'ordre 2 par rapport à A, la vitesse de réaction s'écrit :
−d [S ] d [S ]
V= =k [S]2 d’où – 2
=k dt en intégrant :
dt [S ]
1 1
[S ]
= kt + [So ]
où [So] est la concentration de S à l’instant t0 = 0.

La concentration des réactifs diminue hyperboliquement en fonction du temps, et évidemment


celle des produits augmente hyperboliquement en fonction du temps.
Une représentation de 1/[S] = f(t) est une droite de pente k
Pour une réaction d'ordre deux, la constante de vitesse k a les dimensions de
[(litre/mole) temps-1].

4-1-3 Détermination de l'ordre d'une réaction (méthode différentielle)


Dans les paragraphes précédents, pour chaque ordre de réaction, nous avons déterminé
une
représentation particulière f[S]=g(t) qui est linéaire et permet de déterminer la constante de
vitesse. Si nous avons non pas des mesures expérimentales ([S], t) mais des mesures (V, [S])
Où v est la vitesse de la réaction, la relation à étudier est v =-d [S]/dt = k[S] n où n est l'ordre
de la réaction : V = k[S]n → Ln(V) = Ln(k) + nLn([S]) ,
Une représentation de Ln(v) en fonction de Ln ([A]) est une droite de pente n (ordre de la
réaction) et d'ordonnée à l'origine Ln(k).

Remarque : si à la place des logarithmes népériens, nous avions utilisé les logarithmes
décimaux (Log), la relation aurait été identique.

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4-2 Cinétique enzymatique
4.2.1 Définition
La cinétique enzymatique est l’étude de la vitesse d’une réaction catalysée par une
enzyme. Cette vitesse est la quantité de produit qui apparait par unité de temps ou la quantité
de substrat qui disparait par unité de temps.
La vitesse de la réaction enzymatique rend compte de l’activité de l’enzyme (capacité de
l’enzyme à catalyser la transformation de son substrat).
Les unités pour exprimer l’activité enzymatique sont :
a) Unité d’activité enzymatique (AE) ou Unité Internationale (UI)
1 UI exprime la quantité d’enzyme qui transforme 1 µmole de substrat par min dans des
conditions déterminées. C’est aussi le nombre de µmoles de substrat transformé par minute.
micromole de substrat transformé (µmole)
AE = en UI
temps (min)
micromole de Produit formé ( µmole)
AE = en UI
temps (min)
On peut calculer :

 L’activité spécifique (AS)


C’est le nombre d’unité internationale par milligramme de protéine. L’activité spécifique rend
compte du degré de pureté de l’enzyme.
micromole de substrat transformé ( µmole)
AS = en UI.mg-1
temps ( min )∗masse de protéine(mg)

 L’activité spécifique molaire(ASM)


C’est le nombre d’unité internationale par mole de protéine.
micromole de substrat transformé ( µmole)
ASM= en UI.mole-1
temps ( min )∗mole de protéine(mole)

ASM = AS*M*103
 L’Activité Enzymatique Moléculaire (AEM)
C’est le nombre de mole de substrat transformé par mole d’enzyme
mole de substrat transformé (mole)
AEM= en mole de substrat transformé par mole
temps ( min )∗mole de protéine(mole )
d’enzyme.
AEM= ASM*10-6 → AEM = AS*M*10-3

b) Le Katal
Le katal est défini comme étant la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation de d’une
mole de substrat par seconde. On utilise de préférence :
- Le microcatal (1µkat = 10-6 kat)
- Le nanokatal (1 nkat = 10-9 kat)
- Le picokatal (1 pkat = 10-12 kat)

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Exercices d’application
A) 2 mL d’une suspension d’enzyme à 2mg/ml transforme 4 mmoles de substrat en 0,5
min.
1) Calculer l’activité de l’enzyme en UI/mL
2) Calculer l’As en UI/mg
B) A 1 ml de solution d’invertase à 5.10-6 M d’enzyme, on ajoute 1 ml de solution de
saccharose à concentration saturante. La vitesse initiale est de 3 µmole/min dans le
milieu réactionnel.
1) Calculer l’AE en UI/ml de milieu réactionnel
2) Calculer l’ASM et l’AEM si le PM de l’enzyme es 250000.

4.2.2 Notion de vitesse initiale


La vitesse initiale d’une réaction enzymatique est la vitesse mesurée dans les premiers
instants de la réaction enzymatique où l’enzyme est en présence d’un excès de substrat (La
réaction est d’ordre 0 par rapport au substrat). C’est une vitesse constante.

Pour mesurer la vitesse initiale de la réaction enzymatique, il faut se mettre dans les
conditions initiales définies comme suit :

- [E] doit être suffisante


- La [S] doit être en excès
- La température doit être optimale
- Le pH doit être optimal
- La salinité doit être optimale
- Le temps de réaction doit être court

On peut déterminer graphiquement la vitesse initiale Vi en calculant la tangente à l’origine du


graphe [Produit] = f (temps).

Graphique 1 : Evolution de la concentration du produit en fonction du temps

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La vitesse initiale est la tangente à la courbe [P] = f(t) au point t=0.

Interprétation du graphe
Le graphe présente deux parties :
- Une partie rectiligne, qui est la phase stationnaire.
Pendant cette phase l’enzyme est en présence d’un excès de substrat (conditions initiales). La
concentration en substrat et du complexe ES restent constantes, ce qui donne une vitesse
constante (c’est la vitesse initiale).Dans cette phase, la réaction est d’ordre 0 par rapport au
substrat.
- Une phase curviligne, qui est la phase post-stationnaire.
Pendant cette phase, les conditions initiales ne sont pas respectées à cause de la concentration
du substrat qui diminue progressivement dans le milieu. La vitesse de la réaction étant liée à
la [S], va baisser au fur et à mesure que le temps augmente. On obtient une vitesse nulle à
l’épuisement total du S dans le milieu. Dans cette phase la réaction est d’ordre 1 par rapport
au substrat.

4.2.3 Paramètres cinétiques de la réaction enzymatique (KM et Vmax)


En 1913 Michaëlis et Menten ont établit, en s’appuyant sur les principes de la
cinétique chimique, la relation entre l’enzyme et le substrat (pour eux la réaction enzymatique
passe par la formation d’un complexe Enzyme substrat) :

Avec : k1 = constante de vitesse d'association de E + S


k2 = constante de vitesse de dissociation du complexe ES
k3= constante de vitesse de réaction de ES en E+ P
Ils ont mené leur théorie en se plaçant dans la phase stationnaire, c'est-à-dire dans les
conditions initiales où la [ES] est constante et [P] est faible (ce qui fait que E+P ne peut
donner ES).
Ainsi, si [ES] semble constante, cela signifie que la vitesse de formation du complexe ES
(Vf= k1[E].[S]) est égale à la vitesse de disparition du complexe ES (Vd = k2[ES] +k3[ES]).

En posant Vf = Vd, on obtient : k1[E]. [S]) = k2[ES] +k3[ES]).


k 2+k 3 [ E ] .[ S]
KM = = , KM est la constante de Michaëlis et
k1 [ ES]
Menten.
D’autre part, dans le milieu réactionnel l’enzyme existe sous forme libre ou liée au substrat :
[ET] = [E] + [ES].
Si nous somme en présence d’une concentration en substrat saturante [S]sat, la totalité de
l’enzyme sera sous forme de complexe ES. Ainsi [ET] sera égale à [ES] car [E] = 0 et la
relation : Vi= K3[ES] devient Vi = K3 [ET]= Vmax.

