11.02.

2016

Les protéines
I. Généralités
Le mot protéines signifie essentiel, et qualifie des molécules indispensables à la vie.

Importance biologique des protéines

Importance quantitative, 60% du poids sec des cellules et qualitative, participation à toutes les
fonctions cellulaires.
Protection (anticorps)
Régulation (insuline)
Organisation (protéines du cytosquelette)
Transport (hémoglobine)
Energie (stockage, ferritine)
Influx nerveux (récepteurs synaptiques)
Enzymes (digestion)
Structure (kératine)
Signalisations (récepteurs hormonaux)

Classification des protéines

* Taille :
- Peptide/oligopeptide : quelques acides aminés
- polypeptide : < 50 acides aminés
- protéines : > 50 acides aminés
Titine  (élasticité du muscle) : plus grosse protéine caractérisée. Environ 30 000 acides aminés, plus
de 3 000 000 Da de masse moléculaire et 1micromètre de long.
* Composition :
- holoprotéines (acides aminés)
- hétéroprotéines (acides aminés + partie non protéique)
* Forme :
- protéines fibreuses : filiformes, présentes pour assurer la structure (kératine, collagène)
- protéines globulaires : sphé-protéines structurales (peau, roïdes, enzymes, transporteurs, tendons,
os …)

Composition des protéines

Unités monomériques (acides aminés) liées par des liaisons covalentes entrainant des contraintes
structurales :
- la liaison peptidique
- le pont disulfure
Ces unités sont également liées par des liaisons faibles (ioniques, hydrogène) essentielles pour la
flexibilité de la protéine et sa fonction.
Structure des protéines
Primaire : séquence en acides aminés
Secondaire : repliement local de la chaine principale, avec deux grands types : l’hélice α et le feuillet
β.
Tertiaire : structure tridimensionnelle
Quaternaire : association de plusieurs chaines polypeptidiques

II. Structure primaire

A. Nomenclature et composition en acides aminés
Nomenclature
Orientation : de l’amine au carboxyle
Code à 1 lettre :
On peut procéder à un alignement de la structure primaire afin de comparer les séquences
protéiques chez différentes espèces.

Si l’ordre d’un enchainement est inconnu : V (S,T,Y) G R

Si une identification précise est impossible :
- B pour aspartate (D) ou asparagine (N)
- Z pour glutamate (E) ou glutamine (Q)

Composition en acides aminés

Combien de chaque acide aminé ? On doit ainsi rompre les liaisons peptiques afin de dissocier
chaque acide aminé.
* Hydrolyse acide :
- 24h, HCl à 6mol.L-1, 110°C
- hydrolyse des liaisons peptidiques
- séparation du mélange d’acides aminés et quantification
* Quantification :
- nombre de mole(s) de l’acide aminé nx = m/M
- nombre de mole(s) de protéines np = m/M
- nombre de résidus de l’acide aminé x = nx/np
Inconvénients :
- destruction des tryptophanes : dosage préalable, hydrolyse alcaline, protection
- désamination de N en D et Q en E, détermination de B et Z
- oxydation et destruction partielle des cystéines, protection possible par l’acide performique

B. Séquençage N et C terminal
Dans quel ordre ?
Première protéine séquencée en 1953 par Sanger, l’insuline est constituée de 51 résidus d’acides
aminés répartis en deux chaines.
Etapes préalables au séquençage :
- séparation des possibles sous-unités
- réduction des ponts disulfure inter/intra chaînes
- alkylation des cystéines

Marquage des extrémités

Identification uniquement de l’acide aminé N-terminal par marquage du groupement α-aminé libre
avec le réactif de Sanger (DNFB) et libération du DNP-acide aminé de couleur jaune.
Identification uniquement de l’acide aminé C-terminal par hydrazinolyse, une méthode chimique de
« non-marquage » de l’acide aminé C-terminal.

