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Master M1 Sciences Pharmacologiques FSB/USTHB 2020/2021

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TD/TP : Stress oxydatif xénobiotiques et réponse cellulaire

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Exercice n°1:

Plusieurs travaux ont montré le rôle clé de la mitochondrie dans l’apoptose des
parasites Leishmania. L’apoptose via la mitochondrie due au signal calcique cytosolique
induit l’activation des protéases caspase like 3/7 et la libération des facteurs apoptotiques. De

2
nombreux travaux ont montré que les leishmanies, lors d’un stress mitochondriale peuvent
subir une apoptose caspase dépendante ou indépendante. Cependant, le rôle du stress oxydatif

20
du réticulum endoplasmique est moins bien étudié.

1)-Quelles sont les fonctions du réticulum endoplasmique dans la cellule


2)-Dans qu’elles cas le RE déclenche l’apoptose.

Expérience 1 :

P
Afin, d’étudier l’implication du stress oxydatif du RE dans l’apoptose des leishmanies,
6
5.10 promastigotes en phase exponentielle de croissance sont cultivés dans du RMPI1640,

1S
10% SVF en présence ou en absence de concentrations croissantes de tunicamycine (TM).
L’incubation avec la tunicamycine est précédée ou non avec un prétraitement à la verapamile
1heure avant l’addition de la tunicamycine. La viabilité des promastigotes est étudiée par le
test MTT et le résultat obtenu est représenté par la figure n°1.
yM
% cellules vivantes

ox

Temps (heures)
ss

Figure n°1

3)-Que représente la tunicamycine.


4)-Dans quel but à été utilisé la TM et qu’elle est son effet sur les promastigotes de
re

Leishmania (Analysez la Figure n°1).


St

Expérience 2 :

Pour comprendre le mécanisme de l’effet cytotoxique de la TM, les promastigotes


traités ou non avec 20µg/ml TM sont incubés avec de l’annexine V (Figure n°2). Une analyse
supplémentaire a été réalisée dont le résultat est exprimée par la Figure 3.
TD

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5)-Quelle est l’analyse effectuée au niveau de la figure 3
6)-Quelle est l’effet de la TM sur les deux paramètres étudiés
7)-D’après les résultats de la figure 2 et 3, quel est le phénomène à l’origine de l’effet
cytotoxique de la TM.

2
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Counts

P
102 104 102 104 102 104

1S Figure n°2
yM
Counts

102 104 102 104 102 104


ox

Figure n°3

Expérience 3 :
ss

L. major est incubée avec 20µg/ml de TM pendant 2, 4, 8 et 16 heures et l’expression


des protéines BIP/GRP78 est analysée par western blot (Figure n°4)

8-Qu’elle est la BIP/GRP78


re

9-Comment varie l’expression de la BIP/GRP78 par le traitement à la TM


10-Définissez la réponse UPR, unfolded protein response.
11-Citez les manipulations chimiques induisant la réponse UPR.
St
TD

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Intensité

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Temps (heures)

P
Figure n°4

Expérience 4 :

1S
UPR est généralement associés à des perturbations du taux des espèces réactives de
l’oxygène et le taux de Ca2+. Ainsi, 107 promastigotes de Leishmania major/ml traités avec
TM ou non (Control) sont incubés avec 10µM d’une sonde sensible à l’H2O2, le 2,7-
dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester (H2DCFDA, DCF) à l’obscurité pendant
30min à 26°C. La lecture est faite par spectrofluoromètre (Figure n°5). Les ROS générés par
la mitochondrie sont évalués par cytométrie de flux via une sonde spécifique à la détection
yM
des anions superoxydes de la mitochondrie, MitoSOX : MS (Figure n°6).
ox

Temps (min)
ss

Figure n°5
re Counts
St

102 104 102 104 102 104 102 104

Figure n°6
TD

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12-Donnez le principe de la technique de détection utilisée pour la production du H2O2
13-Quelle est l’effet de la TM et la N-acetyl cystéine (NAC) sur la production du H2O2 et des
anions superoxydes (Analysez les Figure 5 et 6).

Expérience 5:

2
Pour la mesure du Ca2+ intracellulaire, les leishmanies traités ou non avec la TM sont

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incubés avec 6µM d’un fluorophore (Fluo), dont l’émission augmente à 518nm, une fois lié
au Ca2+. Après 60min d’incubation, les cellules sont analysées avec un fluoro-
spectrophotomètre (Figure n°7).

14-Que représente le verapamil


15-Dans quel but utilise t-on le verapamil et la NAC.