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Vmax est donc la vitesse initiale mesurée lorsque la concentration en substrat est
saturante. Vmax ne peut être dépassée.
4.2.4 Equation de Michaëlis et Menten
[ E ] .[S ]
On sait que KM = (1) ; que [E] = [ET] - [ES] (2), que Vi = k3.[ES] (3) et que
[ ES]
Vmax = k3.[ET] (4).
( [ E T ]− [ ES ] ). [S]
(1) et (2) KM =
[ES ]
KM .[ ES]=[ ET ].[ S]−[ ES].[ S ] d’où KM . [ ES ] +[ ES].[S ]=[ ET ].[S ]
[ ET ] .[S ]
ES = en multipliant les 2 termes de cette égalité par K3 On obtient :
KM +[S]
[ ET ] .[S ]
K3 [ES] = K3
KM +[S]

On en déduit donc que :

Vmax . [S]
Vi =
KM +[S ]

Cette équation est l’équation de Michaelis-Menten.

4.2.5 Représentations graphiques de l’équation de Michaëlis-Menten et déterminations


graphiques de KM et Vmax.

L’équation de Michaëlis et Menten peut s’écrire de différentes façons, ce qui a donné lieu à
différentes représentations.
a) Représentation en coordonnées directes
[S]
Vi se rapproche asymptotiquement de Vmax lorsque [S] augmente ( est une fonction
KM +[S]
hyperbolique), et Vi = ½ Vmax lorsque [S] = KM. On détermine donc graphiquement Vmax, et
KM .on définie KM comme étant égal à la valeur de [S] pour laquelle Vi = ½ Vmax.
La difficulté vient du fait que la détermination graphique d'une asymptote est une chose
imprécise, entachant d'erreur la détermination de la Vmax et du KM.

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Graphique 2: Représentation graphique des Vi en fonction de la concentration en substrat.

Le graphique n'est pas linéaire, rendant la détermination de l'asymptote, donc de la V max et du


KM peu précise. Pour améliorer la précision de la détermination graphique de ces deux
constantes, il existe des représentations graphiques qui linéarisent les résultats, permettant des
extrapolations plus précises.

1
La méthode la plus connue est celle de Lineweaver et BurK dans laquelle on représente en
Vi
1
fonction de (voir graphique 3).
[S ]

b) Représentation de Lineweaver et BurK

1 1
Ils ont représenté l’inverse de l’équation de Michaelis et Menten ( en fonction de ¿ (voir
Vi [S ]
graphique 3).

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Graphique 3: Représentation graphique de Lineweaver et Burk des mesures cinétiques d'une enzyme
michaelienne..

Chaque point correspond à une mesure de Vi pour une concentration en substrat [S] donnée.
Les intersections avec les axes permettent de remonter au KM et à la Vmax.

Vmax . [S]
On part de l'équation de Michaelis-Menten soit Vi=
KM +[S ]

1 KM +[S ]
Inverser cette équation, nous donne =
Vi Vmax [S]

1 KM [S]
= +
Vi Vmax [S] Vmax [S ]

1 KM 1 1
  = +
Vi Vmax [S ] Vmax

On reconnait une équation de droite de type Y= aX + b, avec :

 X=

1
 Y = Vi

KM
 a= (ce qui correspond à la pente de la droite)
Vmax

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 17


1
 b= (ce qui correspond à l'ordonnée à l'origine).
Vmax

−1
Par ailleurs pour une valeur de Y = 0, on constate que X =
KM

Cette représentation permet donc à partir des mêmes données que précédemment de
déterminer graphiquement les valeurs de Vmax et de KM avec moins d'erreurs qu'avec la
représentation précédente.

c) Représentation d’Eadie et Hofstee

Cette représentation fut publiée par George Eadie en 1942 et Baren Hofstee en 1959

Vi
On représente Vi = en transformant l’équation de M.M ;
[S ]

Vmax . [S]
Vi= Vi (KM + [S]) = Vmax. [S] Vi.KM + Vi[S] = Vmax. [S]
KM +[S ]

Vi . KM Vi[S ] Vi
[S ]
+ = Vmax Vi= -KM
[S ]
+ Vmax
[S]

Cette représentation est une droite de pente -KM et qui coupe l'axe des V au point VM.

Graphique 4 : Représentation graphique de Eadie et Hofstee des mesures cinétiques d'une enzyme
Michaelienne

d) Représentation de DIXON

Il a multiplié l’équation de Lineweaver –Burk par [S] :

1 [S ] 1 KM
¿+ ) *[S] = .[S] +
Vmax Vi Vmax Vmax

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Cette représentation est une droite de pente 1/Vmax et qui coupe l'axe des [S] au point -
KM.

Graphique 5 : Représentation graphique de DIXON des mesures cinétiques d'une enzyme


michaelienne

4.2.6 Signification des paramètres cinétiques


 Signification de KM

En remplaçant dans l’équation de Michaelis et Menten Vi par Vmax/2 on obtient :

Vmax [S]
=Vmax. 2[S] = KM +[S ] KM = [S]
2 KM +[ S]

KM est la concentration de substrat nécessaire pour atteindre Vmax/2.

KM est une grandeur expérimentale qui peut varier avec la structure du S, le pH, la
température.
D’autre part si on considère la réaction de formation du complexe ES :

KM =[ E] [S]/[ ES]

KM est la constante de dissociation du complexe ES et 1/KM est la constante d’association.


KM indique l’affinité de l’enzyme pour le S. Si KM est élevée l’affinité est faible.
Chaque enzyme a un KM caractéristique pour un S donné.

 Signification de Vmax

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 19


Dans l’équation de Michaelis et Menten, si nous somme en présence d’une [S] saturante
Vmax . [S]
(KM«[S]), nous pouvons négliger KM devant [S]. On obtient Vi= , ce qui donne
[ S]
Vi = Vmax.

Vmax est donc la vitesse initiale mesurée lorsque la concentration en substrat est
saturante. Vmax ne peut être dépassée.

4.3) Influence des facteurs physiques sur l’activité enzymatique

4.3.1) Influence du pH
Le pH joue sur l’ionisation des molécules enzymatiques et donc sur la conformation de
la protéine enzymatique.
Il existe pour chaque enzyme, un pH Optimum auquel l’activité de l’enzyme est maximale.
Au delà et en deçà de ce pH optimum, l’activité de l’enzyme est faible.
En général, à 2 unités du pH optimum, l’activité est réduite 100 fois, mais parfois la gamme
est beaucoup plus restreinte.

Graphique  6: Représentations graphiques de l’activité enzymatique en du pH

4.3.2) Influence de la température


Pour toute enzyme, il existe une température optimale à laquelle l’activité de l’enzyme
est maximale. En deçà de cette température optimale, toute augmentation de la température
entraine une augmentation de l’activité enzymatique, conformément à la relation d’Arrhenius
(k= A e- Ea/RT) qui lie l’effet de la température à l’énergie d’activation.

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 20


(On fournit de l’énergie au système, Q10 = facteur d’augmentation de l’activité quand on
augmente de 10°C ; Q10 # 2 quand on est en deçà de la température optimale, au-delà cela
tombe à des valeurs très basses).
Au-delà de la température optimale, toute augmentation de la température entraine une baisse
de l’activité enzymatique par dénaturation thermique de l’enzyme (la température à laquelle
elle intervient peut varier, mais seules quelques exceptions s’éloignent vraiment de la gamme
40 - 60 °C : protéines thermostables).

