124.bacterial Endotoxin Test

Internal use
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PAR : NAME/NOM:
REVIEWED BY/REVISE PAR : MICROBIOLOGY HEAD /RESPONSIBLE DATE :

MICROBIOLOGIE
NAME/NOM :
REVIEWED BY/REVISE PAR MICROBIOLOGY HEAD RESPONSIBLE / DATE :

RESPONSIBLE MICROBIOLOGIE
NAME/NOM :
REVIEWED BY/REVISE PAR : HEAD QUALITY CONTROL /

DIRECTORE QUALITY CONTROL
NAME/NOM : DATE
APPROVED BY/APPROVER QUALITY ASSURANCE MANAGER/ DATE :

PAR: MANAGER ASSURANCE QUALITE
NAME:
SUMMARY/SOMMAIRE
1. IMPLEMENTATION GUIDELINE / OTHER REFERENCES:
LIGNES DIRECTRICES APPLIQUEES / AUTRES REFERENCES:
2. PURPOSE& SCOPE:
BUT ET DOMAINE D’APPLICATION:
3. RESPONSIBILITIES:
RESPONSABILITES:
4. REQUIREMENTS:
EXIGENCES:
5. CHANGE CONTROL :
CONTROLE DE CHANGEMENT :
6. DEFINITIONS / ABBREVIATIONS:
DEFINITIONS / ABREVIATIONS:
7. ANNEXURES :
ANNEXES:
8. PROCEDURE:
PROCÉDURE:
9. CHANGES FROM LAST EDITION:

CHANGEMENTS DEPUIS LA DERNIERE EDITION:
1.0 IMPLEMENTATION GIDELINE / 1.0 MISE EN OEUVRE GIDELINE /

OTHER REFERENCE : AUTRES RÉFÉRENCES:
1.1 USP 35, Chapter <85> Bacterial Endotoxin 1.1 USP 35, chapitre <85> Test
Test Ph. Eur d'endotoxines bactériennes
1.2 Ph.Eur.Appendix 2.6.14 Bacterial 1.2 Ph.Eur. Annexe 2.6.14 Endotoxines
Author (sign & date) Department Head (sign & date) QA (sign & date)
FRM/QA/GEN /001, v. 1 Reference: SOP/ QA/GEN/ 001
Endotoxins bactériennes
2.0 PURPOSE & SCOPE: 2.0 OBJET ET DOMAINE

2.1 The purpose of the SOP is to perform BET 2.1 D'APPLICATION
by using LAL reagents. 2.2 Le but du SOP est d'effectuer le test
2.2 This SOP describes the procedures to be d’endotoxine bactérienne en utilisant des
follo wed for confirmation of labelled réactifs LAL.
sensitivity of LAL reagent. 2.3 Cette SOP décrit les procédures à suivre
2.3 pour la Confirmation de la sensibilité du
Analytical method validation of bacterial 2.4 réactif LAL marquée sur l’étiquette.
2.4 endotoxin test (LAL test). La validation de la méthode analytique
Routine LAL test applicable to raw du test d'endotoxine bactérienne (test
materials, bulk intermediates, sterile LAL).
2.5 finished dosage forms, WFI and steam 2.5 Le test d’endotoxine de routine
sample. applicable aux matières premières,
This SOP is applicable at microbiology of produits intermédiaires en vrac, produit
sophal spa finies, WFI et échantillon de vapeur.
Cette SOP s'applique aux unités de
microbiologie de la spa sophal.
3.0 RESPONSIBILITIES : 3.0 RESPONSABILITÉS
3.1 Microbiologists working in the 3.1 Les microbiologistes travaillant en
Microbiology lab are responsible to follow microbiologie sont responsables de
this SOP. suivre cette SOP.
3.2 Microbiology head is responsible for the 3.2 Le responsable de la microbiologie est
implementation of this SOP. responsable de la mise en œuvre de cette
SOP
3.3 AQ is responsible to ensure the compliance 3.3 AQ est responsable d'assurer la
of this SOP. conformité de ce SOP.
4.0 REQUIREMENTS : 4.0 EXIGENCES:
4.1 Use depyrogenated glassware only. 4.1 Utiliser uniquement une verrerie
dépyrogénéisée
4.2 All the tubes should be properly labeled to 4.2 Tous les tubes doivent être correctement
avoid misinterpretation of results. étiquetés pour éviter une mauvaise
interprétation des résultats.
4.3 Store the reagents appropriately before and 4.3 Conserver les réactifs de manière
after use. appropriée avant et après utilisation.
4.4 Use Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 4.4 Utiliser le Lysat d'amibocyte Limulus
obtained from the aqueous extracts of (LAL) obtenu à partir des extraits
circulating amebocytes of horseshoe crab aqueux d'amibocytes circulants de
(Limulus Polyphemus or Tachypleus crabes (Limulus polyphemus ou
tridentate) which has been prepared and Tachypleus Utiliser des lots LAL (lysat)
characterized for use as an LAL Reagent. et CSE (Endotoxine) qualifiés dotés d'un
Use qualified LAL and CSE lots provided certificat du fournisseur correspondant.
with a matching CoA
4.5 Quanities of endotoxin are expressed as 4.5 Les quantités d'endotoxines sont
USP Endotoxin Units (USP-EU), where exprimées en unité d’endotoxines USP
one USP-EU is equal to one IU of (USP-EU), où une USP-EU est égale à
endotoxin une UI d'endotoxine
4.6 Always use glass tube of dimension 10 mm 4.6 Toujours utiliser des tubes en verre de
X 75 mm for testing of endotoxin by Gel dimension 10 mm X 75 mm pour tester
clot method. l'endotoxine par la méthode de gel clot
4.7 Materials and Methods : 4.7 Matériaux et méthodes:

4.7.1 Depyrogenated Assay Tubes 10 x75mm 4.7.1 Tubes de dosage dépyrogénéisés 10
x75mm
4.7.2 Depyrogenated dilution tubes 12 x 75mm 4.7.2 Tubes de dilution dépyrogénéiséés 12 x
75mm
4.7.2 Water bath / Heating Block set and 4.7.3 Bain marie / plaque chauffante réglée et
Maintained at 37°C ± 1°C. maintenue à 37 ° C ± 1 ° C
4.7.4 Vortex Mixer 4.7.4 Agitateur Vortex
4.7.5 Sterile and Depyrogenated fresh disposable 4.7.5 ambouts stériles et dépyrogénéisés
pipette tips
4.7.6 Test Tube Rack 4.7.6 portoires
4.7.7 LAL Reagent (Lysate) 4.7.7 Réactif LAL (Lysate)
4.7.8 Control Standard Endotoxin (CSE) 4.7.8 Contrôle de l'endotoxine standard (CSE)
4.7.9 Lal Reagent Water (LRW) 4.7.9 Eau LAL (LRW)
5.0 CHANGE CONTROL : 5.0 CONTRÔLE DE CHANGEMENT:
The requirement for the change of the L'exigence de modification de la
written procedure for “Bacterial Endotoxin procédure écrite pour "test d'endotoxine
Test” must be specified. Such changes must bactérienne" doit être spécifiée. De tels
be authorized through formal change changements doivent être autorisés par
control procedure une procédure formelle de contrôle des
changements
6.0 DEFINITIONS / ABBREVIATIONS : 6.0 DÉFINITIONS / ABRÉVIATIONS:
6.1 DEFINITIONS : 6.1 DÉFINITIONS:
6.1.1 Endotoxin: A large toxic molecule derived 6.1.1 Endotoxine: Une molécule toxique
from the outer cell wall of Gram-negative dérivée de la paroi cellulaire externe des
bacteria that create pyrogenic response bactéries Gram négatives qui créent une
when inside human body. Endotoxin is a réponse pyrogène à l'intérieur du corps
complex molecule of polysaccharide, lipid humain. L'endotoxine est une molécule
A, and other cell wall components. complexe de polysacharides, de lipide
A et d'autres composants de la paroi
cellulaire
6.1.2 Endotoxin Limit (E.L.): The maximum 6.1.2 Limite d'endotoxine (E.L.): la quantité
amount of endotoxin allowed in a maximale d'endotoxine autorisée dans
parenteral product or medical device. un produit parentéral ou un dispositif
médical.
6.1.3 Maximum Valid Dilution: Maximum 6.1.3 Dilution maximum valide: dilution
acceptable dilution of a product for the maximale acceptable d'un produit pour
BET resulting in detection limits not le test d’endotoxine, résultant des
exceeding the product specific Endotoxin limites de détection ne dépassant pas la
Limit. limite d'endotoxine spécifique du
produit
6.1.4 Active Pharmaceutical Ingredient: Any 6.1.4 Ingrédient pharmaceutique actif:
substance or mixture of substances toute substance ou mélange de
intended to be used in the manufacture of a substances destinées à être utilisées dans
drug product and that, when used in the la fabrication d'un produit
production of a drug, becomes an active médicamenteux devienne un ingrédient
ingredient of the drug product. actif du médicament.
6.1.5 Excipient: Substances other than the active 6.1.5 Excipient: Substances autres que
pharmaceutical ingredient, which have been l'ingrédient pharmaceutique actif,
appropriately evaluated for safety and are évaluées de manière appropriée et
intentionally included in a drug delivery incluses intentionnellement dans un
system. système d'administration de
médicaments.
6.1.6 Pyrogen Susceptibility: Excipients are 6.1.6 Pyrogène susceptible: les excipients
considered to be Pyrogen-susceptible if: sont considérés comme pyrogène si :
The excipient is manufactured with water L'excipient est fabriqué avec de l'eau
as solvent in the last synthesis step. comme solvant dans la dernière étape de
If it is extracted from material of plant or synthèse.
animal origin. Si elle est extraite d'un matériau
d'origine végétale ou animale.
If a history of pyrogenicity is Known. Si l’historique de pyrogénicité est connu
6.2 ABBREVIATIONS 6.2 ABREVIATIONS
LAL : Limulus Amebocyte LAL: Limilus d’Amebocyte lysate
Lysate CSE: Contrôle de l'Endotoxine Standard
CSE : Control Standard LRW: Eau LAL
Endotoxin : sensibilité du lysat
LRW : LAL Reagent Water UE: Unité d'Endotoxine
 : Lysate Sensitivity Mg: milli gramme
EU : Endotoxine Unit MVD: Dilution maximale valide
mg : milli gram E.L. : Limite d'endotoxine
MVD : Maximum Valid NWC: contrôle négatif de l'eau
Dilution PWC: contrôle positif de l'eau
E.L. : Endotoxin Limit NPC: Contrôle Négatif du Produit
NWC : Negative Water PPC: Contrôle Positif du Produit
Control CoA: Certificat d'Analyse
PWC : Positive Water TD: Dilution
Control API: Ingrédient Pharmaceutique Actif
NPC : Negative Product FDF: Produit Fini
Control DHS: Stérilisateur à chaleur sèche
PPC : Positive Product WFI: Eau pour préparation Injectable
Control
CoA : Certificate of
analysis
TD : Test Dilution
API :Active Pharmaceutical
Ingredient
FDF : Finished Dosage
Form
DHS : Dry Heat Sterilizer
WFI : Water for Injection
7.0 7.0 ANNEXURES : 7.0 7.0 ANNEXES :
7.1 Annexure – 1 : Microbiological BET 7.1 Annexe - 1 : Log book gestion de stock
reagent inward cum stock maintenance des réactifs du test d’endotoxine (FRM /
(FRM/QC/MB/247,v.1) QC / MB / 247, v.1)
7.2 Annexure – 2: Log book of bacterial 7.2 Annexe - 2 : log book du test
endotoxin test (LAL TEST ). d'endotoxine bactérienne (LAL TEST)
7.3 (FRM/QC/MB/248, v.1) (FRM / QC / MB / 248, v.1)
Annexure – 3 : Confirmation of labeled 7.3 Annexe - 3 : Confirmation de la
7.4 lysate sensitivity control curve sensibilité du lysée marquée sur
(FRM/QC/MB/249, v.1). l’étiquette (FRM / QC / MB / 249, v.1).
Annexure – 4 : Bacterial endotoxin test 7.4 Annexe - 4 : Fiche de paillasse de test
report (LAL test) (FRM/QC/MB/250, v.1). d'endotoxine bactérienne (LAL test)
(FRM / QC / MB / 250, v.1).
8.0 PROCEDURE: 8.0 PROCÉDURE :

8.1 Depyrogenation of Glassware and 8.1 Depyrogénéisation de la verrerie et
Apparatus: des appareils :
8.1.1 Depyrogenate all glassware and other heat- 8.1.1 Dépyrogénéiser toute la verrerie et
stable apparatus in a hot-air oven or Dry autres appareils thermostables dans un
heat Sterilizer using a validated process. four à air chaud ou un stérilisateur à
chaleur sèche à l'aide d'un procédé
validé.
8.1.2 If applying plastic apparatus, such pipette 8.1.2 Si vous appliquez des appareils en
tips for automatic pipettes, use pipettes tips plastique tels que les embouts pour
certified to be free of detectable endotoxin pipettes automatiques, utiliser des
for the test embouts certifiés exempt d'endotoxines
détectables pour le test.
8.2 Preparation and Usage of Endotoxin 8.2 Préparation et utilisation de la

Standard Stock Solution : solution stock d'endotoxine
Standard :
8.2.1 Control Standard Endotoxin received from 8.2.1 L'endotoxine standard reçue du fabricant
LAL reagent manufacturer can be used for du réactif LAL peut être utilisé pour les
routine use. tests de rorutines
8.2.2 Certificate of Analysis giving the details of 8.2.2 Le certificat d’analyse contenant les
testing of CSE against the reference détails de l’essai du CSE par rapport à la
standard is provided by the manufacturer. norme de référence est fourni par le
In such case certification against USP or fabricant. Dans ce cas, une certification
BP reference standard before use is not par rapport à la norme de référence USP
necessary. ou BP avant utilisation n'est pas
nécessaire.
8.2.3 On receipt of CSE from supplier, attach a 8.2.3 à la réception du CSE du fournisseur,
Reagent Receipt Label as per format no. joindre une étiquette de réception de
FRM/QC/MB/247,v.1. Make an entry in réactif selon le format no. FRM / QC /
the Microbiological BET reagent inward MB / 247, v.1. Effectuer une entrée dans
cum stock maintenance given in Annexure– l'annexe I (FRM / QC / MB / 247, v.1).
I Utiliser l’eau LAL pour la
(FRM/QC/MB/247, v.1) Use LAL Reagent reconstitution du flacon CSE.
Water for the reconstitution of CSE vial. Reportez-vous au certificat fourni par le
Refer the CoA provided by the fabricant pour obtenir des informations
manufacturer for information on sur les volumes de reconstitution, le
reconstitution volumes, vortex time and temps d’agitation, la période et les
storage period and conditions. Write date of conditions de stockage. Mentionner la
reconstitution on reconstituted vial. date de reconstitution sur le flacon
reconstitué
8.2.4 Store the reconstituted vial of CSE, as per 8.2.4 Stocker le flacon reconstitué du CSE,
the instruction given by CSE manufacturer. selon les instructions données par le
fabricant.
8.3 Usage of Limulus Amebocyte Lysate 8.3 Utilisation du Lysat Amebocytaire
(LAL) Limulus (LAL)
8.3.1 On receipt of LAL from supplier, attach a 8.3.1 A la réception de réactif LAL (Lysat)
Reagent Receipt Label. Make an entry in joindre une étiquette de réception de
the Receipt log of LAL as given in réactif. Effectuez une entrée dans
Annexure–I (FRM/QC/MB/247, v.1). l'Annexe-I (FRM / QC / MB / 247, v.1).
8.3.2 Remove aluminium seal of the lysate vial 8.3.2 Retirer le joint en aluminium du flacon
without opening rubber stopper. de lysat sans ouvrir le bouchon en
caoutchouc.
8.3.3 Carefully remove the stopper. Keep the 8.3.3 Retirer avec précaution le bouchon.
stopper in a clean surface without touching Gardez le bouchon sur une surface
the inner portion of stopper propre sans toucher la partie interne du
bouchon.
8.3.4 Rehydrate the lyophilized powder using 8.3.4 Réhydrater la poudre lyophilisée en
required quantity of LRW with the help of utilisant la quantité requise d’eau LAL à
depyrogenated pipette. Refer the l'aide d’embouts apyrogènes. Consulter
manufacturers’ instructions for information les instructions du fabricant pour obtenir
on reconstitution volumes. des informations sur les volumes de
reconstitution.
8.3.5 Stopper the reconstituted vial. Do not 8.3.5 Refermer le flacon reconstitué. Ne pas
shake. Mix gently without formation of any secouer. Mélanger doucement sans
air bubbles. DO NOT VORTEX. formation de bulles d'air. NE PAS
VORTEXER.
8.3.6 Store the reconstituted LAL reagent vial at 8.3.6 Conserver le flacon de réactif LAL
2 to 8 deg. C. Use the content of vial on the reconstitué entre 2-8 °C. Utiliser le
same day. If not possible then store the vial contenu du flacon le même jour. Si cela
in deep freeze below-20 ° C up to 4 weeks n’est pas possible, conserver le flacon
.Thaw the vial only once. Write date of dans un congélateur inférieur à -20 ° C
reconstitution on reconstituted vial. jusqu'à 4 semaines.
N'utiliser le flacon qu'une seule fois.
Mentionner la date de reconstitution sur
le flacon
8.4 General procedure for LAL test 8.4 Procédure générale pour le test LAL
8.4.1 In LAL test equal volumes of sample and 8.4.1 Dans le test LAL, des volumes égaux
LAL reagent are added in a depyrogenated d'échantillon et du réactif LAL sont
10 X 75 mm borosilicate glass assay tube ajoutés dans un tube de dosage de verre
de borosilicate de 10 X 75 mm
dépyrogéné
8.4.2 Incubate assay tube in a non-vibrating 8.4.2 Incuber le tube de dosage dans un bain
heating bath maintained at 37±1ºC for 60 ± marie/ plaque chauffante non vibrante
2 minutes. Monitor time and temperature maintenue à 37 ± 1ºC pendant 60 ± 2
accurately minutes. Surveiller le temps et la
température avec précision
8.4.3 On completion of incubation period, invert 8.4.3 À la fin de la période d'incubation,
the tube 180º in one smooth motion. inverser le tube d’un angle de 180º dans
Formation of a firm gel, which maintains un mouvement lisse. La formation d'un
its integrity on inversion indicates a gel ferme, qui maintient son intégrité à
positive result. A gel which does not l'inversion, indique un résultat positif.
maintain its integrity on inversion or no gel Un gel qui ne maintient pas son intégrité
formation indicates a negative result. lors
De l'inversion ou pas de formation de
gel indique un résultat négatif.
8.4.4 Run a Negative Water Control(NWC), 8.4.4 Prévoir un contrôle négatif de l'eau
Positive Water Control(PWC) for each set. (NWC) et un contrôle positif de l'eau
Run a Positive Product Control (PPC) for (PWC) pour chaque test. Prévoir un
every test in a set. contrôle de produit positif (PPC) pour
chaque test .
8.5 Procedure for Test of Confirmation of 8.5 Procédure de test de confirmation de
Labelled LAL Reagent Sensitivity la sensibilité du réactif LAL marqué
sur l’étiquette.
8.5.1 Carry out the test for confirmation of lysate 8.5.1 Effectuer le test pour la confirmation de
sensitivity when a new batch of LAL la sensibilité du lysat lorsqu'un nouveau
reagent is used or when there is any change lot de réactif LAL est reçu ou lorsqu'il
in the experimental conditions that may existe un changement dans les
affect the conditions expérimentales qui peuvent
outcome of the test including qualification affecter le résultat du test, y compris la
of new analyst for performing BET. qualification d'un nouvel analyste pour
l'exécution de du test d’endotoxine
8.5.2 Prepare a series of two-fold dilutions of the 8.5.2 Préparer une série de dilutions en
Control Standard Endotoxin in LAL duplicata de CSE avec l’eau LAL pour
reagent Water to give concentrations of 2, donner des concentrations de 2 , 0,5,
, 0.5, and 0.25, where,  is the labelled 1 et 0.25, où,  est la sensibilité du
lysate sensitivity. Refer Example 1 for lysat marqué sur l’étiquette. Se Reporter
preparing the standard CSE dilutions. à l'Exemple 1 pour préparer les dilutions
CSE standard
Example 1 Exemple 1
Assuming the lysate sensitivity () is 0.125 En supposant que la sensibilité du lysat
EU/ml. () est de 0,125 UE / ml. Donc,
Therefore, 2 = 0.25 EU/ml
2 = 0.25 EU/ml  = 0.125 EU/ml
 = 0.125 EU/ml 0.5  = 0.0625 EU/ml
0.5  = 0.0625 EU/m 0.25  = 0.0312 EU/ml
0.25  = 0.0312 EU/ml
Reconstitute the CSE vial as per CoA. Reconstituer le flacon CSE selon CoA.
Vortex as per manufacture instruction time. Vortexer selon le temps d’ instruction du
Dilute the CSE with LRW to obtain a fabricant. Diluer le CSE avec l’eau LAL
CSE potency of 1 EU/ml. Use the pour obtenir une concentration de 1 UE /
following two formulae for performing this ml. Utiliser les deux formules suivantes
dilution: pour effectuer cette dilution:
Quantité de stock = Concentration
Amount of stock = required requise (R) X Volume total (T)
Concentration (R) X Total Volume (T) Concentration de stock donnée dans le
Given Stock Concentration COA(G)
(G)
2.Amount of diluent = Total volume – 2. Quantité de diluant = Volume total –
Amount of Stock taux du Stock
Assuming G = 20 EU/ml En supposant G = 20 EU / ml

T = 2.0 ml T = 2,0 ml
R = 1.0 EU/ml R = 1,0 UE / ml
Amount of stock = 1 EU/ml X 2 ml
20 EU/ml Quantité de stock = 1 EU/ml X 2 ml
Amount of stock = 0.1 ml 20 EU/ml
Quantité de stock = 0,1 ml
Amount of diluent = Total Volume (T) – Quantité de diluant = Volume total (T) -
Amount of stock Quantité de stock
Amount of diluent = 2.0 ml Quantité de diluant = 2,0 ml - 0,1 ml
– 0.1ml Quantité de diluant = 1,9 ml
Amount of diluent = 1.9 ml Ainsi, aliquotez 0,1 ml de CSE et
Thus aliquot 0.1 ml of CSE and add 1.9 ml ajoutez 1,9 ml de LRW pour obtenir une
LRW to obtain a potency of 1 EU/ml. puissance de 1 UE / ml. Suivez le
Follow table no. 1 for further dilutions: tableau no. 1 pour d'autres dilutions:
Table no. 1 Tableau no. 1
Amou Concentrat N° Quanti
Tub Quantité Concentrat
nt of Amount of ion of Tu té de
es du CSE ion du CSE
LRW CSE (ml) CSE be LRW
No. (ml) (EU/ml)
(ml) (EU/ml) s . (ml)
1 1.0 ml of 0.5 EU/ml 1 1.0 ml of 0.5 EU/ml
1.0 ml 1.0 ml
1EU/ml. 4 1EU/ml. 4
2 1.0 ml of 0.25 2 1.0 ml of 0.25
1.0 ml 1.0 ml
tube 1 EU/ml 2 tube 1 EU/ml 2
3 1.0 ml of 0.125 3 1.0 ml of 0.125
1.0 ml 1.0 ml
tube 2 EU/ml  tube 2 EU/ml 
4 0.0625 4 0.0625
1.0 ml of 1.0 ml of
1.0 ml EU/ml 1.0 ml EU/ml
tube 3 tube 3
0.5 0.5
5 0.03125 5 0.03125
1.0 ml of 1.0 ml of
1.0 ml EU/ml 1.0 ml EU/ml
tube 4 tube 4
0.25 0.25
Where  is the sensitivity of lysate. Où  est la sensibilité du lysat.
Perform the test on the four standard 8.5.3 Effectuer le test sur les quatre
concentrations in quadruplicate and include concentrations standard en quadruplé on
negative controls. Follow the addition incluent les contrôles négatifs. Suivez la
procedure as given in table no.2 procédure d'addition indiquée dans le
tableau n ° 2
Table No. 2 Tableau No. 2

Sam CSE LRW Lysate N Echa dilution LRW Lysa N°.
ple dilution o. of ntill utilisée te du
used repli on du CSE repliq
cate uats
s 2 - 100 4
2 - 4 of 2
of 2  100 l - 100 4
 of - 4 of  l
 0.5 100 l - 100 4
0.5 - 4 of 0.5 l
of 0.5 0.25 100 l - 100 4
0.25 100 - 4  of l
 of 0.25 0.25
NW - 100 4 NW - 100 100 4
C C l l
Where  is the sensitivity of lysate Où  est la sensibilité du lysat
8.5.4 Mix the tubes gently and incubate at 8.5.4 Mélanger doucement les tubes et
37±1ºC for 60 ± 2 minutes. The time and incuber à 37 ± 1ºC pendant 60 ± 2
temperature has to be accurately monitored minutes. Le temps et la température
doivent être surveillés avec précision
8.5.5 Look for the formation of a firm gel clot on 8.5.5 Rechercher la formation d'un caillot de
inversion of the tubes, after the incubation gel ferme lors de l'inversion des tubes,
period is over. une fois la période d'incubation terminée
8.5.6 The test is not valid if the following is not 8.5.6 Le test n'est pas valide si ce qui suit n'est
met. pas respecté.
I)All the replicates of ‘negative’ are I) Toutes les dilutions 'négatives' sont
negative. négatives.
II) All the replicates of ‘0.25’ are II) Toutes les dilutions de '0.25' sont
negative. négatives.
8.5.7 The endpoint is the last positive test in the 8.5.7 Le critère d'évaluation est le dernier test
series of decreasing concentrations of positif de la série de concentrations
endotoxin. Calculate the mean value of the décroissantes d'endotoxines. Calculez la
logarithms of the endpoint concentration valeur moyenne des logarithmes de la
and then the antilogarithm of the mean concentration du point final, puis
value using the following equation: l'antilogarithme de la valeur moyenne, à
l'aide de l'équation suivante:
Geometric Mean Endpoint Concentration = Concentration moyenne de point final
antilog (e / f) géométrique = antilog (e / f)
Where, Où,
e = Sum of the log endpoint e = Somme des logarithmes du dernier
concentrations of the dilution series used. test positif.
F = Nombre de répétitions.
F = Number of replicates.
8.5.8 The geometric mean endpoint 8.5.8 La concentration géométrique de la

concentration is confirmed if the measured concentration finale est confirmée si la
sensitivity of the LAL Reagent (in EU/ml) sensibilité mesurée du réactif LAL (en
is not less than 0.5 and not more than 2. UE / ml) n'est pas inférieure à 0,5 et
Use this lot of lysate for routine analysis. pas plus de 2. Utiliser ce lot de lysat
pour l'analyse de routine.
8.5.9 Use labelled LAL sensitivity claimed by 8.5.9 Utiliser la sensibilité du lysat (LAL)
vendor for all analytical purpose, revendiquée par le fournisseur pour
Irrespective of the value obtained during toute fin analytiques indépendamment
the qualification. de la valeur obtenue lors de la
Report all observation, results in format no. qualification
FRM/QC/MB/249,v.1. Reporter toutes les observations, les
résultats au format no. FRM / QC / MB /
249, v.1.
8.6 Endotoxin Limit and its Determination 8.6 Limite d'endotoxine et sa
détermination
8.6.1 The endotoxin limit for parenteral drugs is 8.6.1 La limite d'endotoxine pour les
specified in individual monographs in units médicaments parentéraux est spécifique
such as EU/ml, EU/mg. pour chaque produit monographié en
unités telles que EU / ml, EU / mg.
8.6.2 If, the Endotoxin Limit is not mentioned in 8.6.2 Si, la limite d'endotoxine n'est pas
the monograph, then it could be calculated mentionnée dans la monographie, elle
using the formula, pourrait être calculée selon la formule,
Endotoxin limit = K/M Where,
K = is the threshold human pyrogenic dose Limite d'endotoxine = K / M
of endotoxin per kg of body weight. Où,
It is 5.0 EU/Kg for parenteral drugs excep K = est le seuil de la dose pyrogène
for those Administered Intrathecally which humaine de l'endotoxine par kg du poids
has the value of 0.2 EU / Kg. corporelle
Average Adult body weight is considered
as 70 Kg. Il s'agit de 5,0 EU / Kg pour les
M = Maximum Human Dose / Kg of body médicaments parentéraux, à l'exception
weight de ceux administrés par voie intrathécal
that would be administered in a single one qui a une valeur de 0,2 UE / Kg.
hour Le poids corporel moyen est considéré
period, whichever is larger. comme 70kg.
If the paediatric dose / Kg is higher than the M = dose maximale humaine / Kg de
adult poids corporel qui serait administré en
dose then use that particular dose in the une seule heure.
formula. Si la dose pédiatrique / Kg est
supérieure à la dose adulte, utiliser cette
dose particulière dans la formule.
8.7 Calculation of Maximum Valid Dilution 8.7 Calcul de la dilution maximale valide
(MVD) (MVD)
8.7.1 Common interference to LAL include, 8.7.1 Les interférences fréquentes avec le
suboptimal pH, endotoxin aggregation or lysat (LAL) incluent le pH, l'agrégation
adsorption, container effects, unbalanced ou l'adsorption des endotoxines, les
cation concentration, enzyme or protein effets des récipients, la concentration de
modification, and non-specific LAL cations non équilibrée, la modification
activation (i.e. glucans etc.). Perform de l'enzyme ou de la protéine et
dilution to resolve such interferences. l'activation LAL non spécifique (c'est-à-
dire des glucanes, etc.). Effectuer une
dilution pour résoudre de telles
interférences.
8.7.2 Maximum Valid Dilution (MVD) is the 8.7.2 La dilution maximum valide (MVD) est
maximum acceptable dilution of a product la dilution maximale acceptable d'un
for the BET resulting in detection limits not produit pour les tests d’endotoxines, ce
exceeding the product specific Endotoxin qui entraîne des limites de détection ne
Limit. dépassant pas la limite d'endotoxine
spécifique du produit.
8.7.3 Calculate MVD using the following 8.7.3 Calculer MVD en utilisant la formule
formula: suivante :
MVD = (Endotoxin limit × Concentration MVD = (Limite d'endotoxine ×
of sample solution) / () Concentration de la solution
Where, d'échantillon) / ()
Endotoxin limit is given in individual Où,
monograph, if not given, then can be • La limite d'endotoxine est donnée dans
calculated by the formula discussed in une monographie individuelle, si elle
8.6.2. n'est pas donnée, elle peut être calculée
Concentration of sample is the labelled selon la formule décrite dans le chapitre
potency in case of FDF, and prepared 8.6.2
concentration in mg per ml case of Raw • La concentration de l'échantillon est
Material & API. celle mentionnée sur l’étiquette dans le
 Is the labelled lysate sensitivity cas du produit fini et la concentration
préparée en mg/ml dans le cas de la
matière première
•  La sensibilité aux lysats marqués.
8.7.4 If the endotoxin limit concentration is 8.7.4 Si la limite en endotoxine est spécifiée
specified in the individual monograph in dans la monographie individuelle en
terms of volume (in EU per ml), divide the termes de volume (dans l'UE par ml),
limit by, which to obtain the MVD factor. diviser la limite par, pour obtenir le
facteur MVD.
8.7.5 Where the endotoxin limit concentration is 8.7.5 Lorsque la limite en endotoxine est
specified in terms of weight or Units of spécifiée en termes de poids ou d'unités
active drug (in EU per mg or in EU per de médicament actif (en UE/ mg ou en
Unit), multiply the limit by the UE/unité), multiplier la limite par la
concentration (in mg per mL or in Units per concentration (en mg/ml ou en
mL) of the drug in the solution. unités/ml) du médicament dans la
solution.
8.7.6
Le produit est testée en divisent la
multiplication (limite en endotoxine *la
concentration) par, pour obtenir le
facteur MVD
8.7.6 Tested and divide the product of the 8.7.7 Ne pas dépasser le facteur MVD à tout
multiplication by, to obtain the MVD moment de l'analyse.
factor.
8.7.7 Do not exceed the MVD factor at any time 8.7.8 Après le calcule du facteur MVD
during the analysis.
8.7.8 After MVD factor 8.7.9 Si le MVD calculé n'est pas un chiffre
entier, arrondisser le chiffre au côté
inférieur. par exemple. Arrondisser
MVD de 542.69 à 542 mais pas 543.
8.7.9 If the calculated MVD is not a whole Si le MVD calculé est un chiffre impair,
figure then round off the figure to the lower arrondisser ce chiffre à une valeure
side. e.g. Round off MVD of 542.69 to 542 paire, par exemple : Arrondir MVD de
8.7.10 but Not 543. 243.69 à 243. En outre, pour des
If the calculated MVD is an odd figure dilutions faciles et pour une aptitude à
then round off the figure to an even figure l'analyse, arrondir à 242 ou 240 est
e.g. round off MVD of 243.69 to 243. également acceptable. Ce
Further for easy dilutions and for analytical arrondissement offre des chances
suitability rounding off to 242 or 240 is minimales d'erreur analytique.
also acceptable. This rounding off provides
minimum chances for analytical error.
8.8 Preparation of Sample of FDF, API and 8.8 Préparation de l’échantillon de
Excipients. produit fini, matière premières et
Excipient.
8.8.1 Prepare sample solutions by dissolving or 8.8.1 Préparer des solutions d'échantillons à
diluting drugs using LAL Reagent Water. examiner en les diluant avec de l'eau
LAL
8.8.2 Based upon the characteristics, some 8.8.2 Sur la base des caractéristiques,
substances or preparations are dissolved or certaines substances ou préparations
diluted, sont dissoutes ou diluées, dans d'autres
in other aqueous solutions like Methanol, solutions aqueuses comme le méthanol,
Ethanol, l'éthanol et le DMSO, etc
and DMSO etc.
8.8.3 If necessary, adjust the pH of the solution 8.8.3 Si nécessaire, ajuster le pH de la
(or solution (ou la dilution de celle-ci) à
dilution thereof) to be examined, so that examiner, de sorte que le pH du mélange
the pH of the mixture of the LAL Reagent du réactif LAL et de l'échantillon se
and sample falls situe dans la marge de pH spécifiée par
within the pH range specified by the LAL le fabricant du réactif LAL.
Reagent Typiquement, cette marge de pH est de
manufacturer. Typically this pH range is 6,0 à 8,0.
6.0 to 8.0.
8.8.4 The pH may be adjusted using an acid, 8.8.4 Le pH peut être ajusté en utilisant un
base, or suitable buffer as recommended by acide, une base ou un tampon approprié,
the LAL Reagent manufacturer. comme recommandé par le fabricant du
réactif LAL.
8.8.5 Prepare dilute acid and base from 8.8.5 Préparer l'acide dilué et la base à partir
concentrates or solids by dissolving directly de concentrés ou de solides en se
in LAL reagent water in depyrogenated dissolvant directement dans de l'eau
containers. Buffers used for the test are LAL dans des récipients
checked for absence of detectable dépyrogéniésés. Les tampons utilisés
endotoxin and interfering factors. pour le test sont vérifiés pour l'absence
d'endotoxines détectables et de facteurs
interférant.
8.8.6 Use of a more sensitive lysate permits a 8.8.6 L'utilisation d'un lysat plus sensible
greater permet une plus grande dilution de
dilution of the sample to be examined and l'échantillon à examiner, ce qui peut
this may contribuer à éliminer les interférences.
contribute to the elimination of interference
8.8.7 Use Endotoxin specific buffers for LAL 8.8.7 Utiliser des tampons spécifiques pour la
reconstitution if enhancement of LAL- reconstitution de LAL (lysat) si l'on
endotoxin reaction is suspected. soupçonne l'amélioration de la réaction
endotoxine- LAL.
8.9 Analytical Method Validation 8.9 Validation de la méthode analytique
Perform Analytical Method Validation on Effectuer la validation de la méthode
three batches / lots for every FDF. analytique sur trois lots / lots pour
Perform Analytical Method Validation on chaque produit fini,Matière première,
one batch of API, excipients and primary excipients et matériau d'emballage
packing material before proceeding for primaire avant de procéder à l'analyse
routine BET analysis. d’endotoxine de routine.
8.9.1 Repeat the validation, 8.9.1 Répéter la validation,
1) On three batches / lots of FDF and 1) Sur trois lots / lots de produit fini et
one batch for API, excipients and primary un lot pour matière première, les
packing material if there is any change in excipients et le matériel d'emballage
manufacturing process of primaire s'il y a un changement dans le
Product. processus de fabrication de
2) ) On three batches / lots of FDF and one Produit.
batch for API, excipients and primary 2) Sur trois lots / lots de produit fini et
packing material if there is any change in un lot pour matière première, les
composition or formulation.. excipients et le matériel d'emballage
3) ) On three batches / lots of FDF and one primaire s'il y a un changement de
batch for API, excipients and primary composition ou de formulation.
packing material if there is change in 3) Sur trois lots / lots de produit fini et
analytical method. However this un lot de matière première, d'excipients
shall be based upon proper risk et de matériel d'emballage primaire s'il y
assessment. a un changement dans la méthode
4) On single batch if there is change in d'analyse. Cependant ceci doit être basé
LAL reagent source. sur une évaluation des risques
appropriée.
4) Sur un seul lot s'il y a changement de
fournisseurs de réactif LAL.
8.9.2 Analytical Method Validation is performed 8.9.2 La validation analytique se fait en deux
in two steps: étapes :
I) Preliminary Screening for determination I) Examen préliminaire pour la
II) Inhibition / Enhancement test détermination
II) Test d'inhibition / amélioration
8.9.3 Refer individual Analytical Method 8.9.3 Se référer aux protocoles individuels de
Validation Protocols for more details on validation analytique pour plus de
Preliminary Screening and Inhibition / détails sur l’examen préliminaire pour la
Enhancement test. détermination et d'inhibition /
amélioration.
8.10 8.10 Gel Clot Limit Test 8.10 Test de gel clot :
8.10.1 Perform routine analysis by Gel-Clot Limit 8.10.1 Effectuer une analyse de routine de
Test, once the analytical method is recherche des endotoxines par test de gel
validated. clot, une fois la méthode analytique est
validée.
8.10.2 Perform routine BET for API, FDF, WFI, 8.10.2 Effectuer une analyse de routine de
Excipients as per their respective Control recherches des endotoxines par test de
Procedure gel clot pour matière première, produit
fini, eau pour préparation injectable et
Excipients selon leur procédure de
contrôle respective.
8.10.3 Analyse the sample test as per the scheme 8.10.3 Analyser l'échantillon de test selon le
shown in Table no.3 schéma figurant dans le tableau no. 3
Table – 3 Tableau 3
Tube Solut L 4( Pr Ly No. des LR 4 Pro Ly N
No. ion R CS od sat of T cri W (C duc sat o.
descr W E) uc e Re u pti SE t at e d
iptio in in t in plic b on ) M e
n at ate e de VD R
l M s N la /2 e
V o. sol pl
D/ uti ic
2 on at
in s
Co -
Nega - 1, ntr 50 50 10 2
1,2 tive 50 50 10 2 2 ole 0
prod 0 neg
uct atif
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(NP dui
C) t(N
Posit PC
3,4 ive - 50 50 10 2 )
Prod 0
uct 3, Co - 50 50 10 2
contr 4 ntr 0
ol ole
(PPC pos
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Posit du
5,6 ive 50 50 - 10 2 pro
wate 0 dui
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contr (PP
ol C)
(PW Co
C) 5, ntr 50 50 - 10 2
Nega 6 ole 0
7,8 tive 10 - - 10 2 pos
wate 0 0 itif
r de
contr l’e
ol au
(NW (P
C) W
C)
Co
7, ntr 10 - - 10 2
8 ole 0 0
neg
atif
de
l’e
au
(N
W
C)
8.10.4 Take 8 depyrogenated assay tubes and label 8.10.4 Prenez 8 tubes à essai dépyrogéniésés,
the tubes by numbering and arrange in étiquetez-les par numérotation et
stand one opposite to each other. i.e. 1 & 2 disposez-les l'un en face de l'autre. c'est-
for NPC, 3 & 4 for PPC, 5 & 6 for PWC, 7 à-dire 1 et 2 pour NPC, 3 et 4 pour PPC,
& 8 for NWC 5 et 6 pour PWC, 7 et 8 pour NWC
8.10.5 Add 50l l of LRW in NPC and PWC, and 8.10.5 Ajouter 50 l de l’eau LAL en NPC et
100 l l in NWC. Immediately add 50l l PWC, et 100 l en NWC. Ajoutez
of product sample, which is diluted at immédiatement 50 l d'échantillon de
MVD/2 in a NPC and PPC, and then add produit, qui est dilué à MVD / 2 dans
50l l of CSE that is diluted to 4 in a PPC NPC et PPC, puis ajoutez 50l de CSE
and PWC. qui est dilué à 4 dans un PPC et PWC.
8.10.6 Finally add 100l l of Lysate in all tubes 8.10.6 Enfin, ajouter 100l de Lysate dans tous
and next, mix the assay tubes by hand and les tubes et ensuite mélanger les tubes
incubate in heating block/ water bath where de dosage à la main et incuber dans un
the temperature is maintained at 37°C ± 1C bain marie / plaque chauffante, où la
for 60 ± 2 minutes température est maintenue à 37 ° C ± 1C
pendant 60 ± 2 minutes.
.
8.11 OBSERVATION : 8.11 OBSERVATION:
After the one hour incubation period, the Après la période d'incubation d'une
positive and negative results are recorded. heure, les résultats positifs et négatifs
Record the results of BET in the format no sont enregistrés.
FRM/QC/MB/250,v.1 and make the sample Enregistrer les résultats de test
entry in logbook for BET d’endotoxine dans le format FRM / QC /
(FRM/QC/MB/248, v.1) MB / 250, v.1 et faites l'enregistrement
Note: All glassware used for the LAL test des échantillons pour le test des
were depyrogenated at 250°C for 30 endotoxines dans le format (FRM / QC /
minutes. MB / 248, v.1) Remarque : Toutes la
verrerie utilisées pour le test LAL est
dépyrogéniésés à 250 ° C pendant 30
minutes.
8.12 Interpretation of Result : 8.12 Interprétation du résultat:
8.12.1 Each tube in the gel clot method is 8.12.1 Chaque tube dans le test de gel clot est
interpreted as either positive or negative, interprété comme positif ou négatif, un
Positive test indicates the formation of firm test positif indique la formation d'un gel
gel capable of maintaining its integrity ferme capable de maintenir son intégrité
when the test tube is inverted 180°. lorsque le tube à essai est inversé à 180
°.
8.12.2 1,2 negative test is characterized by the 8.12.2 Le test 1,2 négatif est caractérisé par
absence of gel or by the formation of a l'absence de gel ou par la formation
viscous mass, which does not hold when d'une masse visqueuse, qui ne se
the tube is inverted at 180°. maintient pas lorsque le tube est inversé
à 180 °.
8.12.3 The test is not valid unless both replicates 8.12.3 Le test n'est valable que si les deux
of the two positive control solutions 3,4 and répliques des deux solutions de contrôle
5,6 are positive and those of the negative positif 3,4 et 5,6 sont positives et celles
control solution 7,8 are negative. de la solution de contrôle négative 7,8
sont négatives.
8.12.4 The preparation being examined complies 8.12.4 La préparation examinée est conforme
with the test when a negative result is found au test lorsqu'un résultat négatif est
for both replicates of solution 1,2 trouvé pour les deux répliques de
solution 1,2.
8.12.5 When a positive result is found for both 8.12.5 Lorsqu'un résultat positif est trouvé pour
replicates of solution 1,2, it does not les deux répliques de la solution 1,2, il
comply with the test n'est pas conforme.
8.12.6 Repeat the test if a positive result is found 8.12.6 Répéter le test si un résultat positif est
for one replicate of solution 1, 2 and a trouvé pour une réplique de solution 1, 2
negative result is found for the other. The et un résultat négatif est trouvé pour
preparation being examined complies with l'autre.
the test if a negative result is found for both La préparation examinée est conforme
replicates of solution 1,2 in the repeat test si un résultat négatif est trouvé pour les
deux répliques de solution 1,2 dans le
test de répétition.
8.13 Failure Investigation : 8.13 Investigation lors de l’échec du test

d’endotoxine :
8.13.1 When positive result observed on both the 8.13.1 Lorsqu'un résultat positif est observé sur
tubes of test preparation, investigate the les deux tubes de préparation du test
cause of its failure by checking following (échantillon), recherchez la cause de
parameters. l’échec du test d’endotoxine en vérifiant
les paramètres suivants :
8.13.2 Check product dilution, CSE dilution and 8.13.2 Vérifier la dilution du produit, la
lysate dilution dilution du CSE et la dilution du lysat.
8.13.3 Whether Glassware’s are cleaned and 8.13.3 Vérifier Si la verrerie est nettoyée et
dehydrogenated as per standard Operating dépyroginiesé conformément à la
procedure. procédure opératoire standard.
8.13.4 Check sensitivity report of Lysate lot and 8.13.4 Vérifier le rapport (résultat sur fiche de
matched CSE paillasse) de sensibilité du lot de Lysat
et du CSE correspondant.
8.13.5 Check Heating block/water bath 8.13.5 Vérifier la température et l'étalonnage
temperature and calibration. du bain marie / plaque chauffante
8.13.6 Check any source of contamination occur 8.13.6 Vérifiez toute source de contamination
due to microbiologist. due à un microbiologiste analyste.
9.0 CHANGES FROM LAST EDITION : 9.0 CHANGEMENTS DE LA DERNIÈRE

ÉDITION:
Ed.No. /No Ed Date of Revision / Modification Reason for modification Done by/ Fait par
Date de révision / Raison de modification
1 New/Nouveau SOP New/ SOP No : DAOUD NOUR

Nouveau SOP/QC/MB/026 is
SOP replaced by current SOP
EL ISLAM
No :SOP/QC/MB/125
for harmonisation as per
LNCPP and all details
are mentioned in the
change control
DCR/15/18

124.bacterial Endotoxin Test

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REVIEWED BY/REVISE PAR MICROBIOLOGY HEAD RESPONSIBLE / DATE :

REVIEWED BY/REVISE PAR : HEAD QUALITY CONTROL /

APPROVED BY/APPROVER QUALITY ASSURANCE MANAGER/ DATE :

9. CHANGES FROM LAST EDITION:

1.0 IMPLEMENTATION GIDELINE / 1.0 MISE EN OEUVRE GIDELINE /

1.2 Ph.Eur.Appendix 2.6.14 Bacterial 1.2 Ph.Eur. Annexe 2.6.14 Endotoxines

2.0 PURPOSE & SCOPE: 2.0 OBJET ET DOMAINE

4.7 Materials and Methods : 4.7 Matériaux et méthodes:

8.0 PROCEDURE: 8.0 PROCÉDURE :

8.2 Preparation and Usage of Endotoxin 8.2 Préparation et utilisation de la

Assuming G = 20 EU/ml En supposant G = 20 EU / ml

Table No. 2 Tableau No. 2

8.5.8 The geometric mean endpoint 8.5.8 La concentration géométrique de la

8.13 Failure Investigation : 8.13 Investigation lors de l’échec du test

9.0 CHANGES FROM LAST EDITION : 9.0 CHANGEMENTS DE LA DERNIÈRE

1 New/Nouveau SOP New/ SOP No : DAOUD NOUR

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