Séquençage N-terminal par dégradation d’Edman

Identification récurrente de l’acide aminé N-terminal :
- méthode automatisée
- méthode récurrente (<70cycles)
- rendements <100%

Séquençage C-terminal
Identification « récurrente » de l’acide aminé C-terminal par l’emploi d’exocarboxypeptidases. Elles
hydrolyses la liaison peptidique à partir du C-terminal.

Séquençage N-terminal
Limitations :
- Blocage en position N-terminale (60 à 90% des protéines) par une modification chimique,
l’acétylation
- grande taille des protéines à séquencer
Stratégie :
- hydrolyse interne : enzymatique ou chimique
- séquençage des peptides libérés

C. Hydrolyse spécifique des chaînes polypeptidiques

- Hydrolyse chimique par le bromure de cyanogène (BrCN) du côté C-terminal des méthionines. On
libère ainsi plusieurs fragments, car hydrolyse de la liaison peptidique entre la méthionine et l’acide
aminé n+1. Il y a libération d’une homosérine.
- Hydrolyse enzymatique catalysée par des endoprotéases : au niveau des acides aminés basiques
comme l’arginine ou la lysine, sauf s’il y a présence d’une proline en n+1.

Séparation des fragments de protéolyse

Mêmes techniques que pour la séparation d’acides aminés :
- électrophorèse : charge nette
- chromatographie sur couche mince : hydrophobie
- finger-print : charge nette + hydrophobie
- chromatographie échangeuses d’ions : charge
- phase inverse en système HPLC : hydrophobie
Chaque peptide a une propriété qui l’emporte sur une autre, on peut donc les séparer de la même
façon.

Séquençage automatique des peptides isolés :

- dégradation d’Edman
- spectrométrie de masse
Chevauchement des peptides générés par au moins deux protéases ou par une protéase et une
hydrolyse chimique. Par exemple :
- protéine protéolysée avec le bromure de cyanogène et la trypsine
- séparation des fragments
- séquençage des fragments -> reconstitution de la structure primaire

Peptides obtenus avec le bromure de cyanogène  :

* CNBr1 : GAKLPM / CNBr2 : FWM / CNBr3 : DGRCAKPK
Peptides obtenus par l’action de la trypsine  :
* Tryp 1 : LPMDGR / Tryp2 : CAKPK / Tryp 3 : FWMGAK
Reconstitution de la séquence primaire :
FWMGAK-LPMDGR-CAKPK

III. Structure secondaire

A. La liaison peptidique

Réaction entre le carboxyle et la fonction amine, liaison amide réalisée avec libération d’une
molécule d’eau. Elle ne se trouve ni dans l’ADN ni dans l’ARN.
La succession d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques forme un squelette à partir duquel
se projettent les chaînes latérales R. La liaison peptidique est plane et rigide, avec un caractère de
double liaison partielle, à cause de l’oxygène et de l’azote qui créent un dipôle (délocalisation
électronique). La rotation est restreinte autour de la liaison peptidique C-N d’où l’existence des
configurations trans et cis. La configuration trans est la forme favorisée car thermodynamiquement la
plus favorable (encombrement stérique pour la forme cis).
La longueur des liaisons interatomiques et les angles formés par ces liaisons sont quasiment les
mêmes dans l’ensemble des unités de toutes les protéines (procaryotes vs eucaryotes, animales vs
végétales).

Quelques valeurs numériques :

- longueur liaison peptidique : 1.33 A
- longueur C – C : 1.51 A
- longueur C – N : 1.46 A
- longueur C = C : 1.26 A
Angles de rotation autour des liaisons : grande liberté de rotation au niveau des angles phi et psi,
alors que celle au niveau de l’angle w est très faible.

Les liaisons N-Ca et Ca-C qui lient entre elles les unités peptidiques rigides sont des liaisons simples à
la rotation très libre. Conformation la plus étendue => la valeur des trois angles est égale à environ
180°. Voir Kevin Ahern (Oregon State University)
L’angle est positif si le plan arrière tourne vers la droite et négatif dans le cas contraire. L’angle de la
liaison peptidique w est constamment voisin de 180° du fait de la configuration trans adoptée par
cette liaison.
Les angles phi et psy : variation théorique entre 180° et – 180°, mais l’existence de restrictions
stériques limite les valeurs adoptables. Par exemple, la conformation où les deux angles prendraient
la valeur de 0° n’est pas possible car l’oxygène du groupement carboxyle n-1 et l’hydrogène du
groupement amine n+1 se recouvriraient.

Les combinaisons possibles des angles phi et psy

Le diagramme de Ramachandran avec l’exemple d’un polypeptide poly-L-Alanine :
B. Les modules structuraux élémentaires
Les liaisons hydrogène relient les groupements CO et NH de différentes liaisons peptidiques. Les
liaisons se font tous les 3.4 acides aminés. Vue du dessous, les chaines latérales pointent vers
l’extérieur, et les atomes de la chaine principale de la chaine principale sont en réalité plus
volumineux et remplissent totalement l’espace à l’intérieur de l’hélice.

Les propriétés physico-chimiques dépendent de la nature chimique des chaînes latérales qui se
projettent à l’extérieur, visualisation dans une représentation en roue hélicoïdale.
- radicaux polaires, hélice « hydrophile »
- radicaux apolaires, hélice « hydrophobe »
- alternance régulière de radicaux polaires et apolaires, hélice amphiphile avec une face
« hydrophile » et une face « hydrophobe ».

La formation et/ou la stabilité d’une hélice α est affectée par :

- la propension de chaque acide aminé à former une hélice α
- les interactions entre les chaines latérales
- la taille de la chaîne latérale
- la présence de proline (casseur d’hélice)

Les différents types d’hélices

Le feuiller β
Brin β : 5 à 10 résidus en conformation presque totalement étendue. Liaisons hydrogènes entre CO
et NH des brins voisins.
Formation par association latérale de plusieurs brins β via des liaisons hydrogène entre l’oxygène du
groupement carboxylique d’un premier brin et l’hydrogène d’un groupement amine d’un deuxième
brin (et vice versa). Association pouvant être parallèle, antiparallèle ou mixte.
Un feuillet est caractérisé par la présence de paires (ou plus) de brins.

Le feuillet β parallèle
Espacements réguliers et obliques des liaisons hydrogène par rapport aux liaisons covalentes
impliquant les groupements liés.
Le feuillet β antiparallèle
Organisation colinéaire des liaisons hydrogène par paire régulièrement distante, disposition
énergétiquement plus favorable car minimisant des distorsions.

Le feuillet β plissé
Obtention de feuillets β plissés dont les carbones α et les radicaux R sont situés aux sommets,
alternant au-dessus et en dessus du plan du feuillet.

Le feuillet β étendu
Plusieurs chaines s’associent pour donner des feuillets étendus qui ne sont pas plan mais présentent
une légère torsion droite des brins β.

 Permet à la protéine d’acquérir localement une structure.

Le coude β (β turn)
Structure constituée de peu de résidus (3 ou 4) permettant un rapide changement d’orientation
atteignant 180°. Très souvent présente à la surface des protéines globulaires, notamment au niveau
des feuillets β antiparallèles. Contenant de nombreux résidus glycine et/ou proline, ces derniers
étant souvent en configuration cis.

Les boucles
Les structures secondaires sont souvent séparées par des boucles. Présentes à la surface des
protéines, elles peuvent faire partie de motifs supersecondaires. Elles correspondent souvent à des
sites de reconnaissance pour les protéines, de fixation du ligand et d’interaction membranaire.
Modules plus longs que les coudes β (contiennent plus de motifs).
C. Les structures supersecondaires ou motifs
Organisées autour de la combinaison simple de quelques éléments de structure secondaire qui sont
voisins dans la séquence primaire.
Motif = arrangement de
à éléments de structure secondaire
Domaine = repliement de plusieurs motifs dans l’espace.
Motif αα avec le motif « Hélice-Tour-Hélice » ou « Hélice-coude-Hélice », et « Hélice-Boucle-Hélice »
Motif « Leucine zipper » constitué par l’homo ou l’hétérodimérisation de deux hélices « zipper » qui
interagissent via des leucines disposées tous les sept résidus. Il y a une fixation symétrique des
hélices dans le grand sillon de l’ADN.

Motif caractérisés par la présence de feuillets β 

Motif β β 
- en épingle à cheveux (inhibiteur de la trypsine bovine et erabutoxine).
- en clé grecque : au total cinq feuillets β reliés par des coudes ou des boucles

Motif mixte avec le motif β α β

L’hélice α, dont l’axe est à peu près parallèle à celui des brins β, est « plaquée » le long des deux
brins, protégeant leurs résidus hydrophobes du solvant aqueux.

D. Méthodologie pour l’étude de la structure secondaire

Spectroscopie par dichroisme circulaire
Technique basée sur la propriété qu’ont les protéines d’absorber de façon inégale la lumière
polarisée circulaire vers la gauche ou circulaire vers la droite. Le deltaE en fonction de lambda donne
le spectre de dichroisme circulaire.
IV. Structure tertiaire
A. Architecture des protéines fibreuses
Concerne des protéines de structure (cheveux, collagène, myoglobine).

Structure particulière pour assurer la solidité. Présence de filaments, formés de protofilaments, eux-
mêmes formés de deux hélices α enroulées. Les deux hélices s’associent grâce à des liaisons
covalentes entre cystéines.

Exemple : le collagène. C’est une chaine α, qui n’est pas à proprement parler une hélice α. En effet,
c’est une hélice gauche (alors qu’α est une hélice droite). Ces deux chaines s’associent pour former
une hélice droite. Les prolines cassent l’orientation et permettent la courbure de l’hélice. On trouve
donc une hydroxyproline qui stabilise la chaine.

Exemple de la fibroïne : superstructure en feuillets β antiparallèles plissés avec la présence d’une

courte séquence répétée une cinquantaine de fois par molécule. Localisation des glycines du motif
répété huit fois du même côté de l’axe du brin et localisation des sérines et alanines (R2, R4, R6)
l’autre côté.

B. Diversité des protéines globulaires

Des caractéristiques communes :
- un aspect compact
- des résidus hydrophobes formant le cœur hydrophobe de la protéine
- présence en surface, au contact de l’eau, d’acides aminés hydrophiles ou neutres
- stabilisation de la structure protéique par des liaisons faibles de type liaison hydrogène et ionique
Exemple de la myoglobine : elle a un groupement prosthétique (hème), donc une molécule
organique mais non protéique. Il présente au centre un atome de fer. Elle est essentiellement
composée d’hélices α reliées par des coudes ou des boucles.
- Proportion approximative d’hélice α et de conformation β dans des protéines constituées d’une
seule chaine polypeptidique

Les domaines :
- Repliement de la totalité ou d’une fraction de la chaine polypeptidique pour former une structure
tertiaire stable constituée de la combinaison variée d’éléments de structure secondaire et de motifs.
-> organisation d’une chaine polypeptidique en une suite de motifs simples successifs (domaines).
Il n’y a jamais de formation de « nœud » car le processus de repliement est contrôlé.
Deux principaux critères définissent les domaines :
- un premier, uniquement structural, fait correspondre le domaine à une partie d’une chaine
polypeptidique pouvant se replier indépendamment en une structure tertiaire stable et séparable du
reste de la protéine par protéolyse ménagée.
- le deuxième, purement fonctionnel, recouvre sous le terme de domaine une région de la protéine
ayant une fonction bien précise.

Classement des domaines d’après leur contenu en structures secondaires et la répartition de ces
dernières :
- les domaines α exclusivement constitués d’hélices α
- les domaines β formé principalement de feuillets β
- les domaines α/β
Les domaines α
60% des résidus sont dans une structure d’hélices α qui sont en contact, comme dans la famille des
globines qui possèdent des paires d’hélices arrangées orthogonalement.
Les domaines structuraux β
Comme dans la porine qui possède des domaines variables des immunoglobulines qui s’assemblent
en tonneau β, les différents brins antiparallèles étant réunis par des tournants β ou des boucles.

Les domaines structuraux α/β, le motif β-α-β-α est répété quatre fois ou plus (association).

Les protéines globulaires

Les domaines structuraux α+β, exemple de la ribonucléase H où :
- les feuillets β et les hélices α sont séparés
- les hélices α sont en interactions et regroupées et les feuillets β tendent à être antiparallèles ou
mixtes (même chaine polypeptidique mais structure 3D qui fait un effet de deux entités différentes).

C. Méthodologie pour l’étude de la structure tertiaire

- La cristallographie aux rayons X qui nécessite de cristalliser la protéine.
- La résonnance magnétique nucléaire (RMN) qui fournit les distances interatomiques de protons
spécifiques distants de moins de 5 A dans une protéine de séquence connue.

V. Structure quaternaire
Association de plusieurs chaines polypeptidiques ayant déjà acquis leur structure tertiaire définitive.
- sous unités identiques (homodimère, homotrimère, homopolymère) ou différents (hétérodimère,
hétérotrimère …).
Protéines hétéromériques, désignation des différentes chaines polypeptidiques par des lettres avec,
en indice, le chiffre indiquant la stoechiométrie de la sous-unité :
- alphabeta (tubuline) : hétérodimère constitué d’une chaine α et d’une chaine β
- alpha2beta2 (hémoglobine) : hétérotétramère avec deux chaines α et deux chaines β
- R6C6 (aspartate, transcarbamylase) : hétérododécamère de six chaines R et six chaines C
Chaines individuelles : entités structurales indépendantes interagissant entre-elles par des liaisons
faibles (liaison hydrogène, liaison ionique, liaison polaire, liaison hydrohpobe) ou covalentes (ponts
disulfure)
Structure quaternaire : « ordre supérieur » de structure qui confère à la protéine l’ensemble de ses
propriétés biologiques ».
- interaction entre sous-unités, exemple d’un hétérodimère de tubuline ou d’un hétérotétramère
d’hémoglobine

Dénaturation d’une protéine : on enlève toutes les structures, elle n’a plus de forme. Ajout d’un ajout
réducteur qui enlève les fonctions de la protéine. Lorsqu’on la repasse dans un tampon adapté, la
protéine retrouve sa conformation initiale. On peut ainsi en déduire que le simple fait d’avoir une
structure primaire donne toutes les informations pour acquérir une structure secondaire puis
tertiaire.
Protéine native : protéine qui a acquis sa structure pour être fonctionnelle. A opposer avec une
protéine dénaturée. Pour explorer toutes les conformations possibles il faudrait 10^27 années, alors
qu’une protéine ne prend que quelques secondes.

On peut représenter l’acquisition d’un état natif d’une protéine par représentation schématique d’un
entonnoir de repliement : l’acquisition de l’état natif d’une protéine nécessite un contrôle
thermodynamique et cinétique. C’est un processus exergonique et qui va engendrer l’acquisition
d’une seule structure correspondant à une seule protéine native.

Deux hypothèses pour expliquer cette acquisition :

- hiérarchisation dans les structures : secondaires, supersecondaires, tertiaires, quaternaires
- effondrement hydrophobe : association des structures hydrophobes entre elles
Ces deux fonctions donnent à la protéine sont état natif. L’ensemble constitue le repliement des
protéines.

Certaines protéines ont besoin de protéines auxiliaires : les protéines chaperons ou chaperonnes.
Elles aident à acquérir l’état natif. De nombreuses pathologies y sont liées.
En absence de chaperon, il y a formation d’un agrégat protéique ce qui empêche la protéine
d’acquérir sa structure. En présence de chaperon, ils s’associent à la protéine en formation pour
empêcher cela.
Qu’est-ce qui peut empêcher le bon repliement des protéines ? Quelle dénaturation ?
- La température : plus on augmente la température, plus la fraction protéique mal repliée est
importante. La température rompt les liaisons hydrogène qui sont à la base de la structure
secondaire. Exemple : l’albumine chauffée passe de l’état liquide à solide (car formation de ponts
dissulfures), comme dans le blanc d’œuf.

- Le pH : modification des états d’ionisation des chaines latérales d’acides aminés, donc changement
de la répartition des charges de la protéine. Cela induit des changements dans les liaisons
électrostatiques et donc une dénaturation.

- Les solvants organiques : rupture des liaisons hydrogène entre résidus car compétition alcool/acides
aminés, et donc dénaturation.

- Les détergents : SDS (électrophorèse SDS-PAGE, qui présente deux parties : hydrophobe et
hydrophile. Comme le SDS est chargé négativement, double effet : dénaturation et charge négative)
et Urée (formation de liaisons hydrogène au niveau du carbonyle). Il y a des interactions
hydrophobes avec le squelette de la protéine et les chaînes latérales des résidus d’acides aminés,
formation d’un complexe protéine-détergent ionisé en surface.
- Les agents réducteurs : le DTT par exemple. Ils rompent les ponts disulfures entre deux cystéines ce
qui change la structure de la protéine.

VI. Modifications post-traductionnelles des protéines

Lorsque les protéines sortent du ribosome, elles peuvent être modifiées (glycosylation,
phosphorylation).
- l’hydrolyse de la chaîne polypeptidique : exemple de l’insuline qui subit un certain nombre de
clivages grâce à des protéases. Enlèvement du peptide signal, oxydation qui se fait au niveau des
cystéines au niveau des ponts disulfures, puis de nouveau des protéases qui sépare deux chaines. La
pré-pro-insuline devient ainsi l’insuline.

- l’hydrolyse de la chaîne polypeptidique : exemple de deux nonapeptides d’une importance

physiologique très élevée : la vasopressine et l’ocytocine (provoque les contractions lors de
l’accouchement, ). Leurs pré-pro-protéines subissent l’action de protéases pour le devenir.
- Modification N-terminale, l’hydrolyse de la méthionine initiatrice : les protéines commencent
toutes par la méthionine, mais seulement 50% l’ont dans leur forme définitive, car il y a hydrolyse
pour les autres en N-terminal.

- Modification N-terminale, l’acétylation de la fonction α-aminé de l’acide aminé en position 1 :

présente dans de nombreuses protéines (60%).

- Phosphorylation de la chaine latérale de la sérine (S), de la thréonine (T) et de la tyrosine (Y).

Implication de la phosphorylation protéique dans : la régulation de l’activité des protéines (ex : dans
le cycle cellulaire, les cyclines-cdk). Elle se fait donc grâce aux enzymes kinases qui ont des activité
catalytiques.
Les principales modifications co et post traductionnelles :
- hydrolyse de la méthionine N-terminale
- acétylation du groupement amine du résidu N-terminal
- (dé)phosphorylation des S, T et Y
- N- et O-glycosylations de N et de S
- hydroxylation
- addition de lipides (par exemple pour l’ancrage membranaire)
- acétylation de la chaine latérale de K
- méthylation
- maturation co ou post traductionnelle des précurseurs
- transport intracellulaire co ou post traductionnel

Méthodes de détection des protéines et leurs modifications post-traductionnelles

- L’électrophorèse : déplacement de molécules chargées sous l’effet d’un champ électrique : sous
forme native ou dénaturée. C’est fait grâce à un gel mélange d’acrylamide et de polyacrylamide.
Si elle se fait en conditions natives on préserve la charge et la structure, et en conditions
dénaturantes toutes les protéines ont la même charge.
- L’élèctrophorèse bidimensionnelle, fractionnement des molécules amphotères, se comportant à la
fois comme un acide et comme une base, reposant sur une séparation selon leur point iso-électrique
dans un gel contenant un gradient de pH. Méthode permettant de séparer des protéines dont le
point isoélectrique diffère de moins de 0.01 unité pH dans des conditions dénaturantes non ioniques
et/ou réductrices. Première étape d’électrofocalisation et deuxième étape de SDS-PAGE : séparation
suivant la masse. Après révélation, les protéines apparaissent sous la forme de spots (ou taches) la
bande de première dimension étant modifiée lors de la deuxième migration.

- L’immunodétection ou Western blot :

- La spectrométrie de masse : détermination de la masse moléculaire d’une protéine par mesure de
sa masse réelle à moins d’un dalton près mais avec une limite de taille des protéines analysables.
Seule cette technique peut donner la vraie masse moléculaire et non pas une masse moléculaire
apparente. Détermination des modifications post-traductionnelles des protéines par comparaison de
la masse des protéines modifiées et non modifiées. Un spectromètre de masse est constitué des
éléments suivants :
* une source d’ionisation
* une interface
* un analyseur qui a pour fonction de trier les ions en fonction de leur masse, plus spécifiquement en
fonction de leur rapport masse/Charge (m/z)
* un détecteur qui fournit un signal électrique proportionnel au nombre d’ions détectés
Pourquoi l’étude des protéines ?
La fonction d’une cellule est guidée par les protéines exprimées. Pour étudier la fonction d’une
protéine, il faut d’abord isoler la protéine d’intérêt par purification, puis analyser sa séquence en
acides aminés, analyser ses structures IIaires, IIIaires et IVaires, et enfin tester son activité.

Purification d’une protéine

- Choix du matériel biologique de départ : cellules, tissus …
- Solubilisation de la protéine : chromatographie
- Conditions expérimentales : dégradation des protéines, ajout d’inhibiteurs de protéases, travail à
4°C.
On travaille sur un extrait brut que l’on va enrichir.
Les protéines natives sont généralement solubles dans l’eau grâce aux chaines latérales polaires des
acides aminés en interaction avec le solvant. Cependant, deux facteurs importants permettent de
faire varier la solubilité des protéines : le pH et la force ionique. Exemple du sel, plus on augmente la
concentration dans le tampon plus la protéine devient insoluble.

Elimination du sel en excès par dialyse du surnageant ou du culot en solution : dialyse.

La fraction enrichie de la protéine d’intérêt est prête. Le fractionnement des composés copurifiés va
pouvoir être réalisé.

Les différents types de chromatographie :

- d’exclusion
- échangeuse d’ions
- d’absorption
- d’affinité

La technique est basée sur les propriétés physico-chimiques des protéines. Purification des protéines
sur la base de leur taille, de leur charge, de leur hydrophobie ou encore de leur affinité de liaison
avec un partenaire.
Séparation des protéines selon deux critères : leur taille et leur forme ; c’est la chromatographie
d’exclusion. Séparation d’un mélange de protéines de taille variable, comme dans un tamis.
Détermination des paramètres :
- volume mort (Vo) volume de tampon « hors billes »
- volume total (V1) volume de tampon entre les billes et dans les billes
- volume d’élution (Ve) volume de tampon correspondant à la sortie des protéines d’intérêt.
La chromatographie d’affinité
Le critère de séparation est la propriété de liaison de la protéine d’intérêt. Greffage (covalent) d’une
molécule reconnue spécifiquement par la protéine d’intérêt sur un support solide (polyacrylamide,
cellulose …), grande variabilité de la nature chimique du partenaire spécifique. Pour récupérer la
protéine, on l’élue en mettant un compétiteur qui va permettre à notre protéine d’intérêt de s’y fixer
et donc d’être éluée (compétition entre le ligand dans le tampon d’élution et celui greffé).

Notions de purification et de rendement

Méthode de dosage et de détection

Methode de Bradford au bleu de Coomassie : absorption du bleu qui réagit avec les acides aminés
basiques ou hydrophobes, déplacement du pic d’absorbance du rouge-marron au bleu.

Les protéines assurent un grand nbr de fonctions diverses et certaines ont pour role de catalyser des
réactions chimiques -> les enzymes !