I I= Courbe de dénaturation
thermique des enzymes
II
II= Courbe d’activation
thermique de la réaction

III= Courbe de l’activité


enzymatique en fonction de la
III température.

Graphique 7: Représentation graphique de l’activité enzymatique en fonction de la température

4.3.3 Influence de la concentration en substrat


On maintient fixe la concentration en enzyme et on fait varier la [S].
On réalise plusieurs milieux réactionnels avec des concentrations en enzymes fixes et des
concentrations en substrats croissantes. Pour chaque milieu réactionnel, on dose la quantité de
produit qui apparait en fonction du temps en vue de déterminer la vitesse initiale
(graphique 8).

[S3]

[S2]

[S1]

Graphe 8 : Représentation graphique de [P] en fonction du temps pour chaque concentration en
substrat utilisée

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 21


Pour chaque milieu réactionnel contenant une concentration bien précise de substrat, on
calcule les Vi (tangentes à l’origine des graphes), Ce qui nous permet d’obtenir le graphique
suivant (Graphique 9) :

Graphique 9: Représentation graphique Vi en fonction de la concentration en substrat (courbe de MM)

Interprétation de la courbe de MM (courbe de Michaelis et Menten)


- Aux faibles concentrations de substrat, la vitesse de la réaction est proportionnelle à celle du
substrat jusqu’à une concentration en substrat seuil où la vitesse initiale devient constante
(Vmax), indépendante de cette concentration en substrat: l’enzyme est saturée par son
substrat. Ce phénomène est particulier à la cinétique enzymatique

4.3.3 Influence de la concentration en enzyme


Ici, on maintient fixe la concentration en substrat et on fait varier la [E].
On réalise plusieurs milieux réactionnels avec des concentrations en substrat fixes et des
concentrations en enzymes croissantes. Pour chaque milieu réactionnel, on dose la quantité de
produit qui apparait en fonction du temps en vue de déterminer la vitesse initiale :

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 22


Graphique 10 : Influence de la [E] sur l’activité enzymatique

La vitesse d’une réaction enzymatique est proportionnelle à la quantité d’enzyme. Quand on


double la [E], Vi double également.

4.4 Les effecteurs de la réaction enzymatiques


Les effecteurs sont des substances qui inhibent (inhibiteurs) ou activent (activateurs) la
réaction enzymatique.
Ils interviennent au niveau de la régulation du métabolisme cellulaire et permettre de mieux
comprendre le mode d’action des enzymes

4.4.1 Les inhibiteurs


Les inhibiteurs bloquent ou ralentissent l’activité enzymatique, on a deux catégories
d’inhibiteurs :
 Les inhibiteurs réversibles : dont l’action peut être levée, réparée. Qui ne dénaturent
pas l’enzyme.
 Les inhibiteurs irréversibles : dont l’action ne peut être réparée. Ils forment avec les
enzymes des liaisons covalentes, qui dénaturent définitivement l’enzyme. l’enzyme
perd ainsi définitivement son activité.

a) Les inhibiteurs compétitifs (IC)


Ce sont des substances chimiques, analogues de structure des substrats. Ils rentrent en
compétition avec le substrat, dans l’occupation du site actif de l’enzyme.
On a dans le milieu :

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[ E][S ] [ ES ]
Avec KM = [E]= KM
[ES] [S ]

[E ][ I ] [ E ] [I ]
Et E + I ⇌ EI avec KI = [EI] =
[EI ] KI

[ ES][ I ]
[EI] = KM
[S ] KI

KI est la constante d’inhibition ou la constante de dissociation du complexe E-I.

[ ES ] KM [I ]
On obtient [ET] = [E] +[ES] + [EI] [ET] = KM +[ES] + [ ES]
[S ] [S ] KI
KM KM [ I ] KM [I]
[ET] = [ES]( 1+ [S] + [S] * KI ) [ET] = [ES]( 1+ [S] )(1+ KI )

L’équation de Michaelis et Menten en présence d’IC est :

Cas d’inhibition compétitive : Vmax = V’max et K’M ¿ KM

Représentations graphiques

Graphique 11 : Représentations graphiques des cas d’inhibition compétitive

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b) Les inhibiteurs non compétitifs (INC)
Les inhibiteurs non compétitifs se fixent sur l’enzyme en dehors du site actif de l’enzyme,
l’affinité de l’enzyme pour le substrat ne change pas mais l’inhibiteur empêche l’enzyme de
transformer les molécules de substrat. Vmax va donc diminuer en présence d’inhibiteur.
Ce type d’inhibition n’est pas levé par un excès de substrat.
Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des réactifs capables de se combiner
réversiblement avec les groupements SH des radicaux Cys indispensables à l’activité
enzymatique comme les métaux lourds (Cu2+, Ag+, Hg2+…..)

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 25


Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg 2+, cet ion peut être
chélaté par EDTA (éthylène diamine tétra acétique).

Graphique 12 : Représentations graphiques des cas d’inhibition non compétitive

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 26


Remarque
Pour certaines enzymes, on observe une inhibition de l’activité enzymatique par un
excès de substrat ainsi que le montre la figure ci-dessous :

Deux principales interprétations à ce phénomène sont proposées.


- Soit qu’il existe sur l’enzyme deux sites de fixation du substrat, d’affinités différentes
et de pouvoir catalytique différent. En présence d’un excès de substrat, une fois le site
principal saturé le substrat se fixe sur le deuxième site. Cette fixation conduit à une
modification de la conformation de la protéine enzymatique, inhibitrice pour le site
actif principal, car le rendant inaccessible à de nouvelles molécules de substrat.
- Soit qu’il existe sur l’enzyme deux sites de fixation pour la même molécule de
substrat. En présence d’un excès de substrat, ces sites peuvent être occupés par deux
molécules de substrat, conduisant ainsi à de sorte d’inhibition compétitive.

Graphique 13 : Représentation graphique d’une inhibition par excès de substrat

4.4.2- les activateurs


Ils sont généralement de nature métallique (cu2+,Mg2+,Mn2+…) et augmentent l’activité
de certaines enzymes ou les protègent contre tout effet déstabilisateur.
Ces activateurs participent à la consolidation de la structure tridimensionnelle des enzymes.

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4.4.3- les effecteurs allostériques
Ce sont des effecteurs qui agissent de façon particulière en induisant une
transconformation des enzymes allostériques après fixation sur leurs sites allostériques (site
de régulation).

a) Les enzymes allostériques


Ces enzymes se distinguent des enzymes michaeliennes par le fait que l’étude de leur
cinétique ne donne pas une courbe hyperbolique, obtenue par la représentation de la fonction
Vi= f([S]), mais plutôt une courbe sigmoïdale qui montre un effet de coopérativité positive
dans la fixation du substrat ( aux faibles concentrations en substrat la fixation du substrat est
faible alors qu’aux fortes concentrations, elle est forte).
Ces enzymes ont des structures quaternaires à 2, 4,6…sous unités qui possèdent outre le site
actif , un site allostérique ( site de régulation) où se fixe l’effecteur allostérique.

Graphique 14: Effet coopérative allostérique avec S pour les enzymes allostériques

 Effet coopérative positive selon le modèle concerté : la fixation du substrat permet une
transconformation en bloc permettant le passage de l’état T (non favorable) à la
fixation du substrat à l’état R (favorable à la fixation du substrat).