P
Ca 2+ cytosolique (nM)

1S
yM

Temps (min)
Figure n°7

Expérience 6 :
ox

Les leishmanies sont traitées ou non avec la TM et le potentiel membranaire mitochondriale


(Figure n°8) et le taux d’ATP (Figure n°9) sont mesurés. Le potentiel de la membrane mitochondriale
est mesuré par cytométrie de flux après incubation avec le colorant JC-1 (tetrachloro-
tetraethylbenzimidazole carbocyanide iodide).
Intensité moyenne du 590/530
ss
Intensité à 590nm

re
St

Intensité à 530nm
TD

Figure n°8

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16-Pourquoi on s’intéresse au potentiel membranaire mitochondriale et le taux de l’ATP
17-Décrivez brièvement l’effet du colorant JC-1
18- Expliquez l’effet chaque modulation pharmacologique sur le potentiel membranaire et le
taux d’ATP
19- Que représente le traitement au carbonyl cyanide-chloro phenylhydrazone (CCCP)

2
Control

20
P
Expérience 7 :
1S Figure n°9

Le stress oxydatif et la perturbation du Ca2+ cytosolique et mitochondriale provoque la


yM
libération des facteurs pro apoptotiques mitochondriaux. Dans le but, de rechercher l’effet de
la TM sur la libération des facteurs pro apoptotiques, les leishmanies traités ou non à la TM
sont fractionnés en 3 fractions subcellulaires : Mitochondrie, Cytosol et Noyau. Les 3
fractions sont analysées par western blot (Figure n°10, A : Mitochondrie, B : Cytosol, C :
Noyau) avec :

- Un anticorps de lapin anti-cytochrome c de Trypanosoma brucei


ox

- Un anticorps de souris anti-RNA import Complex I mitochondrial de Leishmania tropica


- Un anticorps de lapin anti-Endo G de Leishmania donovani
- Un anticorps de lapin anti-adenosine kinase de Leishmania donovani
- Un anticorps de lapin anti-Histone H3B.

20- Analysez la localisation du Cytc, Endo G, Histone H3B dans les 3 fractions subcellulaire.
ss

21- Expliquer l’implication de ces molécules dans l’apoptose


22- Résumez l’effet de la TM sur ces 3 molécules
re
St
TD

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Intensité des bandes

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Intensité des bandes

P
1S
Intensité des bandes
yM
ox

Figure 10 : A : Mitochondrie, B : Cytosol, C : Noyau


Ligne 1 : Control
Ligne 2 à 4 : Traitement TM à 2, 4, et 8 heures.
ss

Ligne 5 : prétraitement à la NAC avant le traitement à la TM.

Expérience 8 :
re

A fin d’étudier l’implication de l’activité caspase dans l’apoptose induite par la TM.
Après traitement des promastigotes à la TM, les activités caspace12-Like, caspace 3/7 Like et
métacaspace Like sont évaluées par fluorométrie à l’aide de fluorochromes : ATAD-AFC,
St

FLICA et Boc-GRR-AMC respectivement. Des inhibiteurs spécifiques de caspace 12Like (Z-


ATAD-FMK), caspace 3/7Like (VAD-FMK) et métacaspase Like (antipain) sont ajoutés
30min avant la TM (Tableau n°1).
TD

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Activité Caspace-12-like activité Caspase 3/7-like activité Metacaspase-like
Cellules ATAD-AFC ATAD-AFC+ FLICA FLICA + Boc-GRR AMC Boc-GRR AMC
Z-ATAD-FMK VAD-FMK + antipain
Control 18757±1578 18353 ± 1218 162 ± 11 122 ± 14 409 ± 30 338 ± 29
Traitées TM 21676±1131 19912 ± 2078 231 ±17 176 ± 9 658 ± 21 425 ± 32

2
20
Tableau n°1:

23- D’après les résultants obtenus, l’effet de la TM est-il caspase dépendant ou caspase
indépendant, si oui qu’elles sont les caspase Like impliquées

Expérience 9 :

P
Pour étudier l’implication du RE dans l’effet de la TM, les promastigotes sont d’abord
traités avec le PBA, ou le BAPTA-AM (Figure n°11)

1S
yM
ox
ss

Annexin V dUTP
re

Figure n°11
St

24-Quelle est la différence entre le BAPTA et le BAPTA-AM


25-Que représente le PBA
26-Qu’elle est l’effet du PBA et le BABPTA sur l’externalisation du PS et la dégradation
d’ADN via la TM
TD

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27-D’après l’ensemble de ces résultats proposer un mécanisme d’action de la TM sur les
promastigotes de Leishmania major.

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P
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yM
ox
ss
re
St
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Exercice n°1 :
L’obésité est fréquemment associée à une insulinorésistance. Celle-ci trouve son origine, à la
fois, dans le dysfonctionnement de la voie de signalisation de l’insuline, mais également dans
la modification du profil d’expression des adipokines, avec notamment une augmentation de
la synthèse des adipokines pro-inflammatoires.
Au niveau du tissu adipeux, de nombreux facteurs tels que l’hypoxie, l’augmentation des

P
concentrations circulantes d’acides gras libres ou encore l’induction d’un stress oxydant,
semblent être autant de facteurs causaux de ce dysfonctionnement /dérégulation des
adipokines.

1S
yM
ox
ss
re
St
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[1] L’apoptose est un mécanisme de mort cellulaire programmée répondant à des signaux
extracellulaires et intracellulaires. L’apoptose joue un rôle essentiel lors du développement
embryonnaire et est impliquée dans l’élimination de cellules superflues chez l’organisme

2
adulte. La dérégulation des processus apoptotiques est impliquée dans des nombreuses
maladies humaines incluant le cancer.

20
Le repliement de protéines est un processus essentiel à la vie. Des défauts dans le repliement
de protéines sont la cause de plusieurs pathologies graves telles que la fibrose kystique,
l'emphysème juvénile, certains types d'hémophilie, ainsi que dans les maladies d’Alzheimer et
de Parkinson. Le repliement des protéines membranaires et destinées à la sécrétion est un
processus finement régulé prenant place au cœur du réticulum endoplasmique (RE). Le RE

P
contient de nombreuses protéines intervenant dans le repliement, telles les foldases et les
chaperones.

Certains stress cellulaires

1S
affectent le repliement des protéines causant
surcharge du RE. Cette surcharge est néfaste pour la cellule et doit être contrer afin d’éviter
la mort. A cette fin, la voie du UPR (Unfolded Protein Response) est une réponse spécifique au
stress du RE, qui est conservée chez les eucaryotes, des levures à l’homme. L’activation du
UPR a deux actions principales permettant la survie dans des conditions de stress du RE:
ainsi une

l’arrêt de la synthèse protéique globale et, la synthèse accrue des chaperones et foldases
yM
impliquées dans le repliement. Lorsque la voie du UPR ne réussit pas à palier la surcharge du
RE, l’apoptose est induite provoquant la mort des cellules.

Les mécanismes de régulation de la survie cellulaire par le UPR versus les voies apoptotiques
ne sont pas encore complètement élucidée et, demeurent un défi important
à explorer. Des failles dans les programmes apoptotiques liés au RE ont été impliquées dans
nombreuses pathologies humaines comme l’ischémie cérébrale et cardiaque, des maladies
ox

autoimmunes, des maladies neurodégénératives, l’obésité, le cancer et les maladies du


repliement protéique.

La calnexine est une chaperone moléculaire impliquée dans plusieurs processus cruciaux
du RE tels le repliement des protéines nouvellement synthétisées, l’homéostasie du
ss

calcium et plus récemment dans des processus apoptotiques associés au stress du RE


chez les mammifères.

Notre laboratoire a démontré que la calnexine est impliquée dans l’apoptotique chez la levure
Schizosaccharomyces pombe, un puissant modèle génétique ayant de nombreuses
re

ressemblances avec les cellules humaines. Nos études constituent la première démonstration
du lien direct entre la calnexine et le processus apoptotique et ont apporté
la première constatation de l’importance de l’ancrage de cette chaperone à la membrane du
St

RE dans la signalisation de la voie apoptotique. Les objectifs du laboratoire sont: 1) Identifier


les déterminants moléculaires de la calnexine impliqués dans l’apoptose causée par le stress
du RE. 2) Déterminer le rôle de la calnexine dans l’apoptose induite par diverses stimuli. 3)
Identifier les molécules interagissant avec la calnexine dans les processus apoptotiques.
TD

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Dans nos études, nous utilisons les puissantes approches de génétique de levure combinées à
des méthodes post-génomiques ainsi que des méthodes de pointe de biologie moléculaire et
de biochimie. Étant donné les grandes ressemblances entre les cellule
de S. pombe et les cellules animales en ce qui concerne le repliement de protéines et divers
processus cellulaires de base, nos recherches contribueront à l’élucidation des mécanismes de

2
signalisation vers la voie apoptotique prenant sa source dans le RE. Nos recherches
contribueront au développement de stratégies pharmacologiques pour le traitement de

20
maladies humaines impliquant le stress du réticulum endoplasmique.

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