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Alexandre.Escargueil@inserm.fr
La biologie moléculaire est l’étude des mécanismes au niveau moléculaire, qui permettent la
constance des gènes et leur variation à travers les générations et entre les individus, et aussi leur
expression régulée.
Il existe des dérivées des deux modèles de bases : cytosine, thymine, uracile pour la pyrimidine et
adénine et guanine pour la purine. Les substitutions sur différents carbones permettent de créer des
liaisons hydrogène entre différentes bases.
Bases puriques modifiées en analogues
La modification des bases par méthylation intervient dans la régulation de certains gènes. Chez les
bactéries, elle caractérise l’ADN bactérien (différencie le sien avec celui d’un virus par exemple).
Cette modification ne perturbe par la structure de la double hélice.
D’autres bases modifiées sont utilisées : analogues synthétiques par exemple, avec un X qui peut
prendre différentes formes halogénées.
On retrouve des bases dans notre alimentation (caféine, théine) qui jouent des rôles antagonistes. La
théobromine se trouve dans le chocolat.
B. Les nucléosides
Condensation d’une des cinq bases avec un pentose (un ribose ou un desoxyribose cyclique). Ils sont
sous forme furanique. Différence de OH sur le carbone 2. Ils ne sont alors pas plats, le carbone 2 et 3
étant exclus du plan.
C3 endo : du même côté que le carbone 5
C3 exo : à l’opposé du carbone 5
Le sucre peut avoir une autre configuration avec le C2, également endo ou exo.
On les numérote en ‘’ lorsqu’ils ont une liaison avec la base, pour ne pas les confondre avec les
sucres non reliés. Il y a une liaison N-glycosidique entre la base et le sucre.
C. Les nucléotides
C’est un nucléoside phosphorylé (base + pentose + groupements phosphates).
Nucléoside monophosphate : Le groupement phosphate sera présent sur le carbone 5’ (liaison 5’-
phosphoester). Un nucléotide à pH physiologique est chargé négativement.
Nucléoside triphosphate : liaison anhydride d’acide. Le phosphate le plus proche du carbone est dit
α, puis β, puis gamma.
On peut également avec des réactions intramoléculaires qui forment de l’ALP cyclique.
D. Le polymère d’ADN simple brin : représentations conventionnelles
Les brins d’ADN/ARN sont orientés, de 5’ vers 3’. Le lien entre deux nucléotides est entre le
phosphate et le 3’ du suivent : deux liaisons phosphoester. Elles sont appelées liaisons ou ponts
phosphodiester. On obtient ainsi une extrémité 5’phosphate et 3’OH libre. Le groupement phosphate
réagit à l’extrémité 3’.
La lecture va de 5’ phosphate à gauche vers 3’OH à droite. Dans l’ADN, il y a autant de charges
négatives que de nucléotides.
Loi de Beer-Lambert
Absorbance proportionnelle à la concentration des espèces de la solution et à la longueur du trajet
parcouru. Les doubles liaisons conjuguées dans les hétérocycles peuvent absorber les UV donc une
partie de la lumière incidente.
On peut suivre la concentration des acides nucléiques ou leur état en solution.
Pic d’absorption : 260nm.
Le pic d’absorption des protéines est à 280nm, il faut donc faire attention. Si le rapport d’absorbance
est inférieur à 1.8, l’ADN n’est pas pur (il l’est entre 1.8 et 2). On peut également avoir une
contamination par les ARN par l’effet hyperchrome. Le coefficient d’extinction molaire dépend de la
capacité à absorber la lumière, donc une hélice β avec des hétérocycles stabilisés a des électrons
moins excitables, donc absorbent moins. Avec un ADN simple brin, les paires de bases sont moins
empilées et les électrons moins stabilisés : ils absorbent plus de lumière. Le passage d’un ADN double
à simple fait qu’il absorbe environ 40% de plus. L’ARN a alors un profil intermédiaire avec quelques
régions d’appariement bien qu’il soit monocaténaire.
B. Le phénomène de dénaturation
On peut suivre la structure de l’ADN en fonction de son absorbance. La dénaturation est la perte de
la structure tridimensionnelle, sans perturber la structure primaire. La température, les conditions
alcalines ou certaines molécules bloqueuses de liaisons hydrogènes peuvent dénaturer l’ADN. C’est
cependant un phénomène réversible, et former une hybridation.
On obtient des plateaux à chaque extrémité de la dénaturation, avec une différence d’absorbance de
40%. On peut déterminer le Tm (température de demi-dénaturation) spécifique de la séquence
d’ADN étudiée. Il suffit de prendre le point d’inflexion pour obtenir une température de fusion ou Tm
en la divisant par deux (50% dénaturé, 50% sous forme de double hélice). C’est un processus
coopératif, qui se propage à un ensemble. La transition est alors extrêmement rapide.
Les facteurs influençant la Tm :
- le nombre de liaisons hydrogène (% en G+C). Pour 1% de G+C, on augmente le Tm de 0.4°C.
- la concentration en sel mais surtout en ion sodium Na+. En effet, ils neutralisent les charges
négatives des phosphates. Les charges négatives se repoussent alors et l’ADN se dénature.
- la taille de la molécule qui influe sur le nombre de liaisons hydrogènes. Cet effet est vrai jusqu’à 200
nucléotides.
Tm = (A+T)*2 + (G+C)*4 (pour les petits oligonucléotides)
C. Le phénomène de renaturation
Deux simples brins peuvent former un brin bicaténaire lorsqu’ils sont complémentaires l’un de
l’autre.
On peut hybrider une grande molécule d’ADN avec une petite, mais aussi des ADN humains avec des
ADN de singes. Si on dégrade un ADN, on ne peut pas revenir en arrière ! Ce n’est pas pareil que la
dénaturation.
D. Hydrolyse du squelette « sucre-phosphate » : les nucléases
Il en existe différents types qui dépendent de leur mode d’attaque, de leur spécificité (DNases,
RNases, etc).
- exonucléases : elles coupent par les extrémités. Par l’extrémité 5’ ou 3’ : elles la reconnaissent, s’y
fixent et coupent les ponts phosphodiester séquentiellement.
- endonucléases : elles coupent par l’intérieur en reconnaissant des séquences spécifiques ou en se
fixant n’importe où. Des extrémités 5’phosphate et 3’OH sont générées. On en a plusieurs types : les
enzymes de restriction spécifiques ou les DNases.
C. Les plasmides
Définition et propriétés des plasmides naturels et des plasmides vecteurs
ADN double brin circulaire, extra chromosomique.
- réplication autonome dans la bactérie, possède sa propre origine de réplication et avec un nombre
de copies variable en fonction du type de plasmides.
- porteur d’au moins un gène non essentiel à la bactérie hôte mais conférant à la bactérie une
propriété particulière (ex : résistance aux antibiotiques). C’est ce pour quoi ils ont été conservés au
cours de l’évolution et sont la cause de la multirésistance aux antibiotiques (peut aller jusqu’à 10).
Peut permettre à la bactérie de s’adapter à certains milieux (utiliser les métaux lourds par exemple).
Ces plasmides passent d’une cellule à une autre par la transformation.
Historique : Dans les années 1970, ils commencent à être utilisés et modifiés. C’est grâce aux
plasmides qu’on a pu commencer à faire des clones. ADN existant naturellement dans la bactérie et
modifiables au laboratoire.
Application : utilisés comme vecteur (plasmides vecteurs) de fragments d’ADN isolé pour
l’amplification et la purification d’un caractère. On peut ainsi obtenir 15 à 20 copies du même
plasmide dans une cellule.
Sur chaque plasmide sont situés dans sites d’enzymes de restriction, qui présentent un site unique
(utilisé pour cloner). Par exemple, on peut linéariser un plasmide qui était circulaire grâce à une
enzyme de restriction aux extrémités cohésives, puis couper l’ADN d’une cellule quelconque avec la
même enzyme. On peut ainsi mélanger les fragments obtenus qui vont s’hybrider avec le plasmide
coupé. On place ensuite le plasmide modifié dans une bactérie.
Chromatine et chromosomes
La chromatine prend deux formes distinctes : euchromatine (claire) et hétérochromatine (très
dense). Le niveau maximum de compaction de l’ADN est le chromosome qui peut être observé en
mitose. L’ADN est donc condensé.
Le premier niveau de compaction se fait grâce aux histones pour former une structure en « collier de
perle ». Un cylindre est composé de 8 histones (H2A, H2B, H3 et H4 en double). Autour se placent
146 paires de bases. L’octamère d’histones et l’ADN enroulés forment le nucléosome (ADN chargé
négativement et les histones chargées positivement).
Niveau supplémentaire : une fibre de 30nm, un solénoide forme du nucléosome. Une autre histone
entre en jeu : l’histone H1. L’ADN forme des boucles sur la matrice nucléaire et forme une structure
tridimentionnelle qui permet une compaction plus importante. Ces boucles vont elles-mêmes
s’enrouler en superhélice qui constituant le bras du chromosome.