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 Effet coopérative positive selon le modèle séquentiel

b) Les activateurs allostériques


Lorsque les activateurs allostériques se fixent sur les sites allostériques, il s’ensuit une
modification (soit en bloc, soit de façon séquentielle) de la conformation de l’enzyme appelée
transition allostérique réversible, favorisant la fixation du substrat (passage de l’état T à l’état
R) d’où l’amélioration de l’activité sur l’enzyme qui tend à prendre une forme Michaelienne.
(Voir graphique 15)

c) Les inhibiteurs allostériques


Ils ont un effet contraire de celui des activateurs. Leur fixation sur le site allostérique entraine
une modification (passage de l’état R à l’état T) défavorable à la fixation du substrat d’où une
diminution de l’activité de l’enzyme.

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Graphique 15 : Action des effecteurs (ATP : Activateur et CTP : inhibiteur) sur la cinétique de
l’Aspartate Transcarbamylase(ATcase)

d) Enzymes allostériques et régulation métabolique

Les enzymes allostériques jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme


cellulaire. En effet dans les réactions métaboliques, le premier enzyme qui catalyse la
première réaction d’une séquence métabolique (Hexokinase de la glycolyse par exemple).
Cette enzyme peut voir son activité augmentée ou réduite réversiblement par le produit final
de cette séquence métabolique : c’est une retro inhibition.

E1 E2 E3 E4
A → B → C → D → E

Retro inhibition

E1,E2,E3,E4 sont les enzymes de la séquence métabolique.

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5- BIOTECHNOLOGIE ENZYMATIQUE
La biotechnologie enzymatique ou le génie enzymatique utilise essentiellement les
potentialités des enzymes dans le processus de transformation de la matière première. Elle a
connu un développement spectaculaire dans l’agroalimentaire et dans l’industrie des
détergents.

5.1- Application industrielle de quelques enzymes


Les enzymes ont une action spécifique sur certains composés. Elles permettent la
transformation rapide et efficace de ceux-ci à des températures modérées.

Au cours des fermentations alimentaires, ce sont les multiples enzymes des cellules
microbiennes qui provoquent les modifications complexes observées. Il est également
possible de faire intervenir des enzymes seules, en l'absence de toute cellule vivante.
Ces enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions alimentaires industrielles :

 Faciliter le procédé de préparation (exemple : les jus de fruits ou de légumes sont plus
faciles à filtrer après hydrolyse enzymatique des macromolécules en suspension)
 Améliorer la texture (exemple : la formation de gel dans certains jus de fruits
concentrés sucrés est évitée en hydrolysant la pectine naturelle par des pectinases)
 Provoquer une insolubilisation de certaines molécules (exemple : l'utilisation de la
présure bovine ou microbienne pour la coagulation de la caséine du lait dans la
fabrication des fromages)
 Clarifier et stabiliser certains liquides en vue de la conservation (exemple : l'emploi de
cellulases et de pectinases permet de clarifier le vin et les jus de fruits)
 Améliorer les qualités organoleptiques (exemple : l'ajout de lipases à certains
fromages améliore leur saveur)
 Augmenter le rendement (exemple : la saccharification du moût de céréales peut être
amplifiée par l'addition d'amylases au cours de la préparation de la bière)
 Améliorer la digestibilité (exemple : l'hydrolyse enzymatique du lactose du lait permet
d'éviter les symptômes d'intolérance au lactose)
 Permettre la production de nouveaux produits ou la mise au point de nouveaux
procédés de fabrication (exemple : la valorisation du lactosérum, la préparation de
sirops ou d'alcools à partir d'amidon de céréales ou de cellulose...)

Exemple d’Enzymes industrielles

a)Amylases
Les amylases (α-amylase, amyloglucosidase et α-glucosidase ou maltase) hydrolysent
l'amidon en sucres solubles.
Elles peuvent être produites en quantité importante par des moisissures (comme Aspergillus
oryzœ et A. niger) et des bactéries (comme Bacillus subtilis).
Les amylases bactériennes, à l'inverse des amylases fongiques, sont thermorésistantes mais
rapidement inactivées en pH acide.
Les principaux usages des amylases sont :

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 Élimination de l'amidon dans les jus et les extraits de fruits, ce qui les clarifie et
facilite leur filtration
 Clarification du vin et de la bière.
 Conversion de l'amidon de céréales en sirops de sucres (tel le sirop de maïs).
 Accélération de la levée de la pâte à pain.
 Saccharification de l'amidon de céréales (en complément ou en remplacement des
amylases du malt d'orge) avant la fermentation alcoolique durant la fabrication de la
bière.

b) L’invertase
L'invertase hydrolyse le saccharose en glucose et fructose.
Son action donne un sirop plus fluide, qui a un plus grand pouvoir sucrant, une pression
osmotique plus élevée et qui cristallise moins facilement que le saccharose.
Dans l'industrie, l'invertase est produite principalement par des levures :Saccharomyces
cerevisiœ, Zygosaccharomyces rouxii, Khiyveromyces marxianus et Candida utilis.
Le sucre inverti est utilisé en grande quantité pour la fabrication de confiseries, de gommes à
mâcher et de pâtisseries.
c)Lactase
(β-Galactosidase)
(α-galactosidase)
La β-galactosidase hydrolyse le lactose en glucose et galactose.
Elle est produite par certaines levures et moisissures, comme Kluyveromyces marxianus,
Aspergillus niger et Aspergillus oryzœ.
L'enzyme peut être utilisée pour enlever le lactose du lait, ce qui le rend plus digeste pour les
personnes souffrant d'intolérance au lactose.
Son action donne un lait plus sucré et plus soluble, ce qui est favorable pour la fabrication de
lait en poudre, lait concentré, lait congelé et base de crème glacée.
On l'ajoute aussi au lait pour accélérer la fabrication du fromage frais.
Cette enzyme permet également la valorisation du lactosérum, un sous-produit de la
fabrication du fromage, en transformant ce produit riche en lactose en un liquide plus sucré
utilisé en confiserie ou comme substrat pour la culture de levures.

L'α-galactosidase est une enzyme qui hydrolyse les glucides complexes ou


oligosaccharides (raffinose, stachyose et verbascose) contenus dans plusieurs légumes
(fèves, haricots, pois, soja, choux...) en sucres simples facilement assimilables.
Ces oligosaccharides, qui ne sont pas digérés par nos sucs digestifs mais fermentés par la
flore intestinale, sont à l'origine de problèmes de flatulence.
L'addition d'une petite quantité d'enzyme α-galactosidase aux mets incriminés, juste avant
leur consommation, permet de digérer la plus grande partie des oligosaccharides qu'ils
contiennent et prévient donc la flatulence.
Cette enzyme, produite par des moisissures, est maintenant commercialisée et offerte au
grand public dans les pharmacies et les magasins de produits naturels.

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d)Glucose isomérase
La glucose isomérase convertit le glucose en fructose.
Cette enzyme est produite industriellement par différentes bactéries appartenant aux genres
Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Microbacterium et Actinoplanes.
La glucose isomérase est surtout utilisée pour la fabrication de sirop de maïs riche en
fructose.
Ce sirop est d'abord produit par l'action d'amylases sur l'amidon de maïs.
Le sirop glucose qui en résulte est ensuite traité avec la glucose isomérase, ce qui rend le
sirop plus sucré (le fructose a un pouvoir sucrant supérieur à celui du glucose).
Il est très utilisé en confiserie et dans la préparation de boissons non alcoolisées.
e) Glucose oxydase
La glucose oxydase est produite par Aspergillus niger, Pénicillium purpu-rogenumet
d'autres moisissures semblables.
Cette enzyme catalyse l'oxydation du glucose en acide gluconique.
Une autre enzyme, la catalase (produite par Aspergillus niger ou Micrococcus
lysodeikticus), est jointe à la préparation enzymatique pour décomposer le peroxyde
d'hydrogène formé.
Cette préparation est employée principalement pour éliminer le glucose des blancs d'œuf ou
des œufs entiers avant leur séchage, ce qui aide à prévenir leur brunissement, leur
détérioration et améliore leurs propriétés moussantes.
f) Pectinases
Les pectinases produites par des moisissures (principalement Aspergillus niger et
Rhizopus oryzœ) permettent d'hydrolyser la pectine des fruits et d'éviter ainsi la formation de
gel lorsque celui-ci est contre-indiqué (jus de fruits concentrés, par exemple).
Ces enzymes permettent la clarification des jus de fruits, du vin, du vinaigre et des sirops.
L'addition de pectinases dans des fruits écrasés aide à l'extraction du jus.
g) Cellulase
La cellulase permet de dégrader la cellulose en sucres solubles.
Elle est produite par différentes espèces de mycètes comme Myrothecium verrucaria,
Trichoderma viride, Aspergillus niger, Stachybothry satra, etc.
Cette enzyme permet de produire davantage de sucres fermentescibles dans le moût de
brasserie. Elle aide également à clarifier les jus de fruits.
h) Lipases
Les lipases agissent sur les matières grasses en les hydrolysant en glycérides, acides
gras et glycérol.
Elles sont produites par un grand nombre de levures et de moisissures comme Aspergillus
niger, A. oryzœ, Pénicillium roqueforti, Mucor, Rhizopus, Candida lipolytica, Torulopsis
ernobii et certaines bactéries du genre Pseudomonas.
Les lipases peuvent être utilisées pour améliorer la saveur des fromages, de la crème glacée,
de la margarine, du beurre, de pâtisseries et d'autres produits.
Elles permettent également d'éliminer les graisses insolubles dans les préparations de
poissons et de blancs d'œufs destinées à la déshydratation.

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i) Enzymes protéolytiques (Protéases)
Les protéases hydrolysent les protéines.
Chaque type d'enzymes brise les chaînes polypeptidiques à des endroits précis, libérant des
peptides puis des acides aminés.
Les bactéries Bacillus siibtilis, Streptomyces griseus et la moisissure Aspergillus oryzœ sont
les principales sources d'enzymes protéolytiques d'origine microbienne.
Les usages sont :

 Amélioration de la texture de la pâte (action sur le gluten de la farine)


 Attendrissement de la viande.
 Clarification et stabilisation de différents liquides comme la bière (empêche la
formation d'opacité durant le refroidissement).
 Amélioration de la filtrabilité de certains liquides et de blancs d'œufs destinés à la
déshydratation.
 Production de protéines hydrolysées solubles.

Rennine (ou rennet)


D'autres protéases permettent la coagulation de la caséine du lait.
C'est le cas de la rennine fongique, qui peut remplacer la présure bovine pour la fabrication
de fromages.
Les espèces utilisées actuellement pour cette production sont Endothia parasitica, Mucor
miehei et Mucor pusillus.

5.2- Préparation industrielle d’enzyme

5.2.1- Définition

La préparation d’extrait enzymatique consiste à extraire mécaniquement ou


chimiquement l’enzyme et à éliminer les autres substances inactives. Cette opération présente
quelques délicatesses compte tenu de la dénaturation possible des enzymes (l’inactivation des
enzymes).

5.2.2 -Sources des enzymes

Les principales sources des enzymes sont :

- Sources d’origine animale


- Sources d’origine végétale
- Sources d’origine microbienne

D’une façon générale, quand on a une source, la première démarche est de savoir si cette
source est riche en l’enzyme recherchée. On peut utiliser des procédés pour induire la
production de l’enzyme recherchée.

En ce qui concerne les sources végétales, l’induction peut se faire souvent en changeant les
conditions environnementales.

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 34


Exemple :

- on induit la production des cellulases en injectant l’éthylène et l’acide indolacétique.

- on induit la production de l’amylase en injectant l’acide gibbérellique

Pour ce qui concerne les sources animales, il faut tenir compte de plusieurs facteurs :

- l’âge de l’animal
- l’espèce animale
- les conditions d’exécution de l’animal
- les délais d’extraction

Pour les sources microbiennes il faut :

- une bonne source microbienne ;


- un bon milieu de culture avec ou non des additifs nutritifs ;
- une bonne maitrise des techniques de fermentation, c'est-à-dire pH, Température, 
l’oxygénation… ;
- choisir de préférence des souches mutantes qui ne possèdent pas de répresseur pour le
gène donnant l’enzyme.

5.2.3-Extraction des enzymes

Cette opération consiste à rompre et à faire éclater les membranes et paroi cellulaires
afin que les enzymes se retrouvent en solution aqueuse tamponnée.

En ce qui concerne les tissus végétaux et animaux on les hache à l’aide de broyeuses (ou de
mortier de laboratoire) en présence de solvant et de tampon appropriés.

Pour les cellules microbiennes, elles peuvent être soumises à plusieurs traitements tels que :

-congélation, décongélation rapide

Entraine la perforation des membranes cellulaires par les cristaux de glace formés.

-broyage par des abrasifs (billes)

Les abrasifs sont des billes qui vont par des mouvements broyer les microorganismes.

- la lyse enzymatique (par les lysozymes)

Les lysozymes hydrolysent les liaisons ß (1→4) du mucopolysaccharide de la paroi des


bactéries.

A la suite de ces opérations on obtient l’extrait brut d’enzyme qu’on purifie.

5.2.4 -Purification des extraits enzymatiques

Elle consiste à éliminer les substances inactives, les protéines dénaturées, les protéines
autres que l’enzyme recherchée.

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 35


Selon que l’on veut préparer une enzyme à usage industrielle ou une enzyme analytique les
techniques de purification utilisées changent.

5.2.4.1 -Préparations des enzymes industrielles

Les enzymes industrielles sont des préparations enrichies par un fractionnement de


l’extrait brut et mis sur le marché après un traitement approprié. Pour ces préparations le taux
de purification ou enrichissement (As finale /As initiale) se situe autour de 60 fois.

Les méthodes les plus utilisées pour la préparation de ces enzymes sont :

- Les méthodes de Précipitation


a) Précipitation fractionnée par les sels

Lorsqu’on étudie la solubilité d’une protéine en fonction de la force ionique on a :

Figure 1 : Solubilité des enzymes en fonction de la force ionique

Avec µ= ½ (∑ C.z2) avec C= concentration molaire et z = valence des ions.

Si la concentration en sel est élevée la protéine précipite car il n’y a plus d’eau disponible
pour effectuer des liaisons avec la protéine. Ce seuil est caractéristique de la protéine. Il existe
pour chaque protéine en solution une concentration seuil en sel au-delà de laquelle la protéine
précipite. Ainsi certaines protéines précipitent à 10% ; 20% ;30% …de saturation.

Le sel qui est le plus utilisé communément pour cette opération est le sulfate d’ammonium
(NH4)2SO4. Il est très soluble et il ne dénature pas assez les protéines.

On doit savoir la quantité de sel introduit pour avoir la première précipitation. Le problème
est que le sulfate d’ammonium est très hygroscopique et la solution trouvée, est de préparer
une solution saturée de sulfate d’ammonium. Pour avoir les différentes saturations on
applique la formule suivante :

V = 100 (Sf-Si)/ (1-Sf), (la formule générale est V = VE(Sf-Si)/ (1-Sf), avec VE le volume
d’enzyme à précipiter)

COURS D’ENZYMOLOGIE  AU BTS -2 IAC Page 36


Avec V= volume d’une solution de sulfate d’ammonium saturée qu’il faut ajouter à 100 ml
d’extrait dont le % de saturation en (NH4)2SO4 est Si pour obtenir une solution ayant un
pourcentage de saturation de Sf.

Au départ on a Si= 0, pour avoir Sf = 20% (0,20) de saturation par exemple il faut verser
environ 25 mL de solution saturée. (V= 100(0,20-0)/1-0,20). Si on continue on prendra
Si=20%. On prend ensuite chaque précipité qu’on solubilise et qu’on détermine l’activité à
l’aide du substrat. On calcule aussi les As et les degrés ou facteurs de purification.

b) Précipitation au voisinage du pHi

La solubilité d’une protéine est minimale au voisinage de son pHi. On peut faire le
fractionnement des protéines en jouant sur le pH. Pour chaque protéine il existe une valeur de
pH (son pHi) à laquelle la protéine précipite.

Figure 2 : Influence du pH sur la solubilité des protéines

On fait les mêmes analyses que précédemment

c) La précipitation par les solvants organiques miscibles à l’eau (acétone, alcool,


méthyldiéther)

Ces solvants doivent être manipulés à froid (env. 4°C). A chaud ils dénaturent les
protéines. Ces solvants agissent en abaissant la constante diélectrique de l’eau, car ils vont
prendre toute l’eau et les protéines auront à précipiter.

5.2.4.2 - Préparation des enzymes analytiques

Les préparations enrichies d’enzymes sont utilisées pour obtenir les enzymes
analytiques. Les méthodes de purification sont des méthodes chromatographiques qui sont :

a) Chromatographie de filtration sur gel

Elle permet de séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire sur des gels
spécifiques réticulés ayant divers degrés de porosités. Il y a divers types de gels :

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- Le gel Séphadex qui dérive de la polymérisation du Dextrane avec un dérivé du
glycérol (l’épichloridine - CH2-Cl)

Dans le commerce on a différentes mailles G10, G15, G50, G100, G150, G200.

- Sépharose (agarose).

Le séphadex est sous forme de poudre, pour le transformer en gel, il faut le mettre dans
l’eau. On le met ensuite dans une colonne de chromatographie. La colonne est ensuite lavée
avec une solution tampon. On verse sur la colonne la solution protéique et on met un
collecteur de fraction programmé. Les fractions sont collectées selon un débit de la
chromatographie qui est fixé et maintenu constant grâce à une pompe péristaltique.

On sait que les plus grosses molécules sont éluées les premières. Dans chaque fraction on
dose les protéines par spectrophotométrie (mesure des DO) et on mesure l’activité de
l’enzyme recherchée dans chaque fraction.

Figure 4 : Profil chromatographique des phosphatases du tubercule de taro Xanthosoma sp sur gel
séphacryl S-200

La chromatographie d’exclusion-diffusion sur séphacryl S-200 a permis d’obtenir deux pics


phosphatasiques (PI et PII) élués respectivement aux alentours des fractions 128 et 140.

On va ensuite changer de mailles pour éliminer d’autres protéines éluées dans les
étapes de purifications précédentes avec notre protéine enzymatique.

Si l’activité spécifique des fractions recueillies est constante après deux techniques de
purification on peut dire qu’on a une fraction pure.

Cela peut être vérifié par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec un témoin
coloré. Après migration, on colore avec le bleu de Coomassie. Si on a une seule bande cela
veut dire qu’on a une protéine pure.

Actuellement il y a une grande variété de gels, d’autres sont utilisées en HPLC

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(Chromatographie en phase liquide haute performance) dans les colonnes et cela permet une
grande résolution.

b) Chromatographie échangeuses d’ions

C’est une méthode de séparation basée sur les propriétés ioniques des protéines. Chaque
protéine a son pHi. Si le PH < pHi, la protéine a une charge nette positive, si le pH est > pHi
la protéine a une charge nette négative. Si on met ces protéines sur un support chargé contenu
dans une colonne, elles vont être fixées et éluées en fonction de leur charge.

L’élution se fait en changeant progressivement le pH du milieu par ajout de solution


tampon de pH croissant ou décroissant ou en changeant la force ionique du milieu par ajout de
solution de NaCl par exemple.

Ces supports sont vendus sous forme de sel, il faut donc les réactiver en lavant avec la
solution tampon jusqu’à ce que cela soit homogène (pH entrée = pH sortie).

c) Chromatographie d’affinité

C’est une technique basée sur les propriétés de spécificité des enzymes. Le mélange de
protéines est versé sur une colonne contenant des analogues de substrat fixés. (Voir schéma)

Fixation Elution

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5.2.5- conditionnement des enzymes

Cela se fait après un certain nombre de traitement tel que :

 le dessalage (élimination du sulfate d’ammonium par dialyse) ;


 la filtration stérile éliminant les microorganismes ;
 ajout de conservateurs comme : le sorbitol, le glycérol, le NaCl…

On peut aussi lyophiliser en poudre pour les conserver en flacon.

A chaque étape de la préparation enzymatique, des mesures sont effectuées pour


contrôler la préparation enzymatique, on mesure :

a) Le volume total de l’extrait


b) La quantité totale de protéines recueillies
c) Les activités des extraits en UI/mL ; UI/mg ; UI/mole
d) Le taux de purification ou d’enrichissement : Enrich = AS finale /AS initiale
L’AS témoigne de la pureté de la préparation enzymatique. AS augmente à chaque
étape de la purification jusqu’à une valeur constante, lorsque l’enzyme est pure.
e) Le Rendement de la préparation : Rend = A Totale finale /A Totale initiale
Le rendement est toujours inférieur à 1 et peut être exprimé en pourcentage

5.3-Méthodes de mesure de l’activité enzymatique

Mesurer l’activité enzymatique, consiste à doser par volumétrie, potentiométrie ou par


colorimétrie la quantité de produit qui apparait dans le milieu réactionnel par unité de temps.
On arrête la réaction par chauffage brusque, par variation brusque du pH suite à l’ajout d’un
acide fort ou d’une base forte, par ajout d’un produit dénaturant l’enzyme.

5.3.1-Méthode en continu ou méthode cinétique

On prépare une série de milieu réactionnel d’où l’on détermine la quantité de produit
([P]) formée pendant des durées (t) de contact croissantes entre l’enzyme et le substrat, on

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dose les quantités de produit et on trace le graphe [P] = f (t). La vitesse initiale est égale à la
tangente à l’origine du graphe (tangente.de la partie linéaire du graphe).

Δ[P]
Vi= Δt = [ Po]
¿

5.3.2-Méthode par points ou méthode discrète

La réaction est arrêtée à différents temps. On dose le produit et on calcule la vitesse


moyenne de la réaction enzymatique.

 Méthode à deux points

Quand on connait la durée de la phase stationnaire, on peut réaliser que deux points
d’où le nom de la méthode à deux points. Dans cette méthode on arrête la réaction à un temps
t1, on dose la concentration du produit formé dans le milieu ([P1]). Dans un autre milieu
réactionnel on arrête la réaction à un temps de réaction t 2 (tel que t1<t2), on dose la
concentration du produit formé dans le milieu ([P2]).

Δ[P] [ P 2 ] −[P 1]
La vitesse de la réaction est donnée par la relation Vi= =
Δt t 2−t 1

 Méthode en point final

Dans cette méthode on laisse l’enzyme agir sur le substrat pendant un temps de réaction
tf on arrête la réaction et on dose le produit de la réaction ([Pf]).

[ Pf ]
On calcule la vitesse de la réaction qui est Vm = .
tf

Méthode utilisée pour le dosage de métabolites.

5.3.3- Méthode cinétique spectrale

C’est une méthode basée sur les propriétés d’absorption d’un des composés du milieu
réactionnel.

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Cette méthode est utilisée lorsque le substrat et le produit de la réaction sont de même nature
chimique (acide, basique, réducteur…), donc impossibilité d’utiliser le dosage volumétrique
acide –base ou d’oxydo - réduction.

 Exemple de réaction contrôlée


L’un des exemples de réaction est celui de la fermentation lactique : réduction du
pyruvate en acide lactique, catalysée par la Lactate déshydrogénase admettant le NADH, H+
comme coenzyme.

CH3-CO-COOH + NADH, H+→ CH3-CHOH-COOH+NAD+

Dans cette réaction, l’acide lactique et l’acide pyruvique sont des acides. La méthode de
dosage simple acide- base est donc impossible pour la mesure de la vitesse de formation du
lactate ou du pyruvate.
On choisira donc d’exploiter les propriétés spectrales d’absorption du NAD qui existent sous
deux formes :
- La forme réduite NADH, H+ présentant deux maximums d’absorption, une à 260 nm
et l’autre à 340 nm
- Une forme oxydée NAD+ présentant un seul maximum d’absorption à 260 nm

Figure 5: Spectre d’absorption du NAD+ et du NADH,H +

Lorsqu’on suit la DO à 340 nm d’un milieu réactionnel contenant la forme oxydée du NAD+
et le substrat au spectrophotomètre thermostaté, on peut obtenir le graphe DO = f(t) identique
au graphe [P]= f(t). Le graphe DO = f(t) peut être obtenu par enregistrement automatique dans
certains appareils.

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NB : Lorsque la réaction se déroule dans le sens de la formation du NAD+ avec
consommation de NADH,H+ le graphe DO = f(t) est semblable au graphe [S] = f(t)

 Calcul de l’activité enzymatique de la solution d’enzyme

Connaissant la loi de Beer-Lambert, D O = εlC

Avec :

C= concentration molaire en mol/L

l = trajet optique (longueur du tube colorimétrique) en cm

DO = Densité optique ou absorbance (sans unité)

ε = est le coefficient d’extinction molaire de la substance pour une longueur d’onde


donnée(pour le NADH, H+, ε = 6,22.103 L. mol-1 cm-1 à 340nm)

Δ[Do] 6
On pourra calculer la vitesse de la réaction Vi = CACMR = .10 UI. L-1 de milieu
Δt . ε .l
Δ[Do] 3
réactionnel ou CACMR = .10 UI.mL-1 de milieu réactionnel
Δt . ε .l

Dans la pratique le milieu réactionnel est composé de :

- Vs mL de substrat
- VE mL d’enzyme
- Vt mL de tampon
- Vc mL de coenzyme

Le volume total du milieu réactionnel en mL est : VT= Vs+VE+Vt+Vc .= VMR

La concentration d’activité catalytique de l’extrait enzymatique est donnée par la relation

VT
CACMR*VT = CACE *VE ⇾ CACE = CACMR.
VE

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Δ[Do] 3 V T
CACE = . 10 . UI.mL-1 d’extrait enzymatique
Δt . ε .l VE

5.4.-Enzymes immobilisées
Les enzymes ont paru dès le début comme un mode privilégié d’utilisation de la
biocatalyse. Ces biocatalyseurs peuvent présenter, cependant quelques inconvénients parmi
lesquels, leur manque de stabilité et leur coût qui ont pu paraître rédhibitoires pour certaines
applications.
A ces inconvénients ont répondu les techniques d’immobilisation contribuant à la
stabilisation des enzymes dans leurs conditions d’utilisation, à leur récupération éventuelle
pour réutilisation et à la possibilité de développer des réacteurs fonctionnant en continu. Ce
qui a ouvert la voie à l’exploitation industrielle.
D’autres avantages majeurs de ces techniques sont d’augmenter, de façon souvent
considérable, la productivité des bioréacteurs et la pureté des produits.
Une enzyme immobilisée est une enzyme liée par des moyens physico-chimiques en surface
ou à l’intérieur d’un support solide. On cherche généralement à conserver son activité
enzymatique, qui a tendance à diminuer après immobilisation du fait de possibles gênes
stériques, de limitations dans l’accessibilité au site actif ; et à augmenter sa stabilité dans le
temps, ce qui est souvent le cas du fait de la structure plus rigide conférée par
l’immobilisation aux enzymes. On distingue normalement trois types de stabilité pour une
enzyme immobilisée :

1. Stabilité de stockage : évolution de l’activité enregistrée dans les conditions usuelles de


conservation
2. Stabilité opérationnelle : évolution de l’activité de l’enzyme pendant des essais répétitifs
3. Stabilité thermique : résistance à des températures plus élevées auxquelles l’enzyme est
normalement dénaturée
De plus lorsqu’on met en œuvre des protéases, l’immobilisation permet de diminuer
les phénomènes d’hydrolyse mutuelle des enzymes (autolyse) qui conduit à leur inactivation
rapide en phase homogène.

Figure 6 : Stabilité thermique de la trypsine: trypsine libre (25 μg/ml) (); trypsine immobilisée
par: PEG-diamine (□), Dextrane aminé (▲) et BSA (); incubation à 50°C dans un tampon phosphate
de sodium 0,1 M pH=7,5).

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Figure 7 : Diminution des phénomènes d’hydrolyse de la trypsine après l’immobilisation

5.3.1- Méthodes d’immobilisation


Les méthodes citées dans la littérature sont très nombreuses. Cependant, il existe 3 grandes
méthodes, couramment utilisées pour immobiliser des enzymes : par inclusion, par adsorption
par établissement de liaison covalente.

a) Immobilisation par inclusion dans le réseau tridimensionnelle d’une matrice ou dans


une microcapsule
 Immobilisation par inclusion dans le réseau tridimensionnelle d’une matrice
L’enzyme est dispersée dans une solution homogène de monomère ou d’émulsion en présence
d’un agent de réticulation. La polymérisation du monomère conduit à la formation d’un
réseau au sein duquel l’enzyme est emprisonnée d’une manière purement physique.

Figure 8 : Inclusion dans un réseau de polymère insoluble

Cette méthode est très simple mais possède trois inconvénients principaux :
-le réseau formé est presque toujours trop lâche pour retenir complètement l’enzyme.
-la limitation diffusionnelle des substrats, des produits
-En présence d’agents complexants le gel se solubilise.

 Immobilisation par confinement et micro encapsulation

Cette technique consiste à enfermer des enzymes dans une membrane semi-perméable
(liposome, Bourdin de dialyse ; micro volume..).

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La limitation à des substrats de faibles poids moléculaires pour l’enzyme, constitue le
désavantage de cette méthode. Le second inconvénient est que la polymérisation interfaciale
qui aboutit à la formation des microcapsules, entraîne fréquemment une dénaturation des
enzymes. Certains ont alors songé à utiliser des fibres creuses à travers lesquelles l’enzyme ne
peut diffuser.

b) Immobilisation par Adsorption sur un support minéral ou organique

Cette méthode est extrêmement simple à mettre en œuvre puisqu’il suffit de laisser en
contact l’enzyme et le support à un pH, une force ionique et une température convenable. Les
différents types de liaisons intervenant dans l’adsorption sont : interactions de Van der Waals,
liaison hydrogène, transfert de charges (liaison ionique), échanges d’ions, interactions
hydrophobes.

Figure 9 : Immobilisation sur un support par adsorption physique

Le principal inconvénient est la fragilité de la fixation ; ce peut être également un


avantage si l’on souhaite résorber l’enzyme immobilisée pour la remplacer par une enzyme
native. Les autres désavantages de cette méthode sont les risques de mauvaise accessibilité au
site actif, du fait de l’absence de bras espaceur, les difficultés d’utilisation en réacteurs
continus du fait d’une désorption progressive de la protéine, qui est alors libérée dans le
milieu réactionnel.

c) Immobilisation par établissement d’une liaison covalente


Cette immobilisation est réalisée par l’intermédiaire de liaisons irréversibles et
covalentes entre les groupements fonctionnels de l’enzyme et les groupes réactifs du support.
Ces groupes, en général insuffisamment réactifs, nécessiteront une activation préalable. A
priori, il faut activer soit l’enzyme, soit le support. Pour des raisons qui tiennent à la difficulté
de maintenir l’activité de l’enzyme (l’activation des groupes fonctionnels de l’enzyme peut
conduire à la dénaturation de l’enzyme) et aussi à la faible réactivité chimique des acides

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aminés (amine primaire, acide carboxylique, parfois thiol, phénol, hydroxyle), on choisit
généralement d’activer le support.

Figure 10 : Immobilisation covalente de l’enzyme sur un support

Afin de lier l’enzyme au support par liaisons covalentes, on fait apparaître sur le
support des fonctions chimiques réactives. Ces fonctions peuvent être créées par réaction
directe (cellulose + CNBr par exemple) ou par greffage de composé bifonctionnel (bras
espaceur) qui comporte une fonction capable de former une liaison covalente avec les
fonctions portées par les enzymes. Ce composé permet de fixer l’enzyme à une certaine
distance du support et d’avoir une meilleure accessibilité de l’enzyme à son substrat. Le
tableau présenté montre certain des différents bras espaceurs utilisés pour lier les fonctions
des supports et les fonctions portées par l’enzyme

Tableau 1 : Principaux groupements réactionnels entre le support et l’enzyme

Avantages de la méthode
- L’enzyme est solidement fixée, plus d’aléa de désorption.
- Possibilité d’utiliser plusieurs fois l’enzyme car fixée solidement.

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- Renforcement de la structure tridimensionnelle de l’enzyme, ce qui améliore les
propriétés de l’enzyme.

Inconvénients

- Possibilité d’inactivation des enzymes par les résidus issus de l’activation des
supports, si l’on n’arrive pas à s’en débarrasser.
- Problème d’accessibilité à l’enzyme par les substrats si l’enzyme est pratiquement
collée au support par le coté de son site actif.

Les supports généralement utilisés pour l’immobilisation peuvent être classés en deux
grands groupes :
 les supports organiques qui comprennent les polyosides (acétate de cellulose, nitrate
de cellulose, dextrane, agarose, alginate, chitosanes, amidon), les polymères (le
Polyéthylène (PE), le polypropylène (PP), le polystyrène (PS) , le polyéthylène téréphtalate
(PET) etc) ;
 les supports inorganiques (verre poreux, silice, métalliques, alumino-silicates, etc.)
Les supports organiques peuvent être chimiquement activés par différentes techniques Ce qui
constitue l’un de leurs principaux avantages car ils permettent la fixation d’enzymes par
différentes voies.

Les supports inorganiques sont généralement plus stables (résistance à l’usure, aux agents
chimiques et aux bactéries) mais la fixation covalente sur ces supports est difficile à cause de
leur faible réactivité.

5.3.2 Propriétés des enzymes immobilisées

Les propriétés des enzymes immobilisées sont différentes de celles des enzymes libres

Exemple : Propriétés de l’ATPase d’E. coli

Propriétés Enzyme soluble Enzyme immobilisées


Activité (Vmax) en UI 10 100
pH optimum 9 7,5
KM 0,4 0,2
Cryosensibilité Très sensible Résistante
Sensibilité à la protéolyse(en présence de Sensible Résistante
trypsine)

Il ya une grande différence entre l’enzyme soluble et l’enzyme immobilisée.

Les changements concernent principalement la stabilité et les principaux paramètres


cinétiques et physico chimiques.

 Au niveau de la stabilité, on remarque les enzymes immobilisées sont plus stables que
les enzymes libres. Cela se traduit par plusieurs facteurs :
 Le temps de conservation est long
 La stabilité dans le fonctionnement

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Exemple :
- une enzyme libre peut fonctionner à 30 ° C pendant 24 h
- Si l’enzyme est immobilisée le temps de fonctionnement peut aller d’une semaine à
plusieurs mois en fonction des méthodes de fixation et d’activation.
 Résistance aux solvants organiques
Les enzymes en solution ne résistent pas à une solution à 10% de méthanol par
exemple alors que ces mêmes enzymes immobilisées peuvent résister jusqu’à 40% de
méthanol.
 Résistance aux enzymes protéolytiques et aux bactéries

 En ce qui concerne les paramètres physico chimiques, il faut dire les enzymes
immobilisées se trouvent dans une catalyse hétérogène. Elles n’ont pas certes les
mêmes cinétiques que les enzymes libres, mais ces cinétiques respectent les lois de
Michaëlis et Menten.

Ainsi on peut déterminer KM et Vmax apparents, ces paramètres subissent des changements
qui ne sont pas les mêmes que ceux des enzymes en solution.

Vmax en général diminue (pour les enzymes immobilisées) car au cours de l’immobilisation,
il ya perte de vigueur (vitalité) de l’enzyme, aussi cela est due à la possibilité d’accès du
substrat au site actif de l’enzyme immobilisée.

Le KM varie sensiblement par rapport à celui de l’enzyme libre (enzyme en solution) cela
dépend de la charge du support et du substrat.

Par exemple : un support chargé négativement va attirer facilement un substrat chargé


positivement, ce qui va agir sur le KM.

Si le support et substrat ont la même charge, il va avoir une répulsion du substrat, ce qui va
entrainer une augmentation du KM.

En ce qui concerne le PH, la variation provient de la charge positive ou négative du support


qui permet de pomper soit les H+ soit les OH-. Ce qui permet d’avoir un pH optimum qui n’est
pas vraiment celui de l’enzyme libre.

En ce qui concerne la température, on remarque que les enzymes immobilisées résistent plus à
l’action dénaturante des températures. Car l’immobilisation renforce la conformation
tridimensionnelle des enzymes